Policetídeos isolados de Penicillium herquei

 

Polyketides isolated from Penicillim herquei

 

 

Andrey Moacir do Rosario Marinho^{I, *}; Patrícia Santana Barbosa Marinho^I; Edson Rodrigues Filho^II; Izabel Cristina Piloto Ferreira^III

^IFaculdade de Química – Universidade Federal do Pará, 66075-970, Belém – PA, Brasil
^IIDepartamento de Química – Universidade Federal de São Carlos, 13565-905, São Carlos – SP, Brasil
^IIIDepartamento de Análises Clinicas – Universidade Estadual de Maringá, 87020-900 – Maringá – PR, Brasil

 

 

---

RESUMO

Neste trabalho estamos portando o isolamento dos policetídeos citreoserina (1), emodina (2), janthinona (3), dihidrocitrinona (4) e citrinina H-1 (5). Os compostos foram isolados por procedimentos cromatográficos e identificados por métodos espectrais de RMN 1D e 2D e EM. Os compostos 1, 2 e 3 foram testados sobre promastigotas de Leishmania brasiliensis.

Palavras chaves: policetídeos, penicillium, atividade leishmanicida

---

ABSTRACT

In this work we are reporting the isolation of polyketides citreoserine (1), emodin (2), janthinone (3), dihydrocitrinone (4) and citrinin H-1 (5). The compounds were isolated by chromatographic procedures and identified by spectral methods of NMR 1D and 2D and MS. The compounds 1, 2 and 3 were tested against promastigotes of Leishmania brasiliensis.

Key Words: polyketides, penicillium, leishmanidal activity.

---

 

 

INTRODUÇÃO

A busca de substâncias com atividades biológicas úteis ao homem é um dos campos mais estudados na ciência como um todo, seja em nível acadêmico como até mesmo em indústrias farmacêuticas, agroquímicas, entre outras. Existe sempre a necessidade de se renovar o arsenal de compostos ativos, devido os parasitas adquirir resistência as drogas já existentes no mercado e também devido ao aparecimento de novas doenças.

Os fungos são bons produtores de metabólitos secundários, muitos com atividade biológica útil [1-4]. Os fungos endofíticos geralmente produzem substâncias com alguma atividade biológica, onde estas podem ajudar a planta hospedeira no combate a infestações por outros fungos, vírus e bactérias [5,6]. Por esta razão é de grande importância o estudo das atividades biológicas de substâncias produzidas por fungos endofíticos.

Neste trabalho estamos reportando o isolamento de cinco policetídeos dos extratos de P. herquei as antraquinonas citreoroseina (1), emodina (2) e janthinona (3), diidrocitrinona (4) e citrinina H-1 (5). Foram ainda realizados ensaios leihmanicidas com as substâncias 1, 2 e 3 frente as formas promastigota de Leishmania brasiliensis.

 

MATERIAS E MÉTODOS

Procedimentos Gerais

O espectro de IV foi medido em um espectrofotômetro BOMEN MB-102 em pastilha de KBr. Os dados de APCIMS foram adquiridos no modo negativo usando um instrumento MICROMASS QUATTRO-LC equipado com uma fonte de íons ESI/APCI do tipo "Z-spray". Os experimentos de RMN ¹H e ¹³C foram obtidos em um espectrômetro BRUKER DRX-400 em CDCl₃ com TMS como padrão interno.

Micro-organismo

P. herquei foi obtido de uma coleção do Laboratório de Bioquímica Micromolecular de Micro-organismos do Departamento de Química da Universidade Federal de São Carlos. Esta coleção contém isolados de Melia azedarach [7].

Cultura de P. herquei em arroz e isolamento dos policetídeos.

Quarenta e cinco fracos de Erlenmeyer (500 mL), contendo 90g de arroz ("Uncle Been's") e 75 mL de água destilada por frasco, foram autoclavados por 45 min a 121 ºC. Pequenos cubos de meio BDA contendo o micélio de P. herquei foram adicionados em 42 frascos de Erlenmeyer sob condição estéril. Três frascos foram utilizados como controle. Após 20 dias de crescimento a 25 ºC a biomassa obtida foi macerada com diclorometano, acetato de etila e metanol. Da fase diclorometânica, após sucessivos fracionamentos em coluna cromatográfica de sílica gel eluída com hexano, acetona e metanol, em gradiente de polaridade, foram obtidos os policetídeos citreoroseina (1), emodina (2), janthinona (3), diidricitrinona (4) e citrinina H-1 (5).

Ensaio leishmanicida

Cultura e manutenção do parasita

Formas promastigota de Leishmania viannia braziliensis MHOM/BR1987/M11272 foram cultivadas a 25 ºC em meio Schneider's Drosophila suplementado com 10 % de soro bovino fetal (FCS). Células foram coletadas na fase logarítmica, ressuspensas em meio fresco, contadas em câmara de Neubauer e a concentração ajustada par 4x10⁶ cel/mL.

Ensaio leishmanicida

O ensaio foi realizado in vitro com as formas promastigotas do parasita. As substâncias foram adicionadas nas culturas de promastigotas com 4x10⁶ cel/mL nas concentrações de 320 a 0,125 µg/mL solubilizados em DMSO e incubados a 25 ºC por 24 h. Após esse período os parasitas sobreviventes foram contados em câmara de Neubauer e comparados com controles, os quais continham somente DMSO. Isetionato de pentamidina (Eurofarma®) foi usado como fármaco controle. O valor da LD50/24 foi determinado pela analise de regressão linear do percentual de inibição com erro estatístico de 10%.

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Identificação dos policetídeos

As substâncias 1, 2 e 3 foram identificadas por análise dos espectros de RMN 1D e 2D, EM e por comparação com a literatura e mostraram total similaridade para os policetídeos citreoroseina (1), emodina (2) e janthinona (3) [8-10].

A substância 1 foi obtida na forma de cristais vermelhos através de cromatografia em coluna. Seu espectro de RMN ¹H apresentou sinais para sistema aromático com hidrogênios meta relacionados δ 6,67 (d, J = 2,0 Hz) e δ 7,27 (d, J = 2,0 Hz), δ 7,31 (sl) e δ 7,75 (sl), além de um sinal singleto em δ 4,78 (s, CH₂). O espectro de RMN ¹³C apresentou 15 sinais, sendo os δ 182,3 e δ 191,9 atribuídos as carbonilas C-9 e C-10 de antraquinonas. O espectro de massas ESI (-) apresentou um m/z 285 [M-H]^-, onde juntamente com os dados de RMN ¹H e ¹³C pode-se propor a fórmula molecular C₁₅H₁₀O₆ para 1. Através das correlações de HSQC e HMBC foi possível atribuir todos os sinais de RMN ¹H e ¹³C corretamente. Os dados de 1 são concordantes com os dados descritos na literatura para a citreoroseina [8]. As substâncias 1 e 2 foram identificas em um trabalho anterior [10].

A substância 4 apresenta um espectro de RMN ¹H muito parecido com o obtido para citrinina isolada anteriormente por nós [10]. Os dois dubletos para hidrogênios metílicos a δ 1,25 (J = 7,2 Hz) e 1,33 (J = 6,7 Hz), juntamente com o singleto a δ 2,06, e os dois quadupletos em δ 3.04 (J = 7.2 Hz) e 4,73 (J = 6.7 Hz) são as principais características vistas no espectro. No entanto, o sinal em δ 8,25 referente a H-1 da citrinina (6) não está presente neste espectro. Com auxílio dos dados de espectrometria de massas obtidos por ESI-MS/MS no modo negativo ([M-H]^- a m/z 265), e comparação com os dados relatados na literatura, concluiu-se que esse policetídeo é a diidrocitrinona (4) [11,12].

No espectro de RMN ¹H de S-5 foram observados quatro sinais referentes a dubletos de metila em δ 1,23 (d, J = 6,3 Hz), δ 1,30 (d, J = 7,2 Hz), δ 1,31 (d, J = 6,9 Hz) e δ 1,37 (d, J = 6,2 Hz). Também foram observados dois sinais singletos em δ 2,11 e δ 2,14. Além dos sinais referentes as metilas observaram-se ainda os sinais δ 2,94 (dq, J = 7,3 e 4,5 Hz), δ 3,19 (dq, J =10,1 e 7,2 Hz), δ 4,00 (dq, J = 6,3 e 4,5 Hz), δ 5,25 (s), δ 5,45 (dq, J = 10,1 e 6,2 Hz), δ 6,59 (s) e δ 7,94 (s). A comparação destes dados do espectro de massas APcI (-) m/z 425 [M-H]^- com observados no RMN ¹³C que apresentou sinais para 24 carbonos e alguns sinais com valores de deslocamento químico semelhantes para citrinina como δ 80,5 (C-3 da citrinina), δ 162,9 (valor próximo ao de C-1 da citrinina) e δ 185,7 (semelhante a carbonila C-6 da citrinina) nos levou a concluir que S-5 viesse a ser um dímero da citrinina. As correlações observadas no HMBC de H-1 com os carbonos C-4', C-5' e C-6' foram fundamentais para localizar o ponto de junção entre as duas unidades de citrinina, bem como a correlação observada no espectro de HMBC entre o hidrogênio a δ 7,94 (s, H-12') e o carbono a δ 73,2 (C-9'), estabelecendo a posição do grupo formiato no policetídeo, foram determinantes para identificação do policetídeo como citrinina H-1. Uma análise comparativa dos dados de RMN de ¹H e ¹³C com aqueles registrados na literatura ratificou essa proposta estrutural [13].

Ensaio leishmanicida

As substâncias foram adicionadas a culturas de promastigota de L. brasiliensis a 25ºC e os resultados obtidos após 24h foram comparados ao controle.

A substância 2 inibiu 50% dos parasitas a uma concentração de 320 µg/mL, mostrando um resultado promissor. Já as substâncias 1 e 3 inibiram cerca de 20% e 22% dos parasitas a uma concentração de 320 µg/mL, respectivamente. Parece que a hidroxilação da metila reduziu a atividade da substância 1 em mais de 50%. Os resultados obtidos nos ensaios leishmanicidas com as substâncias 1, 2 e 3 nos levam a sugerir que para a ocorrência de atividade as posições C-3 e C-6 devem estar uma oxidada e a outra reduzida, pois quando ambas as posições estão oxidadas ou reduzidas há um decréscimo significante na atividade apresentada.

 

CONCLUSÃO

As substâncias isoladas de P. herquei são pertencentes à classe dos policetídeos e estão de acordo com a rota biossintética do acetato que é a preferida pelos fungos. A substância 2 apresentou atividade leishmanicida moderado, já as substâncias 1 e 3 perderam metade da atividade quando comparadas a 1 demonstrando uma possível relação estrutura-atividade.

 

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Pará (FAPESPA), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES) pelo suporte financeiro.

 

REFERÊNCIAS

[1] Petrini, O.; Sieber, T. N.; Toti, L. & Viret, O. Naturl Toxis. 1 (1992), 185.         [ Links ]

[2] Jarvis, B. B. & Miller, J. D. "Natural Products, Complexity and Evolution" IN: Phytochemical Diversity and Redundancy in Ecological Interacions. Romeo et al. New York, Plenum Press. (1996), 265.         [ Links ]

[3] Li, J. Y.; Sidhu, R. S.; Ford, E.; Hess, W. M.; Strobel, G. A. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 20 (1998), 259.         [ Links ]

[4] Stierle, A.; Strobel, G.; Stierle, D.; Grothaus, P. And Bignami, G. J. Nat. Prod. 58(9) (1995), 1315.         [ Links ]

[5] Rizzo, I.; Varsavky, M.; Haidukowski, M.; Frade, H.; Toxicon. 35(5) (1997), 753.         [ Links ]

[6] Huang, E. X.; Huang, T. L.; Wildung, M. R.; Croteau, R., Scott, A. I.; Prot. Expr. Pur. 13 (1998), 90.         [ Links ]

[7] Santos, R. M. G.; Rodrigues-Fo, E; Rocha, W. C; Teixeira, M. F. S.; World J. Microbiol. Biotechnol. 19 (2003), 767.         [ Links ]

[8] Fujimoto, H.; Nakamura, E.; Okuyama, E.; Ishibashi, M.; Chem. Pharm. Bull. 52(8) (2004), 1005.         [ Links ]

[9] Cohen, P. A. & Towers, G. H. N. Phytochemistry. 40(3) (1995), 911.         [ Links ]

[10] Marinho, A. M. do R.; Rodrigues-Fo, E.; Santos, L. S.; Moitinho, M. L. R..; J. Braz. Chem. Soc. 16(2) (2005), 280.         [ Links ]

[11] Petterson, M. F.; Damoglou, A. P.; Appl. Microbiol. Biotechnol. 26 (1987), 574.         [ Links ]

[12] Dunn, B. B.; Stack, M. E.; Park, D. L.; Joshi, A.; Environmental Helth. 12(2&3) (1983), 283.         [ Links ]

[13] Trevedi, A. B.; Hirota, M.; Dói, E.; Kitabatake, N.; J. Chem. Soc. PT1 (1993), 2167.         [ Links ]

 

 

*andrey@ufpa.br