Efeito da temperatura no crescimento micelial e patogenicidade de Pythium spp. que ocorrem em alface hidropônica

Temperature effects on mycelial growth and pathogenicity of Pythium spp. occuring in hydroponic lettuce

ARTIGOS

Efeito da temperatura no crescimento micelial e patogenicidade de Pythium spp. que ocorrem em alface hidropônica

Temperature effects on mycelial growth and pathogenicity of Pythium spp. occuring in hydroponic lettuce

Liliane De Diana Teixeira^I; Carmen Lídia Amorim Pires Zottarelli^II; Hiroshi Kimati^I

^IDepartamento de Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrícola, ESALQ/USP, CP 9, CEP: 13.418-900, Piracicaba-SP, e-mail: [e-mail]. Bolsista CAPES

^IISeção de Micologia e Liquenologia, Instituto de Botânica, São Paulo-SP. Parte da Dissertação de Mestrado da primeira autora

RESUMO

Doze isolados de Pythium foram obtidos de raízes de alface cultivada em sistemas hidropônicos comerciais, apresentando ou não sintomas de apodrecimento. Três desses isolados foram identificados como Pythium helicoides Drechsler (H₁, H₂ e H₃), cinco como pertencentes ao grupo F (F₁ a F₅) e quatro ao grupo T (T₁ a T₄) de Pythium. A identificação das espécies foi realizada baseando-se nas características morfológicas. O efeito da temperatura (10, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 37 e 40ºC) sobre o crescimento micelial foi determinado para todos os isolados. As temperaturas mínima e máxima, estimadas pela função beta generalizada, variaram de 3,5 a 10ºC e de 40 a 40,7ºC, respectivamente. A temperatura ótima foi de 24 a 37ºC para P. helicoides, de 25 a 35ºC para o isolado F₄ e de 21 a 30ºC para os demais isolados. A patogenicidade e a agressividade dos isolados foram avaliadas, inoculando-se sementes de alface cv. Verônica, semeadas em ágar-água, a 21 e 30ºC. A 30ºC, os isolados de P. helicoides foram notadamente os mais agressivos, ocasionando 100 % de mortalidade das sementes logo após sua germinação. A 21ºC, todos os isolados induziram subdesenvolvimento de plântulas, acompanhado ou não de necrose dos tecidos radiculares. Trata-se do primeiro relato de P. helicoides para o Brasil e a primeira referência mundial da espécie em hidroponia.

Palavras-chave adicionais:Lactuca sativa L., Pythium helicoides, Pythium grupo F, Pythium grupo T

ABSTRACT

Twelve Pythium isolates were obtained from lettuce roots grown hydroponically in commercial systems, showing or not symptoms of rotting. Three of them were identified as P. helicoides (H₁, H₂ and H₃), whereas five were shown to belong to group F (F₁-F₅) and four to group T (T₁-T₄) of Pythium. The identification of the species was based on morphological characteristics. The effect of temperature (10, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 37 and 40ºC) on the mycelial growth was determined for all isolates. Minimum and maximum temperatures, estimated by the generalized beta function, varied from 3.5 to 10ºC and 40 to 40.7ºC, respectively. The optimum temperature ranged from 24 to 37ºC for P. helicoides, from 25 to 35ºC for isolate F₄ and 21 to 30ºC for the remaining isolates. Pathogenicity and aggressiveness of the isolates were evaluated by the inoculation of lettuce seeds plated in water-agar, at 21 and 30ºC. At 30ºC, P. helicoides isolates were clearly the most aggressives, determining 100 % seed mortality soon after germination. At 21ºC, all isolates reduced seedling growth, associated or not with root tissue necrosis. This is the first report of P. helicoides in Brazil and the first world reference of this species in hydroponic systems.

Additional keywords:Lactuca sativa L., Pythium helicoides, Pythium group F, Pythium group T

O cultivo hidropônico tem sido mundialmente empregado para produção de vegetais em escala comercial há várias décadas. No Brasil, a cultura preferida por 90 % dos hidroponicultores é a alface (Lactuca sativa L.), pois além de apresentar ciclo de vida curto e alta produtividade, é uma hortaliça amplamente aceita no mercado, viabilizando, dessa forma, o rápido retorno do capital investido nas instalações.

Uma grande diversidade de espécies de Pythium constitui fator limitante ao desenvolvimento de alface em todo o mundo, tanto em cultivo convencional como hidropônico (20, 21). Dentre as espécies mais freqüentes em hidroponia, estão P. aphanidermatum (Edson) Fitzp., P. debaryanum Hesse, P. dissotocum Drechsler, P. intermedium de Bary, P. irregulare Buisman, P. myriotylum Drechsler e P. sylvaticum Campbell & Hendrix (21). Consultas atendidas na Clínica Fitopatológica da ESALQ/USP revelam a constante preocupação dos produtores com a doença, principalmente nos meses mais quentes do ano. Apesar de Tateishi et al. (22) terem constatado Pythium sp. ocasionando severos sintomas de podridão radicular e subdesenvolvimento em alface convencional, na região de Atibaia, São Paulo, não se procedeu a identificação ao nível de espécie e, desde então, poucos estudos etiológicos sobre problemas radiculares causados por Pythium spp. em alface têm sido realizados no Brasil.

Apesar das espécies patogênicas de Pythium serem constantemente isoladas de raízes necróticas, Stanghellini & Kronland (20) descobriram em cultivo hidropônico de alface, que P. dissotocum causava prejuízos superiores a 50%, mesmo na ausência de sintomas de podridão radicular, em decorrência do que chamaram de infecção subclínica. Assim, os produtores podem estar perdendo metade de sua produção potencial, mesmo quando produzem uma cultura aparentemente sadia, com raízes brancas, sem sintomas.

A temperatura é considerada um dos principais fatores para o desenvolvimento de doenças radiculares ocasionadas por Pythium spp. (4, 5, 6, 19, 20, 23). De acordo com Bates & Stanghellini (2), a temperatura da solução nutritiva influenciou a ocorrência cíclica de duas espécies de Pythium em cultivo hidropônico de espinafre (Spinacea oleracea L.). P. aphanidermatum foi o patógeno predominante nos meses de verão, quando a temperatura da solução nutritiva foi igual ou superior a 23ºC e P. dissotocum foi a espécie mais agressiva quando a temperatura variou entre 17 e 22ºC.

Face à carência de informações sobre o patossistema alface hidropônica Pythium spp. no Brasil, os objetivos do presente trabalho foram: o isolamento e a identificação de – Pythium spp. de cultura hidropônica de alface, e a avaliação da influência da temperatura sobre o crescimento micelial e patogenicidade desses isolados.

MATERIAL E MÉTODOS

Isolamento e identificação de Pythium spp.

O isolamento de Pythium spp. foi realizado a partir de raízes necróticas ou assintomáticas de plantas de alface provenientes de sistemas hidropônicos comerciais, em meio de cultura ágar-água com posterior repicagem para BDA (batata dextrose ágar). A identificação dos isolados foi realizada por meio de literatura específica (9, 13, 15, 16, 24), baseando-se nas suas características morfológicas. Os isolados foram cultivados nos seguintes meios de cultura: CMA + p.p.e. (17 g de "corn meal agar"; 0,2 g de penicilina G sódica; 0,1 g de sulfato de estreptomicina; 0,02 g de pimaricina e 1000 mL de água destilada), BCA (batata cenoura ágar), meio de suco de tomate (200 mL de suco de tomate, 3 g de CaCO₃, 15 g de ágar e 800 mL de água destilada) e BDA, para avaliação da morfologia das colônias, como subsídio para a identificação e indução e/ou análise das estruturas assexuais e sexuais.

A forma de zoosporângios, células anteridiais e oogônios, a condição plerótica ou aplerótica de oósporos, a origem do ramo anteridial e o número de anterídios atracados em cada oogônio, foram examinados. Dos isolados que apresentaram zoosporângio esférico e reprodução sexuada, foram registradas as dimensões de aproximadamente 40 zoosporângios, 40 oogônios, 40 oósporos, 20 paredes de oósporos, 20 zoósporos e 20 hifas, através de microscópio óptico e lâmina graduada.

A taxa de crescimento diário dos isolados em BCA, a 25ºC, no escuro, foi determinada, por tratar-se de um parâmetro de auxílio à taxonomia (16). O ensaio contou com três repetições, cada repetição sendo representada por uma placa de Petri. A avaliação foi realizada registrando-se o diâmetro das colônias, em dois sentidos perpendiculares entre si, em dois intervalos de 24 horas. Empregou-se o delineamento experimental inteiramente casualizado e para a análise dos resultados, foram considerados os diâmetros médios das duas avaliações.

Influência da temperatura sobre o crescimento micelial dos isolados

O efeito da temperatura sobre a taxa de crescimento micelial diária dos isolados obtidos foi avaliado colocando-se discos de micélio de cada isolado no centro de placas de Petri contendo o meio de cultura CMA + p.p.e. As placas foram mantidas em estufas, no escuro, nas temperaturas de 10, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 37 e 40ºC. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado com três repetições, cada repetição representada por uma placa de Petri. As avaliações foram realizadas em intervalos de 24 horas, durante dois dias, medindo-se o crescimento diametral médio das colônias. Para a análise dos resultados considerou-se a média das duas avaliações. Os dados foram estatisticamente analisados através do programa STATISTICA (StatSoft, Tulsa, OK), por meio de regressões não-lineares. Os diâmetros médios foram representados graficamente em função da temperatura, para cada isolado, utilizando-se a função beta generalizada [Y = B1 ((X-B2)^B4) ((B3-X)^B5)] (9) como modelo de ajuste.

Efeito da temperatura sobre o potencial patogênico dos isolados

O potencial patogênico dos isolados foi avaliado em laboratório e sob duas temperaturas, utilizando metodologia similar a Stanghellini & Kronland (20). Sete sementes de alface, cultivar Verônica, após desinfestadas superficialmente com hipoclorito de sódio (três partes de água destilada: uma parte de água sanitária 0,625 % de cloro ativo) foram colocadas na superfície do meio de cultura ágar-água, contido em placa de Petri. Um disco de micélio de cada isolado foi disposto no centro de cada placa. O delineamento experimental empregado foi o inteiramente casualizado, com quatro repetições. Placas contendo apenas as sementes de alface serviram como controle. A incubação foi realizada durante 10 dias, com fotoperíodo de 12 horas, a 21ºC (± 2ºC) em câmara de crescimento e a 30ºC (± 1ºC) em câmara de germinação. Avaliou-se massa e altura médias de plântulas de cada parcela e a porcentagem de plântulas sobreviventes.

Todos os ensaios do presente trabalho foram repetidos pelo menos duas vezes.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Isolamento e identificação de Pythium spp.

Doze isolados de Pythium spp. foram obtidos a partir das raízes analisadas (Tabela 1). Os espécimes H₁, H₂ e H₃ apresentaram crescimento mais rápido, vigoroso e presença de micélio aéreo em todos os meios de cultura testados. Apresentaram reprodução assexuada, com zoosporângios esféricos, papilados e com proliferação interna e reprodução sexuada, o que permitiu sua identificação como P. helicoides (Tabela 1). As características morfológicas e taxa de crescimento dos espécimes são mostrados na Tabela 2. É a primeira citação da espécie para o Brasil e, a primeira menção da mesma em cultivo hidropônico ao nível mundial.

Os isolados F₁ a F₅ e T₁ a T₄ apresentaram crescimento um pouco mais lento, submerso nos meios de cultura e ausência de micélio aéreo. Como não apresentaram reprodução sexuada, foram classificados em grupos, como proposto por Plaats-Niterink (15, 16). Assim, com base na morfologia dos zoosporângios, os isolados F₁, F₂, F₃, F₄ e F_5, apresentando zoosporângios filamentosos não inflados, foram classificados no grupo F e, os isolados T₁, T₂, T₃ e T₄ no grupo T, pela presença de zoosporângios filamentosos inflados. Diversos meios de cultura e incubação a várias temperaturas foram empregados no intuito de estimular a formação de estruturas reprodutivas sexuais desses espécimes, entretanto, sem sucesso.

Os isolados de P. helicoides H₁, H₂ e H₃ apresentaram maior crescimento, seguidos pelos isolados F₁, F₂, F₃, F₅ e T₃ e por F₄, T₁, T₂ e T₄ que cresceram mais lentamente. Assim, percebe-se uma separação dos isolados em três grupos, de acordo com sua taxa de crescimento micelial diária em BCA (Tabela 3). A classificação dos isolados assexuais em grupos foi feita baseada na morfologia dos zoosporângios, de acordo com Plaats-Niterink (15, 16).

A identificação de isolados que não produzem estruturas sexuadas é bastante difícil, por isso, Plaats-Niterink (15) classificou-os apenas em grupos. Essa classificação, porém, não apresenta rigidez, uma vez que espécies heterotálicas podem acabar sendo incluídas nesses grupos, como no caso do grupo HS de Pythium (15), que posteriormente foi relatado como uma linhagem assexual de P. ultimum Trow (18). Assim, técnicas moleculares (10, 11) e imunológicas (12, 25) são importantes ferramentas nos estudos morfológicos para identificação de espécies de Pythium.

Influência da temperatura sobre o crescimento micelial dos isolados

A influência da temperatura sobre a taxa de crescimento micelial diária foi significativa para os doze isolados estudados e descrita pela função beta generalizada (Figura 1, Tabela 4). Houve incremento no desenvolvimento de todos os isolados até aproximadamente a temperatura de 30ºC. Para H₂ e H₃, esse aumento ocorreu até cerca de 37ºC. Para os demais isolados, a partir de 30ºC, a taxa de crescimento decresceu, e de maneira mais acentuada para F₂, F₃, F₅, T₂ e T₄.

Apesar dos valores de temperatura máxima estimados pelo modelo situarem-se em torno de 40ºC para todos os isolados (parâmetro B₃ - Tabela 4), nessa temperatura, houve significativo crescimento de H₁, H₂ e H₃, especialmente de H₃; os isolados F₂, F₃, F₅, T₂ e T₄ não cresceram e F₁, F₄, T₁ e T₃ exibiram traços de crescimento (Figura 1). A temperatura mínima de crescimento micelial estimada variou entre 3,5 e 10ºC (parâmetro B₂ - Tabela 4).

Os isolados de P. helicoides (H₁, H₂ e H₃) mostraram comportamento semelhante perante as temperaturas testadas (Figura 1) e apresentaram temperaturas mínimas para o crescimento micelial mais altas que os demais (parâmetros B₂ e B₃ - Tabela 4).

A importância da temperatura no desenvolvimento de Pythium spp. foi ressaltada por Favrin et al. (4) e Funck-Jensen & Hockenhull (5). Schrandt et al. (19), ao investigarem a faixa de temperatura ideal para o crescimento micelial de P. violae Chester & Hickman, encontraram que o patógeno desenvolve-se melhor em temperaturas entre 16 e 22ºC. Neste trabalho, a faixa de temperatura ótima para o crescimento micelial abrangeu desde 24 a 37ºC para os isolados de P. helicoides e de 21 a 30ºC para os isolados de Pythium pertencentes aos grupos F e T, com exceção de F₄, que exibiu ótimo de temperatura entre 25 e 35ºC. Para P. helicoides, a faixa ótima foi mais ampla que as relatadas por Plaats-Niterink (16), situada entre 30 e 37ºC e por Middleton (13), compreendida entre 28 e 37ºC.

O parâmetro B₅ da função beta generalizada é relacionado à forma da curva e indica a amplitude do intervalo de temperatura ótima; quanto menor o valor do parâmetro (próximo a zero), mais ampla é a faixa de temperatura ao redor da ótima (1). O valor de B₅ variou entre 0,48 e 0,96 (Tabela 4), revelando que todos os isolados cresceram numa extensa faixa de temperatura.

A função beta generalizada (7) tem sido empregada para representar a resposta de eventos biológicos a variações de temperatura, pois é baseada em curvas que descrevem processos biológicos, uma vez que estima os valores de temperaturas mínima e máxima (parâmetros B₂ e B₃ respectivamente) de desenvolvimento, além de possuir formato de sino. De acordo com os valores dos coeficientes de determinação (R²) e de "F" (Tabela 4), pode-se afirmar que esta função também se mostrou adequada para a representação dos dados obtidos.

Efeito da temperatura sobre o potencial patogênico dos isolados

Houve significativo efeito da temperatura sobre a patogenicidade dos isolados. Na temperatura de 21ºC, apenas o isolado F₃ foi capaz de reduzir significativamente a massa fresca das plântulas, diferindo estatisticamente da testemunha. Os isolados que mais afetaram a altura média das plântulas foram T₁, F₃, H₁, F₁ e T₂. Os isolados de P. helicoides (H₁, H₂ e H₃) ocasionaram a morte de apenas 3,57 % das plântulas inoculadas (Tabela 5), enquanto os de Pythium grupo F de 3,57 % (F₁, F₂ e F₃) e 7,14 % (F₅) (Tabela 5) e aqueles pertencentes ao grupo T de 3,57 % (T₁, T₃ e T₄) e 10,71 % (T₂) (Tabela 5). As plântulas não inoculadas exibiram desenvolvimento normal.

Na temperatura de 30ºC, os isolados de P. helicoides H₁, H₂ e H₃ foram claramente os mais agressivos, crescendo rápida e abundantemente, tomando toda a placa de Petri dentro de dois dias, colonizando e causando a morte de todas as plântulas, logo após a germinação das sementes inoculadas (Tabela 5). Com relação ao efeito dos demais isolados sobre a massa fresca das plântulas, apenas F₃ causou considerável redução. A altura média das plântulas foi afetada por um maior número de isolados, sendo consistentemente reduzida por T₂, F₁, F₅, T₃, e F₃. Dentre os isolados de Pythium pertencentes aos grupos F e T, apenas F₅ e T₁ ocasionaram a morte de 3,57 % das plântulas inoculadas (Tabela 5). As plântulas não inoculadas apresentaram bom desenvolvimento, porém, menor que aquelas cultivadas a 21ºC (Tabela 5), além de uma menor quantidade de raízes laterais. A massa fresca das plântulas inoculadas não foi uma variável adequada para a avaliação da patogenicidade in vitro, evidenciando pouquíssimas diferenças entre os tratamentos.

Stanghellini & Kronland (20) avaliaram a patogenicidade in vitro de Pythium spp. isoladas de raízes assintomáticas de plantas de alface, cultivadas pelo sistema convencional, e observaram que houve morte de sementes e/ou plântulas quando inoculadas com P. irregulare e P. sylvaticum, enquanto apenas necrose da ponta da raiz e inibição da formação de raízes laterais ocorreram em plântulas inoculadas com P. dissotocum, P. uncinulatum Van der Plaats-Niterink & Blok e P. violae. P. catenulatum Matthews e P. rostratum Butler não provocaram óbvios sintomas em alface. Os mesmos autores comprovaram o efeito da temperatura sobre a patogenicidade de P. dissotocum a alface em condições de hidroponia. Evidenciaram, mesmo na ausência de sintomas visíveis, diminuições significativas na produção (35-54% de redução à 18ºC e 12-17% à 28ºC). Thinggaard & Middelboe (23) ao inocular uma suspensão de zoósporos de Pythium grupo F em sementes de alface dispostas sobre papel de filtro, em placas de Petri, à 25ºC, constataram 99 a 100 % de morte. Neste estudo, à 30ºC, apenas isolados de P. helicoides ocasionaram morte de 100 % de sementes inoculadas, logo após sua germinação. À 21ºC, todos os isolados induziram subdesenvolvimento de plântulas acompanhado ou não de sintomas de necrose e pouco afetaram a sobrevivência das plântulas inoculadas (Tabela 5).

Fatores como concentração de oxigênio, pH e condutividade elétrica da solução nutritiva são importantes elementos para o adequado desenvolvimento de culturas hidropônicas (3, 14). Segundo Rey et al. (17), plantas estressadas são mais afetadas por patógenos, pois seus mecanismos de defesa encontram-se enfraquecidos. Nessa situação, organismos considerados patógenos fracos tornam-se potencialmente perigosos, a exemplo de Pythium grupo F. Dessa forma, na presente pesquisa, a ocorrência de fatores ambientais adequados ou não para o desenvolvimento das plantas de alface empregadas para obtenção dos isolados, em suas instalações hidropônicas de origem, pode ter determinado a presença ou ausência de sintomas radiculares (Tabela 1).

Assim, os efeitos de infecções ocasionadas por Pythium spp. em sistemas hidropônicos recirculantes necessitam ser mais investigados em condições brasileiras, para que a manipulação da temperatura da solução nutritiva possa ser empregada como um método cultural para controle de certas doenças radiculares, desde que o intervalo de temperatura utilizado permita a produção econômica da cultura.

Data de chegada: 29/07/2004. Aceito para publicação em: 27/09/2005

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  13 Nov 2006
• Data do Fascículo
  Set 2006

Histórico

• Aceito
  27 Set 2005
• Recebido
  29 Jul 2004