Efeito da temperatura na multiplicação celular, no desenvolvimento embrionário e na eclosão de juvenis do segundo estádio de Meloidogyne javanica

Effect of temperature on embryonic development and in hatching of Meloidogyne javanica

ARTIGOS

Efeito da temperatura na multiplicação celular, no desenvolvimento embrionário e na eclosão de juvenis do segundo estádio de Meloidogyne javanica

Effect of temperature on embryonic development and in hatching of Meloidogyne javanica

Hercules Diniz Campos^I; Vicente Paulo Campos^II; Edson Ampélio Pozza^II

^IUniversidade de Rio Verde - FESURV, Faculdade de Agronomia, CP 104, CEP 75910-970, Rio Verde,GO, e-mail: [e-mail]

^IIDepartamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Lavras -UFLA, CP 37, CEP 37200-000, Lavras, MG

RESUMO

Fatores abióticos influenciam a multiplicação celular, o desenvolvimento embrionário, bem como a sobrevivência e eclosão de juvenis do segundo estádio (J2) de Meloidogyne spp. O efeito relativo à temperatura constante tem sido estudado com várias espécies e populações de Meloidogyne. Entretanto, tem sido pouco pesquisado a flutuação de temperatura, a qual predomina no campo entre o dia e a noite ou durante períodos de predominância de massas polares. Assim, objetivou-se estudar o efeito da flutuação de temperatura em ovos de M. javanica com estádios de desenvolvimento padronizados. Quando foram usados ovos com juvenis já formados, maior percentual de eclosão ocorreu em temperatura fixa de 28 ºC, mas a redução do tempo de exposição a esta temperatura reduziu a eclosão. A exposição dos ovos por 10 horas a 10 ºC, seguido de 14 horas a 28 ºC, proporcionou maior eclosão dos J2 em relação ao mesmo período de exposição mas a 5 ºC seguido de 14 horas a 28 ºC. Já a incubação em temperatura constante de 10 ºC proporcionou menor taxa de eclosão. Ovos no estádio de duas células incubados em temperatura constante de 28 ºC tiveram a multiplicação celular e o desenvolvimento embrionário acelerado em relação às alternadas. Em temperatura constante de 10 ºC ocorreu apenas a multiplicação celular, após a incubação dos ovos por 12 dias. Entretanto, quando incubados por períodos de 10 horas a 10 ºC seguido de 14 horas a 28 ºC ocorreram a formação de juvenis e eclosão de J2, porém significativamente inferior às observadas em temperatura constante de 28 ºC. Em temperaturas de 5 ºC por 10 horas seguida de 28 ºC por 14 horas, não proporcionou eclosão de juvenis no período de 12 dias. Nos ovos ocorreram apenas os estádios pluricelulares, gástrula e "tadpole". Portanto, a temperatura constante de 10 ºC permite apenas a multiplicação celular, e o intervalo de temperatura entre 5 ºC e 10 ºC afeta drasticamente os processos envolvidos no desenvolvimento embrionário de M. javanica.

Palavras chave: Nematóide de galhas, ovos, eclosão, temperatura, desenvolvimento embrionário.

ABSTRACT

Abiotic factors affect the embryonic development, survival and hatching of second-stage juvenile (J2) of Meloidogyne spp. The effect of constant temperature has been studied with various species and populations of Meloidogyne spp. However, the temperature fluctuation which predominates in the field between day and night or during periods of predominance of polar cold front, has not been well studied. Thus, this work aimed to study the effect of temperature fluctuation on egg of M. javanica with standardized embryo development. When eggs with formed juveniles inside were used, highest percentage of hatching occurred at fixed temperature of 28 ºC. The reduction of the exposure time at 28 ºC reduced hatching. The eggs exposed for 10 hours at 10 ºC and complemented by 14 hours at 28 ºC resulted in greater J2 hatching as compared to 10 hours at 5 ºC complemented by 14 hours at 28 ºC. The incubation at fixed temperature of 10 ºC rendered lowest hatching. When eggs at the two-cell stage were used and incubated at 28 ºC the cell multiplication and embryonic development were speeded up. At constant temperature of 10 ºC for egg incubation during 12 days only cell multiplication occurred. However, when the incubation temperatures varied with period of 10 hours at 10 ºC and complemented by 14 hours at 28 ºC, juveniles were formed inside the eggs and hatched but significantly lower than those at constant temperature of 28 ºC. At alternated temperatures of 10 hours at 5 ºC, complemented by 14 hours at 28 ºC, with the same incubation time, juveniles were not formed. In the eggs occurred only the pluricelular, gastrula and tadpole stages occurred. Therefore, the constant temperature of 10 ºC allows only the cellular multiplication, and the temperature interval of 5 ºC and 10 ºC affect drastically several processes involved in embryo development of M. javanica.

Additional keywords: Root-knot nematode, eggs, hatching, temperature, embryonic development.

A sobrevivência de fitonematóides em condições ambientais adversas pode variar entre as espécies e entre os seus estádios de desenvolvimento. No ovo, ocorrem a multiplicação celular, formação e organização dos tecidos, desenvolvimento embrionário passando pelos períodos de mórula, blástula e gástrula, formando o juvenil do primeiro estádio que após a primeira ecdise passa a juvenil do segundo estádio (J2) (4). Ainda dentro do ovo, vários fatores abióticos podem influenciar nesse desenvolvimento, bem como a sobrevivência e a eclosão de J2 de espécies de Meloidogyne (2, 12, 17).

Nas condições de campo, a temperatura é um fator extremamente importante para o sucesso do desenvolvimento e a manutenção da população do nematóide dentro ou fora da planta (7). O fator temperatura pode controlar o desenvolvimento embrionário dentro dos ovos e a habilidade do J2 em romper e liberar a casca do ovo (12). Entretanto, em pesquisas já realizadas, além de utilizar populações de ovos com vários estádios de desenvolvimento, avaliaram o efeito de temperaturas fixas ou em intervalos sem a determinação do tempo de exposição na embriogênese e na eclosão de J2 de Meloidogyne. Assim, Decker (5) e Wallace (17) verificaram que o intervalo de temperatura entre 15 e 30 ºC possibilita o desenvolvimento da maioria das espécies de Meloidogyne. Já foi verificado também um efeito específico entre espécies quanto à temperatura. Vrain & Barker (16), observaram que ovos de M. hapla desenvolveram embriões a 8 ºC, o que não aconteceu com M. incognita. A taxa de embriogênese em M. javanica sob temperatura de 15 ºC foi aproximadamente 4 a 5 vezes menor do que aquela em 30 ºC (2). Para M. javanica, a eclosão de J2 ocorreu mais rapidamente a 25 ºC (2, 15). No entanto, a taxa de eclosão de J2 foi insignificante abaixo de 12 ºC e 15 ºC para M. incognita e M. javanica, respectivamente (3, 9). Aproximadamente 85% dos ovos de M. javanica submetidos à temperatura de 8 ºC por 30 dias tiveram retardamento da eclosão dos J2, quando comparado àqueles não submetidos a esta temperatura (10). Já M. chitwoodi e M. hapla apresentaram taxas de eclosão satisfatórias mesmo em temperaturas próximas de 10 ºC (13).

No entanto, pouco se conhece sobre o efeito de regimes de temperaturas flutuantes na eclosão de J2 e no desenvolvimento embrionário. Neste trabalho, objetivou-se avaliar: o percentual de eclosão de J2 de M. javanica a partir da incubação de ovos contendo juvenis e o progresso de desenvolvimento embrionário após a incubação de ovos no estádio de duas células.

MATERIAL E MÉTODOS

Obtenção de ovos de Meloidogyne javanica no estádio de duas células ou contendo juvenis.

Raízes com galhas de plantas jovens de soja, cultivar Embrapa 20, aos 22 dias após inoculação e galhas de plantas velhas, aos 85 dias após inoculação, foram coletadas, separadamente, e os ovos foram extraídos conforme a técnica de Hussey & Barker (11). As impurezas misturadas aos ovos foram eliminadas vertendo-se a suspensão em peneira de 0,025mm e os ovos foram recolhidos com solução de sacarose (454g de açúcar por litro de água), centrifugada a 1700 rpm por 1 minuto. Em seguida, verteu-se o sobrenadante contendo os ovos em peneira de 0,025 mm, enxaguando-os em água corrente. A suspensão de ovos foi submetida a desinfestação superficial em solução de pentabiótico 300 ppm por 4 minutos. A seguir foi vertida, novamente, em peneira de 0,025 mm, e os ovos foram enxaguados com água de torneira autoclavada.

As suspensões de ovos desinfestados foram colocadas em placas de vidro e levadas para microscópio de objetiva invertida. Da suspensão obtida de raízes de plantas jovens foram separados apenas ovos no estádio de duas células e da obtida de galhas de plantas velhas foram separados ovos contendo juvenis.

Efeito de temperatura fixa e variada na eclosão de juvenis do segundo estádio (J2) de Meloidogyne javanica.

Vinte ovos contendo juvenis, constituindo a unidade experimental, foram transferidos para cada célula da placa de Elisa. Essas placas foram acondicionadas em caixas plásticas (gerbox) e transferidas para câmaras com temperatura fixas de 10 ou 28 ºC e temperaturas variadas: incubação por 10 horas a 5 ºC seguida de 14 horas a 28 ºC ou a 10 ºC seguida de 28 ºC, expostos pelos mesmos períodos de horas. Nessas condições os ovos com juvenis já formados foram incubados por 11 dias. A cada 24 horas quantificou-se, o número de J2 eclodidos. Obteve-se, no final, o percentual de J2 eclodidos nos 11 dias de incubação em cada tratamento térmico.

O delineamento empregado foi inteiramente casualizado com quatro tratamentos térmicos e 11 períodos de incubação em seis repetições.

Para a análise de variância, assim como a de regressão, utilizou-se o programa SAS version 8 (SAS Institute Inc., Cary, USA). As fontes de variação significativas pelo teste F foram empregadas para construir os modelos de regressão. Em seguida, foram plotadas as curvas.

Efeito de temperatura fixa e variada na multiplicação celular e no desenvolvimento embrionário de Meloidogyne javanica.

Vinte ovos no estádio de duas células, constituindo a unidade experimental, foram transferidos para cada célula de placa de Elisa. Essas placas foram acondicionadas em caixas plásticas (Gerbox) e incubadas sob os mesmos regimes de temperatura descritos no ensaio anterior. Nessas condições, os ovos com duas células foram incubados por um período de 12 dias. A cada três dias, quantificou-se, o percentual de ovos que se encontrava em diferentes estádios, tais como: de duas e quatro células, pluricelular, gástrula, tadpole, com juvenil formado e J2 eclodidos. Ao final, obteve-se o percentual de cada estádio nos 12 dias de incubação em cada tratamento térmico.

O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado com quatro tratamentos térmicos e quatro períodos de incubação, em 4 repetições.

Os dados obtidos foram transformados em raiz de x + 0,5 para a realização da análise de variância. Utilizou-se o programa Sisvar para realização da análise de variância e as médias foram comparadas através do teste de Scott & Knott (14) a 5% de probabilidade.

RESULTADO E DISCUSSÃO

Efeito de temperatura fixa e variada na eclosão de juvenis do segundo estádio (J2) de Meloidogyne javanica.

A eclosão de J2 de M. javanica, foi maior em temperatura constante de 28 ºC e menor em 10 ºC (Figura 1). Quando a temperatura foi alternada, a exposição a 10 ºC propiciou melhor eclosão do que a 5 ºC (Figura 1). A eclosão tanto em temperatura fixa como alternada aumentou com o tempo de incubação dentro do período estudado (Figura 1).

Como os ovos empregados neste ensaio já continham o juvenil formado, a maior eclosão a 28 ºC pode indicar que esta temperatura é mais adequada ao processo de saída do J2 propiciando maior movimentação dentro do ovo do que a de 10 ºC. Além disto, a redução do tempo de exposição à temperatura de 28 ºC reduz a eclosão. Portanto, a redução da temperatura durante a noite leva a uma diminuição na eclosão. Freire & Ferraz (8) também encontraram maior eclosão de J2 de M. incognita e de M. javanica em temperatura de 28 ºC, embora Bird (2) e Vrain (15) tenham observado que a eclosão de J2 de M. javanica foi mais rápida em temperaturas constantes de 25 ºC e de 30 ºC. Porém, a taxa de eclosão de J2 foi insignificante abaixo de 12 e 15 ºC para M. incognita e M. javanica, respectivamente (3, 6, 9). A 8 ºC, 85% dos ovos de M. javanica tiveram a eclosão inibida, quando comparados àqueles não submetidos a baixa temperatura (10). Entretanto, como esses pesquisadores não usaram população homogênea de ovos com o juvenil já formado, esses efeitos podem ter ocorrido em fases anteriores à formação do juvenil, como multiplicação celular e desenvolvimento embrionário.

Efeito de temperatura fixa e variada na multiplicação celular e no desenvolvimento embrionário de Meloidogyne javanica.

Ovos no estádio de duas células incubados em temperatura fixa de 28 ºC, aos três dias, já apresentavam 94,75% no estádio pluricelular e 5,25% no estádio de gástrula. Contudo, diminuindo o tempo de exposição a 28 ºC, isto é alternando a temperatura, ocorreu um retardamento desse processo de multiplicação celular e do início do desenvolvimento embrionário. A exposição dos ovos em temperatura alternada por 10 horas a 10 ºC retardou menos o desenvolvimento em relação a exposição pelo mesmo período a 5 ºC. Na temperatura fixa de 10 ºC observou-se aproximadamente 1/3 dos ovos em cada estádio, de duas células, quatro células e pluricelular. Nesta temperatura de incubação ocorreram a maior (P<0,05) porcentagem de ovos ainda no estádio de duas células e a menor (P<0,05) no estádio pluricelular, caracterizando-a como a temperatura que tornou mais lento o processo de multiplicação celular e desenvolvimento embrionário dos regimes de temperatura testados neste período de incubação (Figura 2).

Aos seis dias de incubação dos ovos em temperatura fixa de 28 ºC, 83,75% já apresentavam juvenil formado no seu interior, o que não aconteceu quando alternou com temperatura de 10 ºC por 10 horas, o que causou um retardamento no desenvolvimento embrionário, entretanto, 42% avançaram até o estádio de gástrula e 13% ao de "tadpole". Quando alternou, pelo mesmo período, com temperatura de 5 ºC, os ovos apenas alcançaram o estádio pluricelular. Na temperatura fixa de 10 ºC maior quantidade de ovos chegou ao estádio pluricelular, porém não avançaram para os estádios embrionários (Figura 3).

Aos nove dias de incubação dos ovos em temperatura fixa de 28 ºC, 34% dos juvenis eclodiram. Quando se alternou com 10 horas a 10 ºC apenas 8,25% eclodiram, mantendo-se maior porcentual de ovos com juvenil formando, entretanto, ovos se distribuíram nas categorias: pluricelular, gástrula e "tadpole". Contudo a alternância com temperatura de 5 ºC por 10 horas não ocorreu formação do juvenil, com os ovos apresentando-se nos estádios pluricelulares, gástrula e "tadpole". Na temperatura fixa de 10 ºC concentrou-se maior número de ovos no estádio pluricelular e nenhum avançou para o estádio embrionário (Figura 4).

Aos 12 dias de incubação dos ovos a temperatura fixa de 28 ºC não ocorreu alteração significativa na porcentagem de juvenis eclodidos em relação ao período de 9 dias. Quando se alternou com a temperatura de 10 ºC por 10 horas, as porcentagens de ovos nas categorias mais avançadas do desenvolvimento embrionário aumentaram em relação aos 9 dias de incubação (Figuras 4 e 5). Contudo, a alternância com temperatura de 5 ºC por 10 horas ocorreu 17,5% dos ovos com juvenis formando e os demais se distribuíram nas categorias: pluricelular, gástrula e "tadpole". Na temperatura fixa de 10 ºC não ocorreu nenhuma alteração com a incubação por 12 dias em relação ao período anterior (Figuras 4 e 5).

No período de incubação estudado de 12 dias a eclosão de J2 ocorreu, apenas, quando se incubaram os ovos em temperatura fixa de 28 ºC e quando se alternou com 10 horas a 10 ºC, porém em proporção significativamente superior em temperatura fixa de 28 ºC (Figura 5). Portanto, a maior (P<0,05) eclosão em temperatura fixa de 28 ºC (Figura 5) pode indicar que esta temperatura acelera a embriogênese de M. javanica. Bird (2) encontrou taxa de embriogênese de M. javanica sob temperatura constante de 30 ºC cerca de 4 a 5 vezes superior àquela a 15 ºC. Vrain & Barker (16) consideraram as temperaturas entre 25 e 30 ºC como ótimas para a embriogênese de M. incognita.

A não ocorrência de nenhum ovo, nos estádios de desenvolvimento embrionário estudados (gástrula e "tadpole") durante os 12 dias de incubação em temperatura fixa de 10 ºC indica que esta temperatura propicia apenas a multiplicação celular de forma lenta, sem propiciar condições para a organização de tecidos. Como ocorreu evolução no número de células ao longo do período de incubação do ovo, a temperatura de 10 ºC não causa injúria e morte nas células. Vrain & Barker (16) incubando ovos de M incognita em temperatura constante de 8 ºC não observaram desenvolvimento de embriões. Bergeson (1) observou redução de 75% na sobrevivência de embriões dentro de ovos de M. incognita, quando ovos foram incubados em temperaturas inferiores a 10 ºC. Entretanto, Bergeson (1) trabalhou com população de ovos contendo diversos estádios de desenvolvimento dos embriões, tornando assim, difícil especificar o efeito da temperatura em cada estádio de desenvolvimento do embrião. Ao contrário, Bird (2) trabalhou em suas pesquisas com ovos apenas no estádio de duas células e observou uma taxa extremamente baixa em ovos incubados a 15 ºC, embora tenha sido a temperatura estudada em seu trabalho.

A alternância de temperatura de incubação dos ovos com exposição de 10 horas, a 10 ºC ou 5 ºC, retarda o processo de desenvolvimento embrionário em relação a temperatura constante de 28 ºC. Entretanto, a exposição à 5 ºC proporcionou maior (P<0,05) redução do desenvolvimento embrionário do que a alternância com 10 horas a 10 ºC (Figuras 2, 3, 4 e 5). Provavelmente o intervalo de temperatura entre 10 ºC e 5 ºC afetou de forma drástica a fisiologia do processo embrionário. De fato, com relação a exposição dos ovos a 10 ºC, os resultados aqui obtidos (Figuras 2, 3, 4 e 5) demonstraram a necessidade de alguma exposição a temperaturas superiores a esta para disparar o processo embrionário. Portanto, em pesquisas futuras, sugere-se ênfase no desenvolvimento embrionário em temperaturas alternadas e utilização de população homogênea de ovos.

Data de chegada:07/11/2005.

Aceito para publicação em: 15/06/2007

Autor para correspondência : Hercules Diniz Campos.

• 1. Bergeson, G.B. The influence of temperature on the survival of some species of the genus Meloidogyne in the absence of a host. Nematologica, Leiden, v.4, p. 344-354, 1959.
• 2. Bird, A.F. Influence of temperature on embryogenesis in Meloidogyne javanica Journal of Nematology, Raleigh, v.4, p. 206-213, 1972.
• 3. Bird, A.F.; Wallace, H.R. The influence of temperature on Meloidogyne hapla and Meloidogyne javanica Nematologica, Leiden, v.11, p. 581-589, 1965.
• 4. Campos, V.P.; Campos, J.R.; Silva, L.H.C.P.; Dutra, M.R. Manejo de nematóides em hortaliças. In: Silva, L.H.C.P.; Campos, J.R.; Nojosa, G.B.A. Manejo integrado: doenças e pragas em hortaliças. Lavras: UFLA, 2001. p.125-158.
• 5. Decker, H. Plant nematodes and their control (Phytonematology). New York: Brill, 1989. 540p.
• 6. Dutra, M.R. Manejo do solo e da água no controle de nematóides de galhas (Meloidogyne sp.) e estudos "in vitro" da temperatura e umidade na infectividade desses patógenos 2002. 131p. Dissertação (Mestrado em Fitopatologia)-Universidade Federal de Lavras, Lavras.
• 7. Evans, A.A.F. Diapause in nematodes as a survival strategy. In: Veech, J.A.; Dickson, D.W. Vistas on nematology Hyattsville: Society of Nematologists, 1987. p.180-187.
• 8. Freire, F.C.O.; Ferraz, S. Resistência de cultivares de feijoeiro a Meloidogyne incognita e M. javanica e influência da temperatura e exsudatos radiculares sobre a eclosão de seus juvenis. Revista Ceres, Viçosa, v. 24, n. 133, p. 247-260, 1977.
• 9. Goodell, P.B.; Ferris, H. Influence of environmental factors on the hatch and survival of Meloidogyne incognita Journal of Nematology, Lakeland, v.21, n.3, p.328-334, 1989.
• 10. Huang, S.P.; Pereira, A.C. Influence of inoculum density, host, and low-temperature period on delayed hatch of Meloidogyne javanica eggs. Journal of Nematology, Lakeland, v.26, n.1, p.72-75, 1994.
• 11. Hussey, R.S.; Barker, K.R. A comparison of methods for colecting inocula of Meloidogyne spp., including a new technique. Plant Disease Report, St. Paul, v. 57, n. 12, p. 1025-1128, 1973.
• 12. Lee, D.L. Atkinson, H.J. Physiology of nematodes New York: Columbia University, 1977. 215p.
• 13. Santo, G.S.; O'Bannon, J.H. Effect of soil temperature on the pathogenicity and reprodution of Meloidogyne chitwoodi and M. hapla on Russet Burbank potato. Journal of Nematology, Lakeland, v.13, p. 483-486, 1981.
• 14. Scott, A.J.; Knott, M. Cluster analysis method for grouping means in the analysis of variance. Biometrics, London, v. 30, n. 3, p. 507-512, Sept. 1974.
• 15. Vrain, T.C. Influence of chilling and freezing temperatures on infectivity Meloidogyne incognita and M. hapla Journal of Nematology, Lakeland, v.10, n.2, p.177-180, 1978.
• 16. Vrain, T.C.; Barker, K.R. Influence of low temperature on development of Meloidogyne incognita and M. hapla eggs in eggs masses. Journal of Nematology, Lakeland, v.10, n.4, p.311-313, 1978.
• 17. Wallace, H,R. The influence of temperature on embryonic development and hatch of Meloidogyne javanica Nematologica, Leiden, v. 171, p. 170-186, 1971.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  26 Maio 2008
• Data do Fascículo
  Fev 2008

Histórico

• Aceito
  15 Jun 2007
• Recebido
  07 Nov 2005