Crestamento foliar, nova sintomatologia em algodoeiro causada por Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum

Cotton leaf blight, a new symptomatology caused by Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum

NOTAS CIENTÍFICAS

Valdemar Atílio Malavolta Jr.^I; Suzete Aparecida Lanza Destéfano^II; Luís Otávio Saggion Beriam^II; Maria Angélica Pizzinatto^I; Edivaldo Cia^I

^IInstituto Agronômico/ APTA, Caixa Postal 28, 13001-970, Campinas, SP

^IIInstituto Biológico/ APTA, Campinas, SP

RESUMO

Foi observada recentemente no Estado de São Paulo uma nova sintomatologia em algodoeiro cv. Makina, IAC 24 e Detaopal, causada por Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum (Xam), denominada "crestamento foliar". Caracteriza-se por crestamento foliar, geralmente acompanhado por halo clorótico, podendo também causar sintomas de "V" invertido, a partir dos bordos foliares. Linhagens de Xam foram comparadas, por meio de testes de patogenicidade, bioquímicos, sorológicos, culturais e PCR-RFLP da região espaçadora 16S-23S DNAr. Independentemente do tipo de sintoma, as linhagens apresentaram características e perfis idênticos aos apresentados pela linhagem tipo, confirmando a identidade dos isolados como Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum.

Palavras-chave adicionais: bacteriose em algodoeiro, Gossypium hirsutum

ABSTRACT

Recently a new symptomatology on cotton plants (cv. Makina, IAC 24 and Deltaopal) caused by Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum (Xam) was observed in São Paulo state, Brazil, and named "bacterial leaf blight". The symptom was characterized by leaf blight, generally exhibiting chlorotic haloes and sometimes showing V-shaped lesions beginning at the leaves' border. Strains of Xam responsible for typical angular leaf spots and bacterial leaf blight were compared through pathological, biochemical, serological, cultural and RFLP-PCR tests of the 16S-23S spacer region. Independently of the symptom type, the strains exhibited characteristics and profiles that were identical to those exhibited by the type strain, which confirms the isolates identity Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum

Additional keywords: cotton bacteriosis, Gossypium hirsutum.

A bactéria Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum (Xam) ocorre nas principais regiões produtoras de algodão de nosso país, e é responsável por danos econômicos à cultura, afetando capulhos, caule, ramos e folhas. Nas folhas, os sintomas ocasionados são caracterizados como manchas angulares e necrose das nervuras (1, 2, 8). Recentemente, foi observado em cultivo de algodoeiro (cvs. Makina, IAC e Deltaopal) localizado no Centro Experimental de Campinas, IAC, no Estado de São Paulo, sintomas de crestamento foliar similares àqueles causados por fungos dos gêneros Fusarium e Verticillium (6). Essa sintomatologia geralmente é acompanhada por halo clorótico, podendo também causar sintomas de "V" invertido, a partir dos bordos foliares, com a penetração da bactéria provavelmente via hidatódios. A região afetada torna-se quebradiça e pardacenta, havendo abscisão das folhas severamente atacadas. Dos materiais coletados foram isoladas bactérias do gênero Xanthomonas.

Face à constatação dessa nova sintomatologia, este estudo teve por objetivo confirmar a caracterização das bactérias isoladas de folhas de algodoeiro com sintomas de crestamento foliar, por meio de testes de patogenicidade, bioquímicos, culturais, sorológicos, moleculares (PCR-RFLP da região espaçadora 16S-23S DNAr) e de sensibilidade "in vitro" a antibióticos de uso agrícola.

Quatro linhagens isoladas de folhas de algodoeiro, sendo duas provenientes de lesões angulares características (IBSBF 1912 e 2003) e duas provenientes de sintomas em "V" invertido e crestamento foliar (IBSBF 1911 e 1913) foram comparadas com a linhagem patotipo de Xam (IBSBF-1773^P). Os experimentos foram conduzidos em casa-de-vegetação e laboratórios do Instituto Agronômico e do Instituto Biológico, localizados em Campinas, SP.

Nos testes de patogenicidade, foram utilizadas plantas de algodoeiro das cultivares Deltaopal, IAC 24 e Makina, com 20 dias de idade. Essas cultivares diferem quanto à resistência a Xam, sendo consideradas, respectivamente, como resistente, moderadamente resistente e suscetível. Para cada um dos tratamentos (linhagem bacteriana, cultivar e método de inoculação) foram utilizadas plantas contidas em três vasos, cada qual com 3-4 mudas. Folhas totalmente expandidas destas cultivares foram inoculadas, separadamente, por meio de ferimentos por agulhas múltiplas previamente mergulhadas em suspensão bacteriana (5 x 10⁸ UFC/mL) ou por pulverização foliar com pressão de 1,0 kgf/cm², até o ponto de escorrimento, utilizando uma suspensão de 10⁷ UFC/mL, sem entretanto causar anasarca dos tecidos foliares. Plantas controle foram tratadas com água destilada esterilizada. O material inoculado foi mantido em casa-de-vegetação, sob câmara úmida durante 72 h. As linhagens empregadas (IBSBF 1911, 1912, 1913 e 2003) foram capazes de reproduzir tanto os sintomas típicos de mancha angular como os de crestamento foliar, independentemente da resistência genética do hospedeiro.

Figura 1

Os testes bioquímicos e culturais foram conduzidos segundo metodologia descrita por Schaad et al. (7), para o gênero Xanthomonas. Os resultados desses testes permitiram confirmar a identificação dos isolados de algodoeiro, originários de lesões angulares e lesões em "V", como pertencentes ao gênero Xanthomonas, e estão sumarizados na TABELA 1.

Suspensões bacterianas em solução salina das linhagens constantes da TABELA 1 foram testadas como antígenos em ensaios sorológicos de dupla difusão em ágar contra antissoro policlonal produzido para a linhagem IBSBF-1881 de X. a. pv. malvacearum, pertencente à coleção de antissoros do Instituto Biológico. As suspensões também foram testadas contra soro normal, controle negativo das reações sorológicas. Os resultados desses testes mostraram reação de identidade total entre as linhagens causadoras de lesões angulares típicas, aquelas causadoras de sintomas de crestamento foliar e a linhagem patotipo de Xam.

Além das linhagens IBSBF 1911, 1912, 1913 e 2003 isoladas de algodoeiro, as linhagens tipo de X. c. pv. campestris (IBSBF-1163^T), X. a. pv. axonopodis (IBSBF-1444^T) e a patotipo de X. a. pv. malvacearum (TABELA 1), foram incluídas para fins comparativos nos experimentos de amplificação por PCR. As extrações de DNAs foram efetuadas de acordo com Pitcher et al. (5) e os experimentos de amplificação da região espaçadora 16S-23S DNAr, de acordo com Destéfano & Rodrigues Neto (3). Os produtos de PCR obtidos foram digeridos com as seguintes enzimas de restrição: Afa I, Alu I, Dde I, Hae III e Hpa II. A observação dos perfis de restrição foi realizada por meio de eletroforese em gel de agarose 3%. Os géis foram tratados com brometo de etídeo (10 mg/mL), visualizados sob luz U.V. e fotografados em sistema digital. A amplificação da região espaçadora produziu um único fragmento de aproximadamente 1 kb para todas as linhagens testadas. As digestões dos produtos de PCR com Afa I geraram fragmentos de 500 e 490 pares de bases (pb); com Alu I, os fragmentos obtidos foram de aproximadamente 260, 210, 120 e 100 pb. Nas digestões com Dde I, os fragmentos foram de 310, 240, 120 e 100 pb. Hpa II e Hae III produziram fragmentos de 700 e 130 pb; e 510 e 280 pb, respectivamente (Figura 2). Em todos os casos, as linhagens IBSBF 1911, 1912, 1913 e 2003 isoladas de algodoeiro apresentaram perfis idênticos aos apresentados pela linhagem patotipo de X. a. pv. malvacearum (IBSBF 1733^P).

Nos testes para avaliação de sensibilidade a antibióticos foram utilizadas as linhagens IBSBF 1911, 1912, 1913 e 2003 e os seguintes produtos, diretamente incorporados ao meio NA: 1) sulfato de estreptomicina a 15 % + oxitetraciclina a 1,5 %; 2) oxitetraciclina a 3 % + sulfato de cobre tribásico a 40 %; 3) oxitetraciclina a 20 %; e 4) kasugamicina a 2 %, nas concentrações de 100, 250 e 500 ppm de princípio ativo. Quatro placas por tratamento/concentração com os diferentes antibióticos foram semeadas, separadamente, utilizando-se 0,l mL das suspensões bacterianas de cada linhagem (ca. 10⁸ UFC/mL). Placas-testemunha não receberam nenhum produto. Leituras foram realizadas diariamente até 10 dias após o plaqueamento, sendo avaliado o crescimento ou não de colônias bacterianas. As quatro linhagens avaliadas mostraram-se sensíveis aos produtos e às dosagens empregadas. Entretanto, considerando a existência de relatos de resistência natural a antibióticos em X. a. pv. malvacearum, entre eles a estreptomicina e a oxitetraciclina, já descritos desde a década de 60 (1, 2, 4), e que em outros países antibióticos vêm sendo empregados no controle de X. a. pv. malvacearum, tanto no tratamento de sementes quanto em pulverização de plantas, deve-se tomar precauções para evitar seleção de populações bacterianas resistentes.

Com base nos resultados dos testes de patogenicidade, bioquímicos, culturais, sorológicos e moleculares efetuados, confirma-se a identidade dos isolados como Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum em algodoeiro, causando sintomas de crestamento foliar, além da usual mancha angular.

Data de chegada: 16/05/2006.

Aceito para publicação em: 11/01/2008

Autor para correspondência: Valdemar A. Malavolta Jr.

• 1. Brinkerhoff, L.A. Variability of Xanthomonas malvacearum: the cotton bacterial blight pathogen. Stillwater: Oklahoma State University, 1963. 95p. (Technical Bulletin T-98).
• 2. Brinkerhoff, L.A. Variation in Xanthomonas malvacearum and its relation to control. Annual Review of Phytopathology, Palo Alto, v.8, p.85-110, 1970.
• 3. Destéfano, S.A.L ; Rodrigues Neto, J. Rapid differentiation of Xanthomonas strains causing disease in citrus plants based on polymerase chain reaction-amplified ribosomal dna spacer polymorphisms. Summa Phytopathologica, v.28, n.2, p.167-172, 2002.
• 4. Nafade, S.D.; Verma, J.P. Drug resistant mutants of Xanthomonas campestris pv. malvacearum Indian Phytopathology, New Delhi, v.38, p.74-80, 1985.
• 5. Pitcher, D.G.; Saunders, N.A., Owen, R.J. Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Letters of Applied Microbiology, Oxford, v.8, p.151-156, 1989.
• 6. Pizzinatto, M.A.; Malavolta Jr., V.A.; Cia, E. Crestamento foliar em algodão, novo sintoma causado por Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum Summa Phytopathologica, Botucatu, v.30, p.128, 2004.
• 7. Schaad, N.W.; Jones, J.B.; Lacy, G.H. Xanthomonas In: Schaad, N.W.; Jones, J.B.; Chun, W. (Eds.). Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. 3^th, Saint Paul: The American Phytopathological Society, 2001. p.175-200.
• 8. Smith, E.F. The angular leaf-spot of cotton. In: Bacterial diseases of plants. Philadelphia: W.B. Saunders, , 1920. p.314-339.

Crestamento foliar, nova sintomatologia em algodoeiro causada por Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum

Cotton leaf blight, a new symptomatology caused by Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  31 Jul 2008
• Data do Fascículo
  Jun 2008

Histórico

• Recebido
  16 Maio 2006
• Aceito
  11 Jan 2008