Análise comparativa da região codificadora para a proteína capsidial de isolados de PepYMV e PVY coletados em pimentão

Moura, Monika Fecury; Marubayashi, Julio Massaharu; Mituti, Tatiana; Gioria, Ricardo; Kobori, Romulo Fujito; Pavan, Marcelo Agenor; Krause-Sakate, Renate

doi:10.1590/S0100-54052012000100017

Resumos

O Potato virus Y (PVY) e Pepper yellow mosaic virus (PepYMV) são as únicas espécies de potyvirus encontradas em pimenta e pimentão no Brasil. A região codificadora para a proteína capsidial de isolados de PepYMV e PVY coletados em pimentão, foi avaliada quanto à variabilidade e presença de motivos específicos aos potyvirus. A identidade da seqüência de aminoácidos na CP entre os isolados de PepYMV foi de 93% a 100%, enquanto que para os de PVY 94% a 98%. Entre os vírus esta variou de 73% a 79%. Foi observada variabilidade nas regiões conservadas da CP. Todos os isolados de PepYMV seqüenciados não apresentaram o motivo DAG na CP, relacionada a transmissão dos vírus por afídeos, enquanto que para as seqüências obtidas de PVY foi observada. Demais domínios como MVWCIENG, ENTERH, QMKAAA e PYMPRYG foram verificadas em ambas espécies.

pimentão; variabilidade; Potyvirus

Potato virus Y (PVY) and Pepper yellow mosaic virus (PepYMV) are the only potyvirus species found in pepper and sweetpepper in Brazil. The region encoding the coat protein of PVY and PepYMV isolates collected in sweetpepper was evaluated for the presence of specific motifs of potyviruses. The identity of the amino acid sequence in CP among PepYMV isolates was 93% to 100%, while for PVY was 94% to 98%. Among the viruses that ranged from 73% to 79%. It was observed variability in the conserved regions of the CP. All PepYMV isolates sequenced did not show the DAG motif in the CP, related to virus transmission by aphids, while for sequences of PVY this motif was observed. Other motifs, such MVWCIENG, ENTERH, QMKAAA and PYMPRYG were found in both species.

sweet pepper; variability; Potyvirus

NOTAS CIENTÍFICAS

Análise comparativa da região codificadora para a proteína capsidial de isolados de PepYMV e PVY coletados em pimentão

Comparative analysis of coding region for the coat protein of PepYMV and PVY isolates collected in sweetpepper

Monika Fecury Moura; Julio Massaharu Marubayashi; Tatiana Mituti; Ricardo Gioria; Romulo Fujito Kobori; Marcelo Agenor Pavan; Renate Krause-Sakate^* * Autor para correspondência: Renate Krause-Sakate ( renatekrause@fca.unesp.br)

UNESP-FCA (Botucatu), Rua José Barbosa de Barros, 1780, Departamento de Defesa Fitossanitária - Laboratório de Virologia Vegetal

RESUMO

O Potato virus Y (PVY) e Pepper yellow mosaic virus (PepYMV) são as únicas espécies de potyvirus encontradas em pimenta e pimentão no Brasil. A região codificadora para a proteína capsidial de isolados de PepYMV e PVY coletados em pimentão, foi avaliada quanto à variabilidade e presença de motivos específicos aos potyvirus. A identidade da seqüência de aminoácidos na CP entre os isolados de PepYMV foi de 93% a 100%, enquanto que para os de PVY 94% a 98%. Entre os vírus esta variou de 73% a 79%. Foi observada variabilidade nas regiões conservadas da CP. Todos os isolados de PepYMV seqüenciados não apresentaram o motivo DAG na CP, relacionada a transmissão dos vírus por afídeos, enquanto que para as seqüências obtidas de PVY foi observada. Demais domínios como MVWCIENG, ENTERH, QMKAAA e PYMPRYG foram verificadas em ambas espécies.

Palavras-chave adicionais: pimentão, variabilidade, Potyvirus

ABSTRACT

Potato virus Y (PVY) and Pepper yellow mosaic virus (PepYMV) are the only potyvirus species found in pepper and sweetpepper in Brazil. The region encoding the coat protein of PVY and PepYMV isolates collected in sweetpepper was evaluated for the presence of specific motifs of potyviruses. The identity of the amino acid sequence in CP among PepYMV isolates was 93% to 100%, while for PVY was 94% to 98%. Among the viruses that ranged from 73% to 79%. It was observed variability in the conserved regions of the CP. All PepYMV isolates sequenced did not show the DAG motif in the CP, related to virus transmission by aphids, while for sequences of PVY this motif was observed. Other motifs, such MVWCIENG, ENTERH, QMKAAA and PYMPRYG were found in both species.

Keywords: sweet pepper, variability, Potyvirus

O pimentão (Capsicum annuum L.) é uma hortaliça cultivada em todo o Brasil, e encontra-se entre as dez olerícolas mais consumidas no país. A produção de pimentão é predominantemente em campo aberto, sendo que o Estado de São Paulo abrange cerca de 23,70% da área cultivada brasileira que é de 12.000 ha (11).

A suscetibilidade do pimentão a problemas fitossanitários causados por vírus ocasiona graves problemas à cultura. Entre os principais vírus do gênero Potyvirus pode-se citar Potato virus Y (PVY), Pepper mottle virus (PepMoV), Tobacco etch virus (TEV), Pepper veinal mottle virus (PVMV) e Chilli veinal mottle virus (ChiVMV) (5,8) e Pepper yellow mosaic virus (PepYMV) (10), sendo que até o momento somente o PVY e o PepYMV são descritas no Brasil. O PVY no Brasil foi observado em pimentão pela primeira vez na década de 50 (6) e o PeYMV em 2002 (10). Ambos vírus são sorologicamente relacionados (7), e causam sintomas de mosaico indistinguíveis, tornando-os de difícil identificação visual.

Um dos critérios taxonômicos para classificação de espécies no gênero Potyvirus é comparação da identidade de sequência de aminoácidos codificadora para proteína capsidial (CP), que sendo inferior a 80%, classifica isolados em diferentes espécies (3).

Neste trabalho foi analisada a CP de uma coleção de isolados de potyvirus provenientes das seguintes áreas produtoras de pimentão no Estado de São Paulo: Iacanga, Piraju, Lins e Mogi-Mirim. O RNA total foi extraído a partir de plantas de fumo (Nicotiana tabacum cv. TNN), mantidas em casa de vegetação, utilizando-se o método de Bertheau (4) ou pelo kit de extração Total RNA Purification Norgen, seguindo as recomendações do fabricante. Para amplificação da CP tanto de PVY como PepYMV foi desenhado um par de oligonucleotídeos iniciadores denominados PepNib (5' GWTSGYYGMMTTGGATGATG 3') e PepUTR (5' AGTAGTACAGGAAAAGCC 3') que amplifica a região codificadora para a proteína capsidial (960 nts). A reação de RT-PCR para PVY e PepYMV foi realizada em uma só etapa e foram utilizados os Kits de PCR Master Mix das marcas PROMEGA, AMPLIQON e FERMENTAS. Para um volume final de 25 µL foram adicionados: 5 µL de produto de extração de RNA, 12,5 µL de tampão Master Mix, 1mM de cada oligonucleotídeo iniciador, 1 unidade da transcriptase reversa AMV (Avian myeloblastosis virus, Promega, 15 u/µl) e água DEPC para completar o volume. O ciclo utilizado no termociclador (Mastercycler Gradient - Eppendorf) consistiu em 30 minutos a 42 ºC, seguido de 2 minutos à 95 ºC e 39 ciclos de 92 ºC/60 segundos, 53 ºC/1 minuto e 72 ºC/90 segundos e finalizando com 72 ºC/10 minutos. Foram retirados 5 µL da reação de RT-PCR para análise em gel de agarose a 1% em tampão TBE (0,1 M de ácido bórico, 0,02 mM EDTA pH 8,3). Utilizou-se o marcador 1kb Ladder da Invitrogen.

A região codificadora para a proteína capsidial de 8 amostras foi clonada no vetor comercial pGEM-T Easy (Promega). Inicialmente, os fragmentos obtidos por RT-PCR foram purificados através dos Kits comerciais Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) ou QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). A reação de ligação foi realizada adicionando-se 4 µL de fragmento, 50 ng/µL de vetor, T4 DNA ligase (10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 1mM DTT, 0,1mM EDTA, 50% glycerol), 5 µL do tampão de ligação (60mM Tris-HCl, 20nM MgCl_2, 20 DTT, 2mM ATP, 10% PEG). A reação foi deixada durante a noite a 4 ºC. O vetor foi eletroporado em células competentes de Escherichia coli da estirpe XL1. Para verificar a presença do fragmento nos plasmídeos foi realizada uma clivagem com a enzima de restrição EcoR1 (Invitrogen) por 1h a 37 ºC. As amostras com fragmento de tamanho desejado foram selecionadas para extração do plasmídeo pelo QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), de acordo com as especificações do fabricante.

Para alguns isolados não foi necessário clonar o fragmento para posterior sequenciamento. A análise das sequencias foi realizada pelo programa Mega 4. 1 (12) e CLUSTAL Interative W (13).

Foram obtidas dez sequencias completas para PepYMV e duas para PVY. Os dois isolados de PVY apresentaram 94% de identidade de aminoácidos com a sequencia de PVY depositada no GenBank sob numero PVY-LYE84.2. A identidade entre os isolados de PVY e PepYMV variou de 73% a 79%. Os isolados de PepYMV apresentaram variações de porcentagem de identidade de aminoácidos de 93% a 100% entre si (Quadro 1).

Foram também analisados outros domínios específicos aos potyvirus (14). O domínio E(N/D)TERH (seqüência de nucleotídeos GARRAYACDGARMGNCAYRC) encontrada na CP dos potyvírus é considerado o mais conservado seguido pelos domímios QMKAAA, YAFDFYE, MVWCI(E/D)NG, V(W/T)MMDG(D/E/N), (P/R/A)YMPRYG e (A/S)SYN(ED)VD. As seqüências de aminoácidos ENTERH, QMKAAA, MVWCIENG e PYMPRTG foram observadas na região codificadora para a proteína capsidial dos isolados analisados de PVY e PepYMV. O domínio YAFDFYE foi observado em todas as seqüências, exceto para o isolado 234-23q de PepYMV em que foi substituído pela sequencia HAFDFYE. Para todos os isolados de PepYMV observou-se a falta da sequencia de aminoácidos DAG (Asparagina - Asp, Alanina - Ala, glicina - Gly) na região N-terminal da CP, altamente conservada entre os potyvirus e relacionada com a transmissão dos potyvirus por afídeos (1, 2). A seqüência DAG foi detectada em ambos os isolados de PVY analisados (Figura 1). Para PepYMV, este motivo não é essencial para transmissão pelos afídeos uma vez que transmissão pelas espécies Aphis gossypii e Myzus persicae já foi observada para um isolado de PepYMV (9). (Figura 1).

Neste trabalho foram evidenciadas as principais diferenças moleculares entre as CPs do PepYMV e PVY. A maioria dos domínios foram encontrados em ambas espécies, porém a que se destaca é a ausência do motivo DAG em todas as sequencias de PepYMV até então seqüenciadas.

Agradecimentos

À FAPESP pelo suporte financeiro e CAPES pela concessão da bolsa de mestrado para a primeira autora.

Data de chegada: 30/05/2011

Aceito para publicação em: 13/02/2012

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Autor para correspondência: Renate Krause-Sakate (

renatekrause@fca.unesp.br)

Datas de Publicação

Publicação nesta coleção
10 Abr 2012
Data do Fascículo
Mar 2012

Histórico

Recebido
30 Maio 2011
Aceito
13 Fev 2012

This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

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