Um isolado atípico do Lettuce mosaic virus que contorna o gene mo1² em alface

An atypical Lettuce mosaic virus isolate breaking mo1² gene in lettuce

RESUMO

A alface (Lactuca sativa L.) pertencente à família Asteraceae e é uma das hortaliças mais consumidas no Brasil. O Lettuce mosaic virus (LMV) é um dos vírus mais importantes da cultura e, atualmente, a principal forma de controle é a utilização de genótipos portadores do gene de tolerância mol¹ e mo1². Um isolado de LMV proveniente de Botucatu (SP), denominado LMV-Bot, foi identificado quanto as suas características biológicas e moleculares. Ao ser inoculado nas variedades de alface diferenciadoras de patótipos de LMV em alface (‘Ithaca - gene Mo’, ‘Malika - mo1¹’, ‘Vanguard 75 – Mo e mo1²’ e ‘Salinas 88 - mo1²’), o LMV-Bot induziu sintomas somente em ‘Salinas 88’. A porção N’ terminal que codifica a proteína capsidial foi amplificada, sequenciada e seu posicionamento filogenético revelou similaridade com dois isolados brasileiros denominados Br6 e A435 e também com um coletado na França (Fr4). Porém, o LMV-Bot não se enquadrou no sub-grupo Most e Common. Os resultados sugerem que apesar de raros, isolados atípicos de LMV são encontrados na natureza infectando alface, e podem contornar o gene de resistência mol².

Palavras-chave
alface; LMV; patótipo

ABSTRACT

Lettuce (Lactuca sativa L.) belongs to the Asteraceae family and is one of the most consumed vegetables in Brazil. Lettuce mosaic virus (LMV) an important virus for this crop and, currently, its main control form is based on the utilization of genotypes carrying the tolerance gene mol¹ and mol². A LMV isolate from Botucatu (SP), named LMV-Bot, was identified considering its biological and molecular characteristics. When inoculated in distinctive lettuce varieties that classifies LMV pathotypes (‘Ithaca - Mo gene’, ‘Malika – mol¹’ ‘Vanguard 75 - Mo and mol²’ and ‘Salinas 88 - mo1²’), LMV-Bot induced symptoms only in ‘Salinas 88’. The N’ terminal coding region for the capsid protein was amplified and sequenced, and its phylogenetic position revealed similarity to two Brazilian isolates named BR6 and A435 and to another one from France (FR4). However, LMV-Bot did not fit in the sub-group Most and Common. Results suggest that, although rare, atypical isolates of LMV are found in nature infecting lettuce and can break the resistance gene mol².

Keywords
lettuce; LMV; pathotype

A alface é uma das hortaliças mais cultivadas no mundo. No Brasil, a região sudeste concentra a maior produção, sendo o estado de São Paulo o principal produtor (¹). Diante da monocultura intensiva, a cultura da alface é acometida por diversos problemas fitossanitários, entre eles estão as doenças causadas por vírus, sendo o mosaico do alface, causado pelo Lettuce mosaic virus (LMV), é uma das principais doenças (⁷, ⁵). Este vírus encontra-se disseminado por todo o mundo, devido ao intercâmbio de sementes infectadas (⁴). Atualmente, os isolados de LMV são divididos em dois sub-grupos denominados LMV-Common e LMV-Most. Isolados de LMV-Most têm a capacidade de superar a resistência conferida pelos genes mol² e mol² em alface e são eficientemente transmitidos por semente. Já os isolados de LMV-Common não infectam cultivares portadoras dos genes mol² e mol² (⁷). Outra proposta de classificação de isolados do LMV utilizada é baseada na resposta biológica em cultivares de alface diferenciadoras para patótipos I, II, III, IV (⁸, ⁹).

Neste trabalho, um isolado de LMV obtido de amostras de alface foi coletado em Botucatu pelo laboratório de Virologia da Faculdade de Ciências Agronômicas, Unesp-Botucatu, denominado LMV-Bot, foi caracterizado pela avaliação dos sintomas nas cultivares diferencias de alface e teve a porção N- terminal codificadora para a proteína capsidial sequenciada e analisada filogenéticamente.

Foram inoculadas as variedades de alface: ‘Salinas’, ‘Ithaca (Mo²)’, ‘Malika (mol²)’, ‘Salinas 88 (mol²)’ e ‘Vanguard 75 (mol², Mo2)’, que são capazes de diferenciar os isolados de LMV em quatro patótipos (⁸,⁹). Como inóculo, foram utilizadas folhas de alface ‘Trocadero’ infectadas com o LMV-Bot. As folhas foram maceradas (1:3 p/v) em almofariz contendo tampão de inoculação (fosfato de potássio 0,05 M pH 7,0), e adição de abrasivo carborundum 600 mesh. A inoculação foi realizada pela da fricção do extrato vegetal do inóculo sobre as folhas das variedades de alface diferenciadoras. Plantas de alface cultivar ‘Trocadero’ foram utilizadas como controle da eficiência da inoculação, pois são altamente suscetíveis ao LMV.

Das cultivares inoculadas, foi observado sintomas em Salinas, Trocadero e ‘Salinas 88’. A infecção viral foi confirmada a partir da extração do RNA total (²) aos 14 dias após a inoculação e posterior RT-PCR utilizando o Kit PCR Master Mix (Ampliqon), 1 unidade de AMV, 10 µM dos oligonucleotideos LMV 9171 (5’ GCGTTGATGTCGTCATCYTT 3’), e LMV 8894 (5’CCGTACATAGCIGARTGTGCT 3’), que amplificam um fragmento de 278 bp, relativas a “NIb” e “CP” do LMV (9). O produto amplificado foi enviado a empresa Macrogen, na Coréia do Sul, onde foi purificado e submetido a sequenciamento de nucleotídeos. As sequencias de nucleotídeos obtidas foram analisadas utilizando os programas Blastn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) e Mega 6.0 (¹⁰).

Após a expressão dos sintomas de clareamento de nervuras e manchas cloróticas (Figura 1A), as folhas de Salinas 88 foram inoculadas mecanicamente em Chenopodium quinoa, que induziu sintomas de lesões locais (Figura 1B), e posteriormente mosaico sistêmico típicos aos causados pelo LMV nesta hospedeira. As plantas das cultivares ‘Ithaca’, ‘Malika’ e ‘Vanguard 75’, inoculadas com o isolado LMV-Bot não desenvolveram sintomas. O vírus não foi detectado nestas plantas por RT-PCR, nem recuperado para C. quinoa.

Figura 1A
Alface ‘Salinas 88’ com sintoma de mosaico e clareamento das nervuras induzido pelo LMV-Bot; (B) C. quinoa, inoculada com o LMV-Bot apresentando lesões locais aos 14 dias após retroinoculação a partir de “Salinas 88”.

Através das análises das sequências de nucleotídeos utilizando os programas Blastn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) e Mega 6.0 (10), foi constatado que o isolado LMV-Bot não apresentou similaridade nucleotídica com os isolados de LMV dos subgrupos Most e Common. Trata-se de um isolado com identidade de 93% com o isolado da França “Fr4” (acesso no GenBank n. AF369010), 92% com o isolado A435 (acesso n. AF368954) e 90% com o isolado Br6 (acesso n. AF368958), ambos oriundos do Brasil. O posicionamento na árvore filogenética também reflete claramente que o LMV-Bot não pertencente a nenhum dos dois grandes sub-grupos descritos (Figura 2).

Os resultados da inoculação em variedades diferencias de alface associadas com a análise do sequenciamento de nucleotídeos da porção N’ terminal da região codificadora para a proteína capsidial, permitiram concluir que o LMV-Bot é um isolado atípico de LMV, estando este resultado de acordo com trabalhos já realizados no Brasil (³, ⁵, ⁶). Este isolado, por infectar e causar sintomas em variedades portadoras do gene mol^l não é considerado no momento um problema no Brasil, uma vez que há a disponibilidade de variedades comerciais de alface que possuem o gene mo1². O LMV é um dos principais vírus que infecta alface no Brasil e no mundo, e de acordo com levantamentos realizados, a sua incidência vem diminuindo no Estado de São Paulo, devido o uso prioritário de variedades tolerantes (⁹, ³). Mesmo assim, o seu monitoramento no campo é uma prática importante a fim de detectar epidemias ou identificar previamente o surgimento de novos patótipos que possam infectar as variedades tolerantes existentes no mercado, evitando assim novas perdas econômicas.

Figura 2
Análise filogenética obtida a partir da utilização do programa Mega 6.0 com os isolados de LMV, utilizando “neighbor joining”, com valor de Bootstrap de 2000.

REFERÊNCIAS

• ¹
  Anuário da Agricultura Brasileira – AGRIANUAL. Alface. São Paulo: FNP Consultoria & Comércio, p. 127-128, 2015.
• ²
  Bertheau, Y.; Frechon D.; Toth, I.K.; Hyman, L.J. DNA amplification by polymerase chain reaction (PCR). In: Perombolon, M.C.M.; Van Der Wolff, J.M. Methods for the detection and quantification of Erwinia carotovora subsp. atroseptica on potatoes Aberdeen: Scottish Crop Research Institute, 1998.
• ³
  De Marchi, B.R.; Spadotti, D.M.A.; Oliveira, M.L.; Sanches, M.M.; Krause-Sakate, R.; Pavan, M.A. Levantamento revela a predominância do Lettuce mottle virus em três regiões produtoras de alface no Estado de São Paulo. Summa Phytopathologica, Botucatu, v.38, n.3, p.245-247, 2012.
• ⁴
  Dinant, S.; Lot, H. Lettuce Mosaic Virus. Plant Pathology, Sutton Bonington, v.41, p.528-542, 1992.
• ⁵
  Firmino, A.C.; Krause-Sakate, R.; Pavan, M.A.; Silva, N.; Hanai, S.M.; Anbo, R.H.; NietzsheI, T.; Le Gall O. Prevalence of Lettuce mosaic virus - common strain on three lettuce producing areas from São Paulo State. Summa Phytopathologica, Botucatu, v.34, n.2, p.161-163, 2008.
• ⁶
  Krause-Sakate, R.; Mello, R.N.; Pavan, M.A.; Zambolim, E.M.; Carvalho, M.G.; Le Gall, O.; Zerbini, F.M. Molecular characterization of two Brazilian isolates of Lettuce mosaic virus with distinct biological properties. Fitopatologia Brasileira, Brasília, DF, v.26, p.153-157, 2001.
• ⁷
  Krause-Sakate, R.; Le Gall, O.; Fakhfakh, H.; Peypelut, M.; Marrakchi, M.; Varveri, C.; Pavan, M.A.; Souche, S.; Hervé Lot; Zerbini, F.M.; Candresse, T. Molecular characterization of Lettuce mosaic virus field isolates reveals the emergence and spread of a resistance-breaking strain, LMV-Most. Phytopathology, Davis, v.92, p.563-571, 2002.
• ⁸
  Pink, D.A.C.; Kostava, D.; Walkey, D.G.A. Differentation of pathotypes of lettuce mosaic virus. Plant Pathology, Sutton Bonington, v.41, p.5-12, 1992.
• ⁹
  Revers, F.; Lot, H; Souche, S.; Legall, O; Candresse, T.; Dunez, J. Biological and molecular variability of lettuce mosaic virus isolates. Phytopathology, Davis, v.83, p.397-403, 1997.
• ¹⁰
  Tamura, K.; Stecher, G.; Peterson, D.; Filipski, A.; Kumar, S. MEGA 6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Bersion 6.0. Molecular Biology and Evolution, Oxford, v.30, p.2725-2729, 2013.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Jan-Mar 2018

Histórico

• Recebido
  19 Fev 2016
• Aceito
  09 Maio 2017