Detecção de Leifsonia xyli subsp. xyli em mudas pré-brotadas de cana-de-açúcar

Detection of Leifsonia xyli subsp. xyli in presprouted seedcane

RESUMO

A primeira grande mudança nos últimos anos do setor sucroenergético brasileiro ocorreu quando a colheita mecânica substituiu os cortes manuais de canas queimadas. A segunda transformação começou com a mecanização de materiais de plantio e isso só está sendo possível pelo uso da nova metodologia: mudas pré-brotada (MPB). Para garantir o sucesso desta inovação é fundamental o uso de MPB sadia, especialmente contra a doença raquitismo-das-soqueiras, causada pela bactéria fastidiosa Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx). Esta doença é considerada a mais importante da cultura e o único meio de introdução para novas áreas é o plantio de materiais propagativos contaminados. Portanto, o objetivo deste trabalho foi o de desenvolver um exame diagnóstico para a detecção precoce de Lxx em MPB. No primeiro ensaio, a eficácia de quatro pares de primers (Cxx ITSF # 5/Cxx ITSr # 5, Cxx1/ Cxx2, C2F/C2R, LX23SF/LX23SR) foi examinada para identificar plantas adultas contaminadas com diferentes títulos de Lxx., nas condições originais, bem como em adaptações propostas nesse estudo, as nossas próprias modificações. Para isso foram utilizadas cana-de-açúcar adulta. No segundo ensaio, os dois melhores primers/condições foram testadas em MPB de 45 e 60 dias de idade derivados de materiais contaminados com Lxx. Dados do presente estudo mostraram que o par de primers CXX ITSF # 5/Cxx ITSr # 5 sob nossas modificações foi o mais acurado, uma vez que Lxx foi detectada em todos os 52 MPB de 45 dias originadas de materiais propagativos contaminados com 10⁹ até 10⁶ UFC / mL de Lxx.

Palavras-chave
raquitismo-das-soqueiras; disseminação; controle; diagnóstico

ABSTRACT

The first great change in recent years in the Brazilian sugarcane industry occurred when mechanical harvest replaced manual cuttings of burned canes. The second transformation has started with mechanization of planting materials thanks to new methodology such as presprouted seedcane (MPB in Portuguese). To ensure the success of such innovation, the use of healthy MPB is fundamental, especially against ratoon stunt, caused by Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx). This is considered the most important disease of sugarcane and the only means of introducing it to new areas is by the planting of contaminated propagative materials. Therefore, the aim of this study was to develop a diagnostic assay for early detection of Lxx in MPB. In the first assay, the efficacy of four primer pairs (Cxx ITSf#5/Cxx ITSr#5, Cxx1/Cxx2, C2F/C2R, LX23SF/LX23SR) was examined to identify adult plants contaminated with various titers of Lxx, under original conditions, as well as adapted conditions proposed in this study, our own modifications. Thus, adult sugarcane was used. In the second assay, the two best primers/conditions were tested in 45- and 60-day-old MPB derived from Lxx-contaminated materials. Data of the present study showed that the primer pair CXX ITSF # 5/CxxITSr # 5, under our modification conditions, was the most accurate since Lxx was detected in all 52 MPB aged 45 days from propagative materials contaminated with 10⁹ to 10⁶ CFU/mL.

Keywords
ratoon stunting; dissemination; control; diagnostic

Através da cana-de-açúcar podem-se obter vários produtos: açúcar, que é consumido mundialmente; o etanol, que é um combustível sustentável, sendo que o etanol produzido de cana tem maior rendimento quando comparada com o etanol de milho; e também energia elétrica, que é uma ótima opção sustentável, principalmente comparado com as termoelétricas (¹).

O Brasil é o maior produtor de cana-de-açúcar com a safra 2016/17 estimada em mais de 690 milhões de toneladas (⁵). A produção de cana tem crescido a cada ano, sendo que na safra de 2015/16 houve um aumento de 3,1% e na safra de 2016/2017 de 3,8%. Entretanto a produtividade não cresce na mesma proporção, tendo crescido apenas 2,4% em 2015 e sofrendo decréscimo de 1% em 2016 (⁴, ⁵), ou seja, o aumento de produção está ocorrendo mais pelo aumento de área do que por aumento de produtividade.

Uma das causas de declínio de produtividade da cana é o raquitismo-da-soqueira (RDS), que tem como agente causal a bactéria fastidiosa Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) que é uma das principais doenças da cultura. Em um estudo nos Estados Unidos, o RDS causou uma quebra que variou de 9 a 33% em sete das oito variedades testadas (¹¹). Em outro experimento na Austrália a quebra variou de 12 a 37% (²⁴). De acordo com Viswanathan (²³) na Índia o declínio na produtividade foi de até 50%. No Brasil, em um experimento conduzido por Chagas & Matsuoka (²) a quebra foi de 21% e em outro experimento de 2009, variou de 1,6 a 27,5% (¹⁰).

Como a bactéria não possui vetor natural, a única forma de disseminação para novas áreas se dá por mudas infectadas e a transmissão para as plantas sadias ocorre através de facões e implementos agrícolas (¹²). No Brasil, em busca de adequar as leis ambientais, diminuir custos e aumentar a qualidade, a produção de cana vem sendo mecanizada. Essa transformação do setor se iniciou na colheita e atualmente, está em processo de mecanização a fase do plantio com o emprego de mudas pré-brotadas (MPB) que traz grandes vantagens, como mudas de alta qualidade e maior uniformidade do canavial, além de minimizar a disseminação de pragas de solo e reduzir até 90% da quantidade de mudas que vão para o campo (¹³).

Para garantir o sucesso desta inovação e que seu emprego ocorra em todo o Brasil, é necessário que as MPB não sejam disseminadoras de patógenos. Comstock et al. (³) em sua pesquisa comprovou que quanto maior o inóculo inicial de Lxx, maior a incidência de RDS. Sendo assim, o sucesso no controle da Lxx está na efetividade da exclusão deste patógeno, pois uma vez instalada, a doença causa declínio da produtividade, podendo chegar ao ponto de ser inviável a manutenção do canavial, tendo como consequência a realização da reforma precoce (¹⁴).

Como a Lxx é de natureza fastidiosa, o RDS não apresenta sintomas característicos, tornando-se necessária a diagnose laboratorial (¹⁹). Atualmente a detecção da Lxx para exame de rotina tem sido feita por sorologia, que tem como material de análise a seiva da cana-de-açúcar, entretanto, como as MPB vão para o campo com 60 dias (¹³), não é possível coletar seiva nesta fase.

Por isso o setor necessita de um método mais refinado e acessível, que possibilite a detecção antes das mudas irem para o campo. Uma alternativa é o uso da técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction), que é conhecida pela sua eficácia e sensibilidade. Atualmente temos diferentes primers específicos para Lxx, entretanto não há um protocolo para diagnose precoce da bactéria em MPB. Sendo assim, nosso objetivo foi desenvolver um teste diagnóstico para detecção de Lxx em MPB de cana-de-açúcar.

MATERIAIS E MÉTODOS

Extração de DNA

A extração de DNA total foi realizada empregando-se o método CTAB (¹⁶). Para as canas adultas, o tecido do entrenó foi o utilizado para a extração do DNA e nas MPB, o tecido do nó (Tabela 1).

Tabela 1
Lista de DNA utilizados nos testes de sensibilidade, especificidade e acurácia dos primers específicos para Leifsonia xyli subsp. xyli.

Hospedeiro	Patogeno	Concentração patógeno	Localização
Cana-de-açúcar	Leifsonia xyli subsp. xyli	106 UFC/mL	Araras, SP
Cana-de-açúcar	Leifsonia xyli subsp. xyli	107 UFC/mL	Araras, SP
Cana-de-açúcar	Leifsonia xyli subsp. xyli	108 UFC/mL	Araras, SP
Cana-de-açúcar	Leifsonia xyli subsp. xyli	109 UFC/mL	Araras, SP
Cana-de-açúcar	S.P	Neg. Dot-ELISA	Araras, SP
Cana-de-açúcar	S.P	Neg. Dot-ELISA	Araras, SP
Cana-de-açúcar	S.P	Neg. Dot-ELISA	Araras, SP
Cana-de-açúcar	S.P	Neg. Dot-ELISA	Araras, SP
MPB com 45 dias	Leifsonia xyli subsp. xyli	106 UFC/mL	Araras, SP
MPB com 45 dias	Leifsonia xyli subsp. xyli	107 UFC/mL	Araras, SP
MPB com 45 dias	Leifsonia xyli subsp. xyli	108 UFC/mL	Araras, SP
MPB com 45 dias	Leifsonia xyli subsp. xyli	109 UFC/mL	Araras, SP
MPB com 60 dias	Leifsonia xyli subsp. xyli	106 UFC/mL	Araras, SP
MPB com 60 dias	Leifsonia xyli subsp. xyli	107 UFC/mL	Araras, SP
MPB com 60 dias	Leifsonia xyli subsp. xyli	108 UFC/mL	Araras, SP
MPB com 60 dias	Leifsonia xyli subsp. xyli	109 UFC/mL	Araras, SP

• MPB = Mudas pré-brotadas; S.P = Sem patógeno.

Diagnose Molecular

A diagnose molecular foi realizada empregando-se quatro pares de primers, a saber Cxx1 (5’ – CCG AAG TGA GCA GAT TGA CC) e Cxx2 (5’ – ACC CTG TGT TGT TTT CAA CG) (17), CxxITSf#5 (5’ – TCA ACG CAG AGA TTG TCC A) e CxxITSr#5 (5’ – GTA CGG GCG GTA CCT TTT C) (7), LX23SF (5’ – ACC TCC TTT CTA AGG AGC) e LX23SR (5’ – TGA ATT GAT CGG CTC ACC) (9) e C2F (5’ – CGA GTT TGG GTT TCT GCC TGC) e C2R (5’ – AGG TGG CAG CGA CAA CGG TGC) (20). Esses quatro pares de primers foram empregados nas condições de amplificação originais e para os três primeiros pares de primers, uma segunda condição foi adaptada, incorporando-se as condições de Taylor et al. (²⁰) acrescido de 1ºC na temperatura de anelamento. Já a adaptação para o primer de Taylor et al. (²⁰) foi a incorporação das condições de amplificação de Pan et al. (¹⁷).

Parâmetros de avaliação da eficácia dos primers

O desempenho dos primers e suas adaptações foi avaliado em três etapas. Na primeira etapa, foi utilizado materiais com diferentes títulos da Lxx (Tabela 1), cujas concentrações foram determinadas utilizando a técnica sorológica de Dot-ELISA, onde o limite mínimo para detecção é de 10⁶ UFC/ml (22). Nessa etapa o parâmetro empregado foi sensibilidade, ou seja, a capacidade do primer de detectar indivíduos doentes. Na segunda, foi utilizado DNA de diferentes microrganismos (Tabela 1), patogênicos ou não à cana-de-açúcar e avaliado sua capacidade de identificar indivíduos sadios ou sem o patógeno (especificidade) e a porcentagem de acerto entre sensibilidade e especificidade (acurácia). Na última etapa, diluições seriadas a partir de DNA total com 10⁶ UFC/mL de Lxx, foram empregadas para a avaliação de sensibilidade.

Para análise de sensibilidade, especificidade e acurácia dos primers foram utilizadas as fórmulas:

$$\mathrm{Razão}\mathrm{FN}=\frac{\mathrm{FNx}100}{\mathrm{VP}+\mathrm{FN}}\mathrm{Razão}\mathrm{FN}=\frac{\mathrm{FNx}100}{\mathrm{VN}+\mathrm{FN}}\begin{array}{c}\mathrm{Sensibilidade}\mathrm{relativa}=\\ \mathrm{SE}(\%)\end{array}\frac{\mathrm{VPx}100}{\mathrm{VN}+\mathrm{FP}}$$

$$\begin{array}{c}\mathrm{Especificidade}\mathrm{relativa}=\\ \mathrm{SP}(\%)\end{array}\frac{\mathrm{VNx}100}{\mathrm{VN}+\mathrm{FP}}\mathrm{Acurácia}\mathrm{relativa}=(\mathrm{VP}+\mathrm{VN})x100$$

$$\begin{gathered} \mathrm{Legenda}: \\ \mathrm{VP}:\mathrm{Resultado}\mathrm{verdadeiramente}\mathrm{positivo}\mathrm{FN}:\mathrm{Falso}-\mathrm{negativo} \\ \mathrm{VN}:\mathrm{Resultado}\mathrm{verdadeiramente}\mathrm{negativo}\mathrm{FP}:\mathrm{Falso}-\mathrm{positivo} \\ N:\mathrm{VP}+\mathrm{VN}+\mathrm{FN}+\mathrm{FP} \end{gathered}$$

Formação de MPB

Para a formação de MPB, foi empregado gemas individuais, originadas de canas com mais de 12 meses, com diferentes títulos de Lxx, determinadas pela técnica de Dot-ELISA conforme empregado anteriormente (²²) com antissoro produzido no laboratório empregando-se coelho. Esses materiais foram plantados em copos plásticos de 250 mL com substrato a base de casca de pinus e fibra de coco, mantidos em estufa e irrigados apenas com água por um período de 45 e 60 dias.

Validação dos primers

As duas combinações de primers e condição de amplificação que obtiveram os melhores resultados na diagnose molecular de canas adultas foram validadas em MPB de 45 e 60 dias (Tabela 1) através do parâmetro sensibilidade.

RESULTADOS

Seleção de primers:

Quando utilizado as condições de corrida recomendadas pelos autores, de um total de 12 amostras, nenhuma foi amplificada com os primers CxxITSf#5/CxxITSr#5, resultando em 12 amostras falso negativas para Lxx e com isso obtendo-se 0% de sensibilidade. Quando os primers LX23SF/LX23SR foram empregados uma amostra foi identificada, com os primers Cxx1/Cxx2 foram 6 amostras e com os primers C2F/C2R foram 10 amostras, que em porcentagem corresponderam a 8,3%; 50% e 83,3% de sensibilidade, respectivamente.

Após as adaptações nas condições de corrida dos primers, de um total de 12 amostras, nenhuma foi amplificada com os primers C2F/C2R, 8 com os primers LX23SF/LX23SR e 12 para cada um dos primers Cxx1/Cxx2 e CxxITSf#5/CxxITSr#5. Obtendo assim 0; 66,7, 100 e 100% de sensibilidade, respectivamente.

Com esses resultados, os primers Cxx1/Cxx2 e CxxITSf#5/CxxITSr#5, na condição de corrida adaptada 1, foram novamente desafiados utilizando os parâmetros especificidade e acurácia. Os resultados desse ensaio mostraram que todas as 18 amostras verdadeiramente negativas e todas as 10 verdadeiramente positivas foram corretamente identificadas. Esse resultado somado com a correta identificação das 12 amostras positivas da primeira etapa, demonstraram que esses primers tiveram 100% de especificidade e acurácia (Tabela 2).

Tabela 2
Eficiência da detecção molecular de Leifsonia xyli subsp. xyli.

Primer	Condição de amplificação do DNA	VP	VN	FN	FN	N	Sensibilidade relativa SE (%)	Especificidade relativa SP (%)	Acurácia relativa AC (%)
							VPx100/VP+FN	VNx100/ VN+FP	(VP+VN) x100/N
Cxx1 e Cxx2	Pan et al. (1998)	6	-	6	-	12	50,0	-	-
CxxITSf#5 e CxxITSr#5	Fegan et al. (1998)	0	-	12	-	12	0,0	-	-
C2F e C2R	Taylor et al. (2003)	10	-	2	-	12	83,3	-	-
	Gagliardi e Camargo							-	-
LX23SF e LX23SR	(2003)	1	-	11	-	12	8,3
Cxx1 e Cxx2	Adaptada 1	22	18	0	0	40	100,0	100	100
CxxITSf#5 e CxxITSr#5	Adaptada 1	22	18	0	0	40	100,0	100	100
C2F e C2R	Adaptada 1	0	-	12	-	12	0,0	-	-
LX23SF e LX23SR	Adaptada 2	8	-	4	-	12	66,7	-	-

• Sensibilidade = Verdadeiro Positivo X 100/ (Verdadeiro Positivo + Falso Negativo); Especificidade = Verdadeiro Negativo X 100/ (Verdadeiro Negativo + Falso Positivo); Acurácia = (Verdadeiro Positivo + Verdadeiro Negativo) X 100/ Total número de amostras; Adaptada 1= Corrida recomendado por Taylor et al. (2003) com aumento de 1°C no anelamento; Adaptada 2= Corrida recomendada por Pan et al. (1998).

Detecção de Lxx em DNA N4 (10⁶ UFC/mL) em diluição seriada

Os dois pares de primers que obtiveram 100% de sensibilidade, especificidade e acurácia, foram novamente desafiados utilizando diluição seriada de DNA total extraído de cana que estava infectada com Lxx na concentração N4 (10⁶ UFC/mL). Das 30 amostras testadas (somatória das três amostras de cada concentração desafiada), 20 foram amplificadas pelo par de primers Cxx1 e Cxx2 adaptado, sendo que somente na diluição limite de 1:15, ou seja 0,5x10⁵ UFC/mL todas as repetições foram identificadas. Já para os primers CxxITSf#5 e CxxITSr#5, na condição adaptada, a diluição para que todas as amostras positivas fossem identificadas foi de 1:50, ou seja 2 x 10⁴ UFCmL (Figura 1).

Figura 1
Gráfico da sensibilidade da detecção molecular de Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) em diluição seriada de DNA N4 (106 UFC/mL). N4= DNA total de cana-de-açúcar com Lxx na concentração de 10⁶ UFC/mL; Corrida adaptada= corrida recomendada por Taylor et al. (2003) com aumento de 1ºC no anelamento.

Validação dos primers e condição de corrida em MPB de 45 e 60 dias:

Em MPB de 60 dias, originadas de canas positivas para Lxx, de um total de 42 amostras, em 30 foi detectada a bactéria quando se utilizou o conjunto de primers Cxx1 e Cxx2, na condição de corrida adaptado, e 33 foram positivas para Lxx com os primers CxxITSf#5 e CxxITSr#5, na condição de corrida adaptado, obtendo 71,4% e 78,6% de sensibilidade, respectivamente (Tabela 3). De um total de 52 MPB de 45 dias, originadas de canas doente, a bactéria foi detectada em 35, quando se utilizou os primers Cxx1 e Cxx2, na condição de corrida adaptada, tendo como resultado final 67,3% de sensibilidade. E todas as 52 MPB de 45 dias foram positivas para a presença de Lxx, quando se utilizou os primers CxxITSf#5 e CxxITSr#5, na condição de corrida adaptado, obtendo 100% de sensibilidade (Tabela 3).

Tabela 3
Validação da detecção molecular em mudas-pré-brotadas (MPB) com raquitismo-das-soqueiras

Primer	Condição de amplificação do DNA	Idade MPB	VP	FP	N	Sensibilidade relativa SE (%)
						VPx100 VP+FN
Cxx1 e Cxx2	Adaptado	45 Dias	35	0	52	67,3
CxxITSf#5 e CxxITSr#5	Adaptado	45 Dias	52	0	52	100,0
Cxx1 e Cxx2	Adaptado	60 Dias	30	0	42	78,6
CxxITSf#5 e CxxITSr#5	Adaptado	45 Dias	33	0	42	78,6

• Sensibilidade = Verdadeiro Positivo X 100 / (Verdadeiro Positivo + Falso Negativo). Corrida adaptada= corrida recomendada por Taylor et al. (2003) com aumento de 1ºC no anelamento.

A análise estatística foi dispensada em todas essas análises, uma vez que para a detecção de Lxx é essencial a identificação de 100% das amostras com a bactéria, pois o controle se baseia na exclusão. Com isso, após a adaptação, foi possível obter uma combinação de primers e condição de corrida que apresentasse 100% de sensibilidade na detecção de Lxx, inclusive em MPB com idade de 45 dias. Os outros primers mesmo com taxa de mais de 60% de identificação, não são recomendados por apresentar escapes.

A reação de PCR realizada em MPB de 45 dias com os primers CxxITSf#5 e CxxITSr#5, na condição de corrida adaptado, resultou na amplificação de fragmentos de fácil identificação, com isso, não deixando dúvidas na visualização do fragmento e sem falsos negativos, independentemente da concentração da bactéria (Figura 2A). O mesmo não foi observado em MPB de 60 dias, que obtiveram falsos negativos (Figura 2B).

Figura 2
Detecção molecular de Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) em DNA total extraído de Mudas-pré-brotadas originadas de canas positivas para Lxx nas concentrações entre 10⁹ e 10⁶ UFC/mL. A= Gel de agarose corado com brometo de etídio (concentração de 0,5 µg.ml^-1) com resultado da detecção molecular em MPB de 45 dias usando os primers CxxITSf

DISCUSSÃO

Atualmente, existem três tipos de produtores de cana-de-açúcar em relação ao RDS: aqueles que não fazem qualquer controle da doença, os que apenas fazem a diagnose laboratorial em seu matrizeiro e aqueles que fazem a diagnose laboratorial do matrizeiro, juntamente com o controle do RDS pelo tratamento térmico. Nos casos em que diagnose laboratorial é feita, essa emprega a técnica sorológica, por apresentar maior praticidade em relação aos outros métodos de detecção e custo acessível ao setor produtivo.

Contaminação por Lxx em material propagativo de cana-de-açúcar tem sido um problema de longa data, visto que presença de Lxx foi observada em 23,6% das amostras recebidas para diagnóstico de rotina de RDS em 2009 (21). Esse índice foi ainda maior em 2010 e 2011, com um total de 27,1% e 25,8% respectivamente. Os números são ainda mais alarmantes se assumirmos que as amostras enviadas para análise laboratorial foram coletadas dos melhores talhões da usina, visto que o propósito é servir de viveiros de multiplicação.

Outro fato a se considerar, é que mesmo as amostras negativas pelo diagnóstico sorológico podem estar com a presença da bactéria, pois o limite de detecção da técnica Dot-ELISA é de 10⁶ UFC/mL (²¹). Com isso, os produtores que fazem apenas diagnóstico sorológico, podem estar usando materiais infectados para montar seu matrizeiro, tendo como consequência produção de mudas com a bactéria.

Os produtores que fazem o diagnóstico sorológico e o tratamento térmico de 52°C por 30 minutos também correm o risco de ter matrizeiro contaminado com Lxx. Isso porque tratamento térmico de 52°C por 30 minutos apresentou escape, onde controle de Lxx não foi total (⁸). Esses fatos aliado a natureza fastidiosa da bactéria fazem com que mudas contaminadas com Lxx estejam sendo produzidas, mesmo que as duas principais recomendações de controle de RSD estejam sendo realizadas.

Para o grupo de produtores que não fazem nenhum controle da Lxx, o nível de contaminação das mudas pode ser ainda mais preocupante, com índices de RDS ainda maiores do que os outros dois grupos de produtores. Levantamento sobre a incidência de RSD em lavouras comerciais do Centro Sul brasileiro mostraram que 9,4% dos 307 talhões com cana-planta examinadas e 32% das 50 usinas amostradas empregaram mudas contaminadas com Lxx em áreas de reforma (²²) revelando quão disseminada está a doença e a dificuldade de controle efetivo do problema.

Dentre os sistemas de produção de mudas recentemente desenvolvidas por diferentes empresas/institutos, a tecnologia MPB que foi produzida pelo IAC (Instituto Agronômico de Campinas) vem se destacando, sendo que uma das vantagens mencionada é a sanidade das mudas (¹³). No entanto, as limitações na identificação e no controle de Lxx mostra a importância de tecnologia desenvolvida no presente estudo para garantir a sanidade das mudas MPB, uma vez que RSD não apresenta nenhum sintoma da doença, especialmente nesta fase vegetativa, cuja consequência seria danosa para disseminação de Lxx durante a colheita (¹⁸).

Uma técnica que tem se mostrado efetiva na detecção de doenças é o Teste de PCR, pois é baseada unicamente na detecção da sequência de DNA do patógeno, onde a visualização de um fragmento de tamanho específico após o Teste de PCR, indicaria a presença do patógeno na amostra (²⁵). Para tanto, a escolha dos primers com melhor desempenho é essencial. Dentre os vários primers específicos para Lxx, quatro pares foram selecionados, baseados nos diferentes loci das regiões 16S e 23S e regiões codificadoras de proteínas para elaborar um protocolo de detecção precoce de Lxx em MPB: Cxx1 e Cxx2 (¹⁷), CxxITSf#5 e CxxITSr#5 (⁷), C2F e C2R (²) e LX23SF e LX23SR (⁹).

O parâmetro empregado para avalição do desempenho dos primers foi sensibilidade (Tabela 2). Isso porque nas diferenças entre os primers foi importante identificar o desempenho do marcador para detectar indivíduos doentes, para que a bactéria não seja disseminada para novas áreas.

Nas modificações realizadas nesse trabalho para aumentar a eficiência da detecção de Lxx incluíram ajustes nas quantidades dos reagentes e condições de corrida da reação de PCR, como quantidade de cloreto de magnésio, dNTP e Taq polimerase, além da temperatura de anelamento. Cloreto de magnésio é um componente crítico da reação de PCR, uma vez que algumas Taq polimerase são dependentes do magnésio. Além disso, os iniciadores de DNA e dNTP se ligam ao magnésio, com isso, a concentração de Mg depende da concentração de dNTP e DNA molde. O MgCl₂, Taq polimerase e dNTP em condições inadequadas reduziram o produto no Teste de PCR (¹⁵).

No processo de seleção do melhor par de primers, existiu a necessidade de que a detecção de Lxx fosse em MPB de 45 e 60 dias. Isso porque a idade da muda de 60 dias é a recomendada para o plantio no campo (¹⁴). Já mudas de 45 dias foram desafiadas, pois permitiria que os resultados da sanidade fossem conhecidos antes do plantio a campo. Como o MPB são constituídas basicamente por uma gema e seu respectivo nó (¹³), foi utilizado o tecido desse último para a extração do DNA, uma vez que nesta região há uma grande concentração de feixes vasculares por área (⁶).

A detecção de Lxx foi possível em MPB de 45 e 60 dias embora com desempenho melhor dos primers em MPB de 45 dias (Tabela 3), sugerindo que MPB ainda mais precoces possam ser empregados para análise de sanidade de Lxx, sem afetar a sensibilidade (Figura 2A e 2B).

Os resultados deste estudo demonstraram que os primers CxxITSf#5 e CxxITSr#5 nas condições adaptadas no presente estudo foi o mais sensível, específico e acurado para detecção de Lxx, com uma taxa de 100% para todos esses parâmetrosem MPB de 45 dias.

Para doenças fastidiosas em citros já existe legislação estadual para comercialização de mudas, onde laudos de sanidade são exigidos. O presente estudo visou antecipar a mesma exigência, desenvolvendo uma tecnologia de diagnose precoce de Lxx em mudas de cana, que fosse eficaz e com custo não proibitivo para o setor produtivo.

AGRADECIMENTOS

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior(CAPES) pelo apoio financeiro e ao Programa de MelhoramentoGenético de Cana-de-Açúcar (PMGCA) pelo apoio logístico

REFERÊNCIAS

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Jul-Sep 2018

Histórico

• Recebido
  01 Jun 2017
• Aceito
  02 Out 2017