Método eficiente, baseado em leitores de microplaca, para detecção de resistência a fungicidas triazóis (IDM) e estrobirulinas (IQe) em populações do patógeno da brusone do trigo

Efficient method, based on microplate readers, to detect resistance to triazole (DMI) and strobilurin (QoI) fungicides in wheat blast pathogen populations

RESUMO

Esta pesquisa propõe a utilização de um método baseado em leitor automatizado de microplacas para detectar resistência a fungicidas triazóis (IDM) e estrobirulinas (IQe) em populações do fungo hemibiotrófico fitopatogênico Pyricularia graminis-tritici (Pygt) do trigo. A disponibilidade de método acurado, mais rápido e eficiente para a detecção da redução da sensibilidade a fungicidas contribuiria para facilitar a tomada de decisão sobre o manejo químico da brusone do trigo no país. Há informação sobre redução da sensibilidade de triazóis no controle da brusone do trigo e evidências da ocorrência generalizada de redução da sensibilidade à estrobilurinas em populações do patógeno no Brasil. O método de microplaca foi acurado em discriminar a variação fenotípica na sensibilidade entre isolados do patógeno aos fungicidas IDM tebuconazol e epoxiconazol e ao fungicida IQe azoxistrobina. Economicamente, ambos os métodos representam alto custo, portanto, é necessário comparar a eficiência desses métodos. O método de microplacas foi mais eficiente no uso de recursos, com custo operacional total 33% inferior ao do método de placas de Petri. Em conjunto, os fatores acurácia, rapidez e eficiência no uso de recursos indicaram que o método de microplaca pode ser utilizado no monitoramento da resistência a fungicidas em populações do fungo da brusone do trigo no agroecossistema brasileiro.

Palavras-chave
acurácia; rapidez; recursos; eficiência; custos

ABSTRACT

This study proposes the application of a method based on an automated microplate reader to detect resistance to triazole (DMI) and strobilurin (QoI) fungicides in populations of the plant pathogenic hemibiotrophic fungus Pyricularia graminis-tritici (Pygt) from wheat. Availability of an accurate, more rapid and efficient method to detect eventual reduction in sensitivity to fungicides could contribute to facilitate the decision making on chemical management of wheat blast in the country. There are reports of reduction in the sensitivity of triazoles to control wheat blast and evidence of widespread reduction in the sensitivity to strobilurins in populations of the pathogen in Brazil. The microplate method was accurate in discriminating the phenotypic variation in sensitivity among isolates of the pathogen to the DMI fungicides tebuconazole and epoxiconazole and to the QoI fungicide azoxystrobin. Economically, both methods represent high cost, therefore, the efficiency of these methods should be compared. The microplate method was more efficient in the use of resources, with a total operating cost 33% inferior to that of the Petri dish method. Together, the factors accuracy, celerity and efficiency in the use of resources indicated that the microplate method can be used to monitor resistance to fungicides among populations of the wheat blast fungus in the Brazilian agroecosystem.

Keywords
EC₅₀; accuracy; celerity; resources; effciency; costs

Desde os anos 70, o número de casos de fungos fitopatogênicos resistentes a fungicidas vem aumentando consideravelmente na agricultura, tornando-se um fator limitante a prejudicar o manejo químico de doenças, uma vez que os fungicidas tornam-se ineficazes (¹¹). Surpreendentemente, no Brasil as contribuições da pesquisa que quantificam a magnitude do impacto da resistência de fungicidas nos mais diversos patossistemas locais têm sido escassas, limitando-se a revisões de literatura ou a estudos pontuais (⁵; ⁹; ¹²; ¹³; ²³). Talvez por essa escassez de informação sobre o cenário atual da resistência a fungicidas na agricultura brasileira, não há relatos de qualquer iniciativa para implementação de um sistema local de monitoramento como estratégia para manejar a emergência da resistência e os impactos pós-emergência associados com a redução da eficácia dos fungicidas em culturas de importância agrícola (²⁸).

Mesmo mundialmente, são escassos os exemplos de sistemas de monitoramento da resistência a fungicidas em populações de fitopatógenos na agricultura que possibilitem aos produtores de determinada cultura a tomada de decisão, em tempo real, em substituir fungicidas na eventualidade da constatação de resistência a princípios ativos de alto risco. Como exceção à regra, no Reino Unido pesquisadores desenvolveram e implementaram o único sistema de detecção e monitoramento, em tempo real, da redução da sensibilidade a fungicidas em populações de fitopatógenos do trigo (¹⁸).

A viabilização da implementação de um sistema semelhante de monitoramento da resistência a fungicidas em fungos fitopatogênicos no país depende do desenvolvimento de métodos acurados, rápidos e eficientes de detecção (¹⁵). Há vários métodos convencionais utilizados para detecção e monitoramento da variação fenotípica na sensibilidade de fungos necrotróficos e hemi-biotróficos a fungicidas, visando evidenciar a ocorrência de redução da sensibilidade em populações de fitopatógenos. Esses métodos convencionais são baseados na análise relativa do crescimento micelial in vitro em meios de cultura suplementados com doses discriminatórias de fungicidas ou com doses seriadas para determinar a EC₅₀ (concentração efetiva do fungicida capaz de inibir 50% do crescimento micelial) populacional (⁶; ⁷; ¹⁶). Entretanto, os métodos convencionais são, em sua maioria, muito demorados, pouco acurados devido à dependência de critérios visuais e manuais nas avaliações, e ineficientes no uso de recursos requerendo centenas a milhares de placas de Petri de meio de cultura (²). Além disso, esses métodos convencionais são potencialmente mais prejudiciais ao meio ambiente em função da geração de maior quantidade de material de descarte com resíduos tóxicos de fungicidas (¹; ²⁷).

Para acelerar o processo de detecção da redução da sensibilidade a fungicidas em populações de fitopatógenos propôs-se o uso do método de microplacas otimizado para esta finalidade específica (¹⁴). O método de microplacas é baseado na medida simples da biomassa fúngica ou da atividade cinético-microbiana em reposta ao efeito de diferentes doses de fungicidas (³; ⁴; ¹⁷; ¹⁹). O fungo é cultivado em meio de cultura líquido em um poço da microplaca e o crescimento ou a atividade cinética microbiana são medidos por meio da absorbância de luz que resulta da variação da turbidez ou da intensidade de fluorescência em decorrência do ataque enzimático a um substrato específico (³; ⁴; ¹⁷; ³⁰). Como a avaliação da inibição do crescimento micelial na presença de fungicidas se baseia no uso de tecnologia de leitura automatizada da absorbância de luz em dezenas de amostras simultaneamente, esse método é potencialmente mais rápido, mais acurado e mais eficiente. Isso porque leitores de microplacas possuem sistemas operacionais que reduzem o tempo envolvido no tratamento de dados, uma vez que se baseiam em leitura de valores de absorbância e cálculos da resposta fenotípica de maneira automática (³; ¹⁷).

Como referencial para implementar o método de microplacas para detecção de resistência a fungicidas em um patossistema fúngico particular recomenda-se que: i) o volume total de suspensão dentro de cada poço da microplaca deve estar entre 75 e 200 µL, ii) a concentração inicial da suspensão de esporos deve estar no mínimo a 10⁴ esporos mL^-1 e iii) o comprimento de onda utilizado para a leitura da absorbância deve ser especificamente selecionado para cada fungo fitopatogênico e sistema específico de detecção (¹⁵; ¹⁸).

Se a otimização do método de microplacas para detecção e monitoramento da redução da sensibilidade a fungicidas em populações do fungo da brusone do trigo for bem-sucedida, poderá ser utilizada para nortear a tomada de decisão, em tempo real (i.e., durante a própria safra), sobre o manejo químico dessa doença foliar, mas principalmente de espigas.

No presente estudo, propôs-se o desenvolvimento do método de microplaca para a medida do crescimento fúngico como mais rápido, acurado e eficiente para discriminar e quantificar a sensibilidade das populações do fungo fitopatogênico Pyricularia graminis-tritici (Pygt), agente causal da brusone do trigo no Brasil, aos fungicidas triazóis [ou inibidores da desmetilação de esteróis (IDM)] tebuconazol e epoxiconazol e à estrobirulina [ou inibidores da quinona externa (IQe)] azoxistrobina. A brusone é considerada a principal doença do trigo no Brasil, e há indícios da ineficácia de triazóis (¹⁰; ²⁵) e evidências da ocorrência generalizada de resistência a estrobilurinas em populações do patógeno no Brasil (⁵; ²⁴).

Para atingir esse objetivo específico, foram efetuadas: i) análise da acurácia do método em discriminar os fenótipos de resistência e sensibilidade de populações de Pygt da brusone do trigo aos fungicidas IDM e IQe com base na EC₅₀; ii) análise do rendimento relativo do método de microplacas em relação ao método de placas de Petri, considerando o número efetivo de amostras analisadas num tempo fixo (como medida de rapidez); e iii) análise econômica comparativa entre os métodos de microplaca e de placa de Petri, usando estimativas do custo operacional total como medida de eficiência no uso de recursos.

MATERIAL E MÉTODOS

Os isolados do patógeno utilizados nesse estudo foram obtidos de amostras populacionais de P. graminis-tritici da brusone do trigo e de P. oryzae (Po) do arroz provenientes de Mato Grosso do Sul (MS) e Goiás (GO) no centro-sul do Brasil nos anos de 2007, 2012 e 2013, os quais se encontram preservados na micoteca da UNESP Campus de Ilha Solteira (Tabela 1). No total foram utilizados treze isolados de Pygt, além de quatro isolados de Po do arroz obtidos do Tocantins (TO). Os isolados de Po foram incluídos no estudo pois representam o único grupo de isolados com padrão de sensibilidade a fungicidas triazóis IDM disponíveis (²⁵). Todos esses isolados representam diferentes genótipos multiloci microssatélites (⁵; ²¹) e haplotipos com mutações distintas nos genes cyp51A (cyp51A H1 ou cyp51A H6) ou cytB (cytB H1 ou cytB H9) que conferem fenótipo de sensibilidade ou resistência aos fungicidas IDM ou IQe, respectivamente (⁵; ²⁴; ²⁵).

Tabela 1
Descrição dos isolados de Pyricularia graminis-tritici e de P. oryzae selecionados para analisar a acurácia do método de microplacas na discriminação dos fenótipos de resistência e sensibilidade a fungicidas triazóis (IDM) e estrobirulinas (IQe)

Espécie e isolados	Local de origem e safra de coleta	Haplotipo do gene cyp51A e fenótipo para fungicidas triazóis (IDM)a			Haplotipo do gene cytB e fenótipo para fungicidas estrobirulinas (IQe)b
		Haplotipo	NCBI	Fenótipo	Haplotipo	NCBI	Fenótipo
Pyricularia graminis-tritici de trigo
12.1.129	Amambaí e Aral Moreira, MS, 2012/2013	cyp51A H1	KX620438	Resistente	cytB H9	KM023783	Sensível
12.1.132		cyp51A H1	KX620438	Resistente	cytB H9	KM023783	Sensível
12.1.130		cyp51A H1	KX620438	Resistente	cytB H9	KM023783	Sensível
12.1.150		cyp51A H1	KX620438	Resistente	cytB H9	KM023783	Sensível
12.1.237		cyp51A H1	KX620438	Resistente	cytB H9	KM023783	Sensível
12.1.239		cyp51A H1	KX620438	Resistente	cytB H9	KM023783	Sensível
12.1.240		cyp51A H1	KX620438	Resistente	cytB H9	KM023783	Sensível
12.1.280		cyp51A H1	KX620438	Resistente	cytB H9	KM023783	Sensível
12.1.127		cyp51A H1	KX620438	Resistente	cytB H1	KM023775	Resistente
12.1.146		cyp51A H1	KX620438	Resistente	cytB H1	KM023775	Resistente
12.1.028	Rio Verde, GO, 2012/2013	cyp51A H1	KX620438	Resistente	cytB H1	KM023775	Resistente
12.1.030		cyp51A H1	KX620438	Resistente	cytB H1	KM023775	Resistente
12.1.068		cyp51A H1	KX620438	Resistente	cytB H1	KM023775	Resistente
Pyricularia oryzae c
630	TO, 2007	cyp51A H6	KX620437	Sensível	ND d	-	ND
364		cyp51A H6	KX620437	Sensível
704		cyp51A H6	KX620437	Sensível
656		cyp51A H6	KX620437	Sensível

• ^a
  Caracterizados por Poloni et al. (²⁵);
• ^b
  Caracterizados por Castroagudín et al. (⁵) e Oliveira et al. (²⁴).
• ^c
  Isolados de P. oryzae (Po) foram incluídos como controle pois não se detectou sensibilidade a fungicidas triazóis nas populações de isolados de P. graminis-tritici.
• ^d
  ND Não determinado para este estudo uma vez que se detectou isolados de Pygt sensíveis para azoxistrobina. Entretanto, conhece-se que os isolados carregam o alelo cytb H9 e são sensíveis à azoxistrobina (⁵).

A acurácia do método de microplacas em discriminar os fenótipos de resistência e sensibilidade in vitro aos fungicidas IDM tebuconazol e epoxiconazol e ao IQe azoxistrobina, foi determinada comparando-se o fenótipo obtido para cada isolado analisado com aquele obtido anteriormente no método de placas de Petri (Tabela 1).

Para implementação do método de microplacas, utilizou-se equipamento do tipo leitor de microplaca (Multiskan^TM FC Microplate Photometer, Thermo Scientific^TM, EUA) de forma semelhante ao descrito por Fraaije et al. (¹⁴) para medida do crescimento, porém com modificações. Para comparação entre métodos, utilizou-se os dados fenotípicos qualitativos (Tabela 1) e quantitativos obtidos por Oliveira et al. (²⁴) e Poloni et al. (²⁵) que empregaram o método de placas de Petri na fenotipagem da resistência/sensibilidade dos mesmos isolados de Pygt da brusone do trigo aos fungicidas IQe e IDM, respectivamente.

Os isolados de Pygt foram reativados em meio BDA (20,7 g L^-1 de batata dextrose, 15 g L^-1 ágar) e os isolados de Po foram reativados em meio de aveia (60 g L^-1 de aveia, 15 g L^-1 ágar), ambos com adição de cloranfenicol e estreptomicina (50 µg mL^-1 de cada). Após sete dias da reativação das culturas, transferiu-se discos de micélio para placas contendo meio BDA e incubou-se por quinze dias a 24°C e 12 h de fotoperíodo. Para a coleta dos esporos foi realizada a raspagem superficial do micélio com o auxílio de uma espátula esterilizada na presença de água destilada esterilizada acrescida do espalhante adesivo Tween 80 (2 gotas L^{- 1}). A concentração da suspensão de esporos foi determinada em câmara de Neubauer, ajustando-se para 2x10⁴ esporos mL^-1.

O experimento consistiu na análise de treze isolados de Pygt e quatro isolados de Po. Para o grupo de fungicidas IDM tebuconazol e epoxiconazol, foram utilizados os seguintes tratamentos: 13 isolados de trigo, quatro isolados de arroz, sete a nove doses dos fungicidas (Tabela 2), totalizando 127 parcelas experimentais cada. Para o fungicida IQe azoxistrobina foram utilizados os seguintes tratamentos: 13 isolados de trigo e 12 doses do fungicida (Tabela 2), totalizando 156 parcelas experimentais. O volume total dispensado em cada poço da placa foi de 130 µL, distribuídos como segue: controle positivo (120 µL de caldo BD sem adição dos fungicidas + 10 µL da suspensão de esporos), branco ou controle negativo (130 µL de caldo BD com adição das distintas doses de fungicidas) e as demais amostras (120 µL de caldo BD com adição das doses de fungicidas + 10 µL da suspensão de esporos).

Tabela 2
Concentrações utilizadas dos fungicidas Folicur EC (tebuconazol a 200g L^-1, Bayer), Tango Cash (epoxiconazol a 75g L^-1, BASF) e Priori (Azoxistrobina a 250g L^-1, Syngenta) para determinação da EC₅₀ de isolados de Pyricularia graminis-tritici do trigo e de P. oryzae do arroz

Espécie	Fungicidas	Concentrações (µg mL-1)							Total de doses
Pyricularia graminis-tritici	Tebuconazol	0,00	0,30	0,75	0,90	1,80	4,10	6,80	7
	Epoxiconazol	0,00	0,04	0,10	0,30	0,68	1,00	2,00	7
	Azoxistrobina	0,00	0,02	0,04	0,08	0,16	0,32	0,63
		1,25	2,50	5,00	7,00	10,00	-	-	12
P. oryzae	Tebuconazol	0,0000	0,0025	0,0050	0,0100	0,0200	0,0400	0,0750
		0,1500	0,3000	-	-	-	-	-	9
	Epoxiconazol	0,0000	0,0013	0,0025	0,0050	0,0100	0,0200	0,0375
		0,0750	0,1120	-	-	-	-	-	9

Para o experimento com fungicidas triazóis, a suspensão de esporos foi mantida por dezoito horas em câmara de crescimento a 24°C e 12 h de fotoperíodo para a germinação dos esporos. No experimento com o fungicida azoxistrobina IQe, ao caldo BD (20,7 g L^-1 batata-dextrose) foi acrescido 0,5 mM de ácido salicil-hidroxâmico (SHAM), fundamental para suprimir a via alternativa da oxidase acompanhando os procedimentos relatados por Ma et al. (²⁰). As concentrações dos fungicidas utilizadas (Tabela 2) foram pré-determinadas em experimento piloto. O crescimento dos isolados foi determinado com base na absorbância de luz à 620 nm obtida no leitor de microplacas descrito acima, 96 h após o início do experimento. Os valores obtidos foram utilizados para cálculo da EC₅₀ (concentração que inibe 50% do crescimento do micélio) de cada isolado, e para cada fungicida, por meio do programa ED₅₀plus v1.0 (²⁹). Os experimentos consistiram de blocos casualizados, com cinco repetições por tratamento. O experimento foi repetido uma vez. A análise de variância (ANOVA) e o teste de comparação de médias (Scott-Knott) a 5% de probabilidade, foram efetuados no ambiente R com o uso do pacote estatístico Agricolae (²⁶).

Tabela 3
Análise de variância (ANOVA) de valores de EC₅₀ comparando-se o efeito dos métodos de microplacas e de placas de Petri, e de grupos de isolados de Pyricularia graminis-tritici e de P. oryzae resistentes ou sensíveis aos fungicidas tebuconazol, epoxiconazol e azoxistrobina e as respectivas interações.

Fungicida	Fatores de variação	G.L.	Q.M.	F	p > F
Tebuconazol	Métodos
	Método da microplaca
	Grupos fenotípicos	1	7,244	616,46	< 0,001 ***
	Isolados (Grupo)	15	0,145	12,35	< 0,001 ***
	Bloco	9	0,091	0,86	0,565
	Resíduo	88	0,012
	Método de placas de Petri
	Grupos fenotípicos	1	26,297	1473,63	< 0,001***
	Isolados (Grupo)	12	0,053	2,98	< 0,01 **
	Bloco	7	0,104	5,83	< 0,001 ***
Epoxiconazol	Resíduo	69	0,018
	Métodos
	Método da microplaca
	Grupos fenotípicos	1	0,4371	239,66	< 0,001***
	Isolados (Grupo)	15	0,0154	8,42	< 0,001***
	Bloco	9	0,0050	2,74	< 0,01 **
	Resíduo	92	0,0018
	Método de placas de Petri
	Grupos fenotípicos	1	18,560	3957,77	< 0,001***
	Isolados (Grupo)	12	0,027	5,67	< 0,001***
	Bloco	7	0,027	5,68	< 0,001***
Azoxistrobina	Resíduo	58	0,005
	Método	1
	Método da microplaca
	Grupos fenotípicos	1	2731,8	83,86	< 0,001***
	Isolados (Grupo)	11	41,6	0,46	0,255
	Bloco	9	15,0	1,28	0,896
	Resíduo	75	32,6
	Método de placas de Petri
	Grupos fenotípicos	1	41018,0	115,42	< 0,001***
	Isolados (Grupo)	11	325,0	0,91	0,532
	Bloco	7	403,0	1,13	0,354
	Resíduo	65	355,0

• Em função de não ter sido detectado interação significativa entre réplicas dos experimentos e demais fatores, as réplicas foram combinadas.
• ^***
  Significativa pelo teste F a p ≤ 0,001.
• ^**
  Significativa a p ≤ 0,01.

A eficiência relativa no uso de recursos com o método de microplacas e com o de placas de Petri foi determinada e os custos operacionais efetivo (COE) e total (COT) comparados, como proposto por (²²). O COE foi composto das despesas com mão de obra e materiais utilizados em laboratório para ambos os métodos. Já o COT foi composto pelo COE, acrescido de outras despesas calculadas, bem como da depreciação estimada pelo método linear, proporcional ao período de utilização mensal do laboratório, em relação ao conjunto de elementos correspondentes ao capital fixo da atividade associados à vida útil de cada bem permanente.

Essa informação é relevante para os laboratórios interessados em implementar e oferecer serviços de detecção de resistência a fungicidas em populações de patógenos no país usando método semelhante de análise. É relevante, também, para os produtores rurais, potenciais usuários finais desse serviço de detecção. Os preços empregados foram em moeda Dólar (US$), referente ao dia 14 de julho de 2017.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Provavelmente este é o primeiro estudo em que se propõe o uso do método de microplaca para discriminação entre os fenótipos de resistência e de sensibilidade a fungicidas triazóis e estrobirulinas em populações de Pygt e Po (Figura 1), com o objetivo de nortear a tomada de decisão quanto ao manejo químico da brusone do trigo no Brasil. Sob o ponto de vista qualitativo, o grupo de isolados de Po descritos como sensíveis aos fungicidas IDM triazóis pelo método de placas de Petri (²⁵), também foi caracterizado como sensível quando avaliado pelo método de microplaca.

Figura 1
Representação visual do crescimento de isolados de Pyricularia graminis-tritici in vitro em microplacas contendo caldo BD com diferentes concentrações dos fungicidas IDM triazóis, tebuconazol e epoxiconazol (placa A) e IQe azoxistrobina (placa B).Placa A: Linha A, controle positivo contendo caldo BD sem o fungicida tebuconazol, com diferentes isolados de Pygt nas posição A1 a A6, e caldo BD sem o fungicida tebuconazol, com os mesmos isolados de Pygt nas posições de A7 a A12; linha B, controle negativo para isolados contento caldo BD com doses diferentes dos fungicidas tebuconazol (posições B1 á B6) ou epoxiconazol (posições B7 à B12), descritas Tabela 2); linhas C a H, contém diferentes isolados de Pygt e os números de C1 a C6, ... , H1 a H6 representam as doses crescentes de tebuconazol, e de C7 a C12, ..., H7 a H12, doses crescentes do fungicida epoxiconazol.Placa B: Linha A, controle positivo contendo caldo BD sem o fungicida azoxistrobina, com diferentes isolados de Pygt nas posições A1 a, A6, e poços vazios nas posições A7 a A12; linha B, controle negativo para isolados com doses do fungicida azoxistrobina (posições B1 a B11); nas linhas C, D e E, isolados resistentes, linhas F, G e H, isolados sensíveis à azoxistrobina; e os números de 1 a 11 representam as doses crescentes de azoxistrobina.

Analisando-se a curva dose-resposta média, foi possível discriminar o grupo de isolados de Pygt descritos como resistentes a triazóis (²⁵) do grupo dos isolados de Po sensíveis a triazóis, demonstrando a acurácia do método de microplacas (Figura 2).

Figura 2
Curva dose-resposta do crescimento de Pyricularia graministritici (Pygt) e P. oryzae (Po) expresso em unidade de densidade ótica em função de doses dos fungicidas tebuconazol e epoxiconazol (IDM) e azoxistrobina (IQe) ^a,b.^aPara fungicidas IDM triazóis, média de N=13 isolados resistentes de Pygt e N=4 isolados sensíveis de Po. ^bPara fungicidas IQe estrobirulinas, média de N=5 isolados resistentes e N=8 isolados sensíveis de Pygt.

Estes isolados apresentaram valores de absorbância para a curva dose-resposta decrescendo de 2,007 para 0 em função do incremento de doses do fungicida entre 0 e 0,16 μg mL^-1 de azoxistrobina. Por sua vez, os cinco isolados de Pygt (12.1.028, 12.1.030, 12.1.068, 12.1.127, 12.1.146) classificados por Oliveira et al. (²⁴) como resistentes no método de placas de Petri foram também resistentes pelo método de microplacas, tendo sido detectados valores de absorbância para a curva dose-resposta decrescendo de 1,120 para o mínimo de 0,20 na dose de 10 μg mL^-1. Verificou-se que esses isolados resistentes a azoxistrobina apresentam crescimento micelial em todas as doses do produto, o que não ocorreu com os isolados sensíveis.

Sob o ponto de vista quantitativo, de forma geral para os três fungicidas testados, os valores de EC₅₀ para o método de microplacas foram significativamente menores em comparação com o método de placas de Petri, dentro do grupo fenotípico resistente (Figura 3).

Figura 3
Boxplots representando a variação dos valores de EC₅₀ de grupos de isolados de Pyricularia graminis-tritici e P. oryzae resistentes ou sensíveis aos fungicidas IDM triazóis (tebuconazol e epoxiconazol) ou IQe estrobirulinas (azoxistrobina) de acordo com método de microplacas (boxplot branco) e o método de placas de Petri (boxplot cinza) ^{a, b, c}.^aA linha horizontal dentro do boxplot representa os valores das medianas correspondentes ao número de isolados de cada categoria e 10 repetições por grupo de isolados. ^b Medianas para grupos de isolados obtidas com N = 13 isolados de Pygt resistentes e N = 4 isolados de Po sensíveis a triazóis. c Medianas para grupos de isolados obtidas com N = 5 isolados de Pygt resistentes e N = 8 isolados sensíveis a azoxistrobina. dOs boxplots com as mesmas letras indicam que as médias de métodos, dentro de grupo fenotípico, não diferem significativamente de acordo com o teste de Scott-Knott para comparação de médias a p < 0,05.

Em média, para o método de microplaca, a EC₅₀ de isolados resistentes foi de 0,14 ± 0,06 μg mL^-1 de epoxiconazol, 0,61 ± 0,19 μg mL^-1 de tebuconazol e 7.06 ± 8.08 μg mL^-1 de azoxistrobina. Já para o método de placas de Petri, observou-se valores significativamente maiores de EC₅₀ para isolados resistentes, como se segue: 1,22 ± 0,14 μg mL^-1 de epoxiconazol, 1,24 ± 0,15 μg mL^-1 de tebuconazol e 34,01 ± 29,93 μg mL^-1 de azoxistrobina (Figura 3).

Por sua vez, não houve diferença significativa entre métodos dentro do grupo fenotípico sensível. Em média, para o método de microplaca, a EC₅₀ de isolados sensíveis foi de 0,0074 ± 0,0035 μg mL^-1 de epoxiconazol, 0,014 ± 0,0059 μg mL^-1 de tebuconazol, e 1,47 ± 2,22 μg mL^-1 de azoxistrobina. Em comparação, para o método de placas de Petri, para isolados sensíveis observou-se EC₅₀ de 0,034 ± 0,0062 μg mL^-1 de epoxiconazol, 0,034 ± 0,0062 μg mL^-1 de tebuconazol e 1,02 ± 5,29 μg mL^-1 de azoxistrobina (Figura 3).

Muito embora com valores de EC₅₀ significativamente menores, o método da microplaca foi semelhantemente acurado e de precisão superior ou similar (expressa pelos desvio da médios), permitindo discriminar os fenótipos de resistência dos de sensibilidade dos isolados de Pygt e/ou Po aos fungicidas tebuconazol, epoxiconazol e azoxistrobina (efeito significativo de grupos fenotípicos, Tabela 3). Reproduziu-se, assim, as observações dos estudos anteriores utilizando fenotipagem pelo método de placas de Petri (²⁴; ²⁵).

Tabela 4
Valores detalhados de custo discriminando gastos de energia e tempo dispendido em cada atividade para os métodos de microplaca e de placa de Petri, 2017

Ítem e detalhamento das atividades geradoras de consumo de energia	Microplacas			Placas de Petri
	Potência kWa	Horas	Valor (U$)	Potência kWa	Horas	Valor (U$)
1. Energia consumida pelo uso da autoclaveb	2,7	1	1.02	2,7	4	4.10
2. Energia consumida pelo uso da câmara de fluxo laminarc	0,4	4	0.6	0,4	10	1.52
3. Energia consumida pelo uso de incubadoras tipo BODsd	0,4	648	98.62	1,6	504	306.83
4. Tempo de avaliação de experimento em leitor de microplaca	0,06	0,25	0.003	-	8	-
Total	-		100.24	-		312.45

• ^a
  Para cálculo do valor final foi utilizado a tarifa de alta tensão disponível no site http://www.elektro.com.br, no valor de (R$ 1,21, equivalente a US$0.38).
• ^b
  Utilizada para preparo de meios de cultura e esterilização de material;
• ^c
  Utilizada para distribuição de meio de cultura, repicagem de culturas, estabelecimento e avaliação de experimento;
• ^d
  Utilizada para incubação de culturas em microplacas (uma incubadora) ou em placas de Petri (quatro incubadoras); ^eUtilizada para avaliação de experimentos em microplacas.

Tabela 5
Estimativa de custos considerando o número de 30 isolados para os métodos de microplaca e placa de Petri para detecção de resistência a fungicidas em populações de fungos fitopatogênicos, 2017.

Descrição	Método de microplacas				Método de placas de Petri
	Quantidade (Unidades ou gramas)	Valor Unit. (U$)	Valor Total (U$)	%	Quantidade (Unidades ou gramas)	Valor Unit. (U$)	Valor Total (U$)	%
Mão de Obra	1	471.69	471.69	70,99	1	471.69	471.69	46,54
Energia elétrica	-	-	100.24	15,09	-	-	312.45	30,83
Microplacas de cultura (96 poços)	5	1.41	7.07	1,06	0	0,00	0,00	-
Placas de Petri descartáveis 90x15mm	180	0.15	28.30	4,26	810	0.15	127.35	12,56
Ponteira de 20-200 µL, com filtro	60	0.07	4.52	0,68	12	0.07	0.90	0,09
Ponteira de 0.5-10 µL, com filtro	60	0.06	3.96	0,60	12	0.06	0.79	0,08
Tubos falcons (15 ml)	60	0.17	10.56	1,59	0	0,00	0,00	-
Botijão de gás	1	16.98	16.98	2,56	1	16.98	16.98	1,68
Caldo Batata dextrose (500g)	68,31g	78.30	10.69	1,60	232,87g	78.30	36.46	3,60
Agar (500g)	37,5g	139.10	10.43	1,57	168,75g	139.10	46.94	4,63
Custo Operacional Efetivo (COE)			664.44				1,013.56
Outras Despesas (5% COE)			41.38				39.71
Depreciação Linear			33.22				50.68
Custo Operacional Total (COT)			739.04	100			1,103.95	100

Ainda quantitativamente, pelo método de microplaca detectou-se diferenças significativas entre isolados de Pgyt e/ou Po dentro dos grupos fenotípicos resistentes e sensíveis aos fungicidas tebuconazol, epoxiconazol e azoxistrobina, assim como detectado anteriormente usando-se o método de placas de Petri (Tabela 3).

Em seguida foi comparado o tempo para execução das técnicas de microplacas e de placas de Petri considerando a caracterização fenotípica de 30 isolados do patógeno, conforme fluxograma apresentado na Figura 4. O método de microplacas demandou 30 dias para se completar a fenotipagem dos 30 isolados, enquanto o de placas de Petri demandou 23 dias. Entretanto, ambos os métodos possuíam atividades diárias que não ultrapassavam oito horas de trabalho, por exemplo o preparo de meio de cultura, a reativação de culturas fúngicas, a repicagem de culturas reativadas. Ainda, a incubação de culturas para crescimento micelial ou para produção de esporos, que varia de 7 a 15 dias, não demanda horas efetivas de trabalho e, portanto, permite a sobreposição de outros processos paralelos de fenotipagem, otimizando recursos e mão de obra disponível. No método de placas de Petri foi necessário um total de 52 h de trabalho, 14 h a mais que o requisitado para o método de microplacas, que totaliza 38 h. Especificamente, são necessárias mais horas para preparo de meio de cultura em placas de Petri, para o estabelecimento e para a avaliação do experimento (Figura 4).

Figura 4
Cronograma comparativo de atividades para estabelecimento de experimentos de detecção de resistência à fungicidas in vitro pelos métodos de microplaca e placa de Petri, 2017 ^aa As barras cinza e branca indicam duração das atividades consecutivas em cada método.--

AGRADECIMENTOS

Este estudo foi financiado por auxílios à pesquisa da FAPESP (Fundação de Âmparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) a P. C. Ceresini (2013/10655-4 e 2015/10453-8) e da Embrapa/Monsanto Macrograma II (SEG 02.11.04.006.00.00) a J. L. N. Maciel. P.C. Ceresini é Pesquisador Pq-2 do CNPq – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (Pq-2 307361/2012-8 e 307295/2015-0). V. L. Castroagudín foi bolsista de pós-doutorado pelo convênio FAPESP/CAPES (2014/25904-2). G. Carvalho foi bolsista de pós-doutorado do Programa PNPD - CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pelo Programa de Pós-graduação em Agronomia (PPGA) da UNESP Campus de Ilha Solteira. P. S. Casado foi bolsista de mestrado da CAPES pelo PPGA. S. N. C. Vicentini é bolsista de mestrado da FAPESP (2017/03403-0) no PPGA. Agradecemos à CAPES por conceder auxílio para estabelecimento do “Centro de Diversidade Genética no Agroecossistema” (Pro-equipamentos 775202/2012).

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Jul-Sep 2018

Histórico

• Recebido
  11 Set 2017
• Aceito
  04 Nov 2017