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Terapia fotodinâmica no controle de Xanthomonas campestris pv. campestris in vitro e no tratamento de sementes de canola naturalmente contaminadas

Photodynamic therapy in the control of Xanthomonas campestris pv. campestris in vitro and naturally contaminated canola seeds

RESUMO

A cultura da canola (Brassica napus L. var. oleifera) foi recentemente introduzida na região do Triângulo Mineiro e Alta Paranaíba, MG. A podridão negra causada pela bactéria Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) é uma das principais doenças da cultura. A bactéria é disseminada pelas sementes e métodos alternativos de controle devem ser avaliados. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar o uso da terapia fotodinâmica, com os corantes Azul de Metileno (AM) e Azul de Toluidina (AT), sob à irradiação, na inibição do crescimento de Xcc in vitro e no tratamento de sementes de canola naturalmente contaminadas com a bactéria. A suspensão bacteriana de Xcc foi tratada com os corantes AM, AT e associação deles (AM+AT) nas concentrações 25, 50 e 100 µmol L-1, irradiadas ou não, e cultivada em meio de cultura, em seguida foi avaliado o número de unidades formadoras de colônias. Sementes de três genótipos de canola foram tratadas com NaCl 0,45% (Testemunha), AM, AT e AM+AT, nas concentrações 100, 50 e 25 µmol L-1, respectivamente, irradiadas ou não. A porcentagem de germinação das sementes, índice de velocidade de emergência, porcentagem de emergência de plântulas e o controle da bactéria nas sementes foram avaliados. Os corantes AM, AT e AM+AT, nas concentrações 100, 50 e 25 µmol L-1 respectivamente, sob irradiação inibiram o crescimento de Xcc in vitro. A combinação dos corantes AM+AT a 25 µmol L-1 pode ser utilizada no tratamento das sementes de canola. O controle da bactéria Xcc em sementes de canola naturalmente contaminada não foi possível ser determinada com os diferentes corantes.

Palavras-chave
Azul de metileno; azul de toluidina; Brassica napus L; var. oleifera; fotossensibilizador; inativação de micro-organismos

ABSTRACT

Canola (Brassica napus L. var. oleifera) crop was recently introduced in the regions of “Triângulo Mineiro” and “Alta Paranaíba”, Minas Gerais State, Brazil. Black rot, caused by the bacterium Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), is one of the major diseases affecting this crop. The bacterium is disseminated via seeds and alternative control methods should be investigated. Therefore, the objective of this study was to evaluate the use of photodynamic therapy with the dyes Methylene Blue (MB) and Toluidine Blue (TB), under irradiation, on Xcc growth inhibition in vitro and on the treatment of canola seeds naturally contaminated with the bacterium. Xcc bacterial suspension was treated with MB, TB and their association (MB+TB) at the concentrations 25, 50 and 100 μmol L-1, irradiated or not, and cultivated on culture medium; then, the number of colony-forming units was assessed. Seeds of three canola genotypes were treated with 0.45% NaCl (Control), MB, TB and MB+TB, at the concentrations 100, 50 and 25 μmol L-1, respectively, irradiated or not. Seed germination percentage, emergence speed rate, seedling emergence percentage and control of bacteria in the seeds were evaluated. MB, TB and MB+TB, at 100, 50 and 25 μmol L-1, respectively, under irradiation, inhibited Xcc growth in vitro. The combination of dyes MB+TB, at 25 µmol L-1, can be used in the treatment of canola seeds. Control of the bacterium Xcc in naturally contaminated canola seeds could not be determined with the different dyes.

Keywords
Methylene blue; toluidine blue; Brassica napus L; var. oleifera; photosensitizer; microorganism inactivation

A cultura da canola (Brassica napus L. var. oleifera) foi introduzida no Triângulo Mineiro e Alta Paranaíba, MG, em 2014, sendo a terceira oleaginosa mais cultivada no mundo (2626 Tomm, G.O. Canola e girassol: opções de cultivo para o Brasil. Valinhos: KLFF, 2015. Disponível em: <http://www.clubeklff.com.br/publicacao/canola-e-girassol-opcoes-de-cultivo-para-o-brasil-1207>. Acesso em: 17 jan. 2018.
http://www.clubeklff.com.br/publicacao/c...
). Seus cultivos destina à extração de óleo comestível, produção de biodiesel e ao uso do farelo na ração animal (2727 Tomm, G.O.; Wiethölter, S.; Dalmago, G.A.; Santos, H.P. Tecnologia para produção de canola no Rio Grande do Sul. Passo Fundo: Embrapa Trigo, 2009. (Documentos Online, 113). Disponível em: <http://www.cnpt.embrapa.br/biblio/do/p_do113.htm>. Acesso em: 3 set 2017.
http://www.cnpt.embrapa.br/biblio/do/p_d...
).

A podridão negra, causada pela bactéria Xanthomonas campestris pv. campestris (Pammel 1895) Dowson 1939 (Xcc) é uma das principais doenças da cultura, ocasionando perdas na produtividade (3030 Villeth, G.R.; Reis, F.B.; Tonietto, A.; Huergo, L.; Souza, E.M.; Pedrosa, F.O.; Franco, O.L.; Mehta, A. Comparative proteome analysis of Xanthomonas campestris pv. campestris in the interaction with the susceptible and the resistant cultivars of Brassica oleracea. FEMS Microbiology Letters, Amsterdam, v.298, n.2, p.260-266, 2009.). A bactéria é disseminada pelas sementes, que pode ser introduzida em novas áreas de cultivo, levando a ocorrência de epidemias.

O controle químico da bactéria não é eficiente (2222 Romeiro, R.S. Bactérias Fitopatogênicas. 2.ed. Viçosa: UFV, 2005. 417p.) e medidas alternativas de controle do patógeno nas sementes devem ser avaliadas, como o uso da terapia fotodinâmica.

A terapia fotodinâmica consiste na associação de um corante sensível à luz, o fotossensibilizador que é ativado em um comprimento de onda específico. Após exposição microbiana a esta energia luminosa, o fotossensibilizador é energizado provocando a formação de espécies reativas de oxigênio, responsáveis pela inativação do micro-organismo (44 Denis, T.G.; Dai, T.; Izikson, L.; Astrakas, C.; Anderson, R.R.; Kamblin, M.R.; Tegos, G.P. All you need is light: Antimicrobial photoinactivation as an evolving and emerging discovery strategy against infectious disease. Virulence, Austin, v.2, n.6, p.509-520, 2011.). Os fotossensibilizadores podem causar danos severos ao DNA, à membrana celular e à oxidação de compostos orgânicos insaturados, como os lipídeos (1919 Perussi, J.R. Inativação fotodinâmica de microorganismos. Química Nova, São Paulo, v.30, n.4, p.988-994, 2007.), além de inativarem enzimas essenciais ao patógeno (2020 Phoenix, D.A.; Sayed, Z.; Hussain, S.; Harris, F.; Wainwright, M. The phototoxicity of phenotiazinium derivaties against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. FEMS Immunology & Medical Microbiology, Amsterdam, v.39, n.1, p.17-22, 2003., 2121 Pinton, P.C.; Rossi, M.T.; Sala, R.; Venturini, M. Photodynamic Antifungal Chemotherapy. Photochemistry and Photobiology, Oxford, v.88, n.3, p.512-522, 2012.).

Essa técnica tem apresentado resultados promissores na área médica e odontológica, como no tratamento de raízes de canais de dentes humanos contaminados com Enterococcus faecalis com redução de 99,9% da bactéria (88 Fonseca, M.B.; Tessare Júnior, P.O.; Pallota, R.C.; Ferreira Filho, H.; Denardin, O.V.; Rapoport, A.; Dedivitis, R.A.; Veronezi, J.F.; Genovese, W.J.; Ricardo, A.L. Photodynamic therapy for root canals infected with Enterococcus faecalis. Photomedicine and Laser Surgery, Larchmont, v.26, n.3, p.209-213, 2008.). A terapia fotodinâmica foi introduzida na área agrícola (77 Ferreira, S.F. Tratamento fotodinâmico de sementes de tomate (Solanum licopersicon MILL.), na inativação da bactéria Xanthomonas spp. 2012. 61f. Dissertação (Mestrado em Química) – Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia., 2424 Tebaldi, N. D.; Ferreira, F. de S.; Oliveira, C. A. de. Tratamento fotodinâmico de sementes de tomate na inativação da bactéria Xanthomonas spp. Depositante: Universidade Federal de Uberlândia (BR/MG); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais FAPEMG (BR/MG). BR 10 2014 016900 8 A2. Depósito: 8 jul. 2014.), como uma medida alternativa de controle de bactérias fitopatogênicas.

Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o uso da terapia fotodinâmica com os corantes Azul de Metileno, Azul de Toluidina e a combinação deles, irradiados ou não, no controle de Xcc in vitro e no tratamento de sementes de canola naturalmente contaminadas, para o controle da bactéria.

MATERIAL E MÉTODOS

Os ensaios foram conduzidos no Laboratório de Bacteriologia Vegetal (LABAC), no Laboratório de Sementes e em casa de vegetação, do Instituto de Ciências Agrárias (ICIAG), da Universidade Federal de Uberlândia (UFU) – MG.

Preparo da suspensão bacteriana

O isolado UFU F64 de Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) pertencente à coleção de trabalho do LABAC, do ICIAG, da UFU foi cultivado em meio de cultura 523 (1111 Kado, C.I.; Heskett, M.G. Selective media for isolation of Agrobacterium, Corynebacterium, Erwinia, Pseudomonas and Xanthomonas. Phytopathology, Saint Paul, v.60, p.969-979, 1970.), a 28 °C por 48 horas.

A suspensão bacteriana foi preparada em NaCl (0,45%) e ajustada em espectrofotômetro (OD550=0,5) para a concentração de 1x109 UFC mL-1 (1616 Marcuzzo, L.L.; Becker, W.F.; Fernandes, C.F. Alguns aspectos epidemiológicos da mancha bacteriana (Xanthomonas spp.) do tomateiro na região de caçador/ SC. Summa Phytopathologica, Botucatu, v.35, n.2, p.132-135, 2009.).

Terapia fotodinâmica na inibição do crescimento de Xanthomonas campestris pv. campestris in vitro

Para a inativação da suspensão bacteriana in vitro utilizou-se os corantes Azul de Metileno (AM), Azul de toluidina (AT) e a associação destes (AM+AT) (1:1), nas concentrações 25, 50 e 100 µmol L-1, em solução de NaCl (0,45%) e esterilizados em autoclave por 30 minutos a 120 °C. Para a testemunha foi utilizada a solução de NaCl (0,45%).

Em microtubos (1,5 mL) colocou-se 100 µL da suspensão bacteriana e 900 µL de cada corante, nas diferentes concentrações. Para a testemunha utilizou 100 µL da suspensão bacteriana e 900 µL da solução de NaCl (0,45%). Todos os microtubos foram recobertos com papel alumínio e incubados em estufa a 28 °C por 20 min. Posteriormente, parte dos microtubos foram colocados a 5 cm de distância da fonte de iluminação (Equipamento AMS-II, sistema de LED de alta potência, emissão 652 nm) e irradiados por 20 minutos. Os demais microtubos foram mantidos no escuro em temperatura ambiente (25 ºC).

Em seguida a suspensão bacteriana foi diluída em série (10-2 a 10-7), em solução de NaCl (0,45%), cultivada em meio de cultura 523, em placas de Petri, incubadas a 28 °C por 4 dias. Posteriormente, o número de unidades formadoras de colônias (UFC mL-1) foi avaliada pela contagem de colônias formadas.

O experimento foi conduzido em delineamento de blocos inteiramente casualizados, com três repetições e em um arranjo fatorial 3x3x2+2 (corantes x concentrações x luminosidade + adicionais).

Terapia fotodinâmica no tratamento de sementes de canola

As sementes dos genótipos de canola Terola 10A40 SS (Serra do Salitre, MG, 2014), Hyola 61 (Área experimental, RS, 2014) e Terola 10A40 MT (Área experimental, MT, 2013) naturalmente contaminadas com Xcc, foram tratadas com os corantes AM, AT e AM+AT, nas concentrações 100, 50 e 25 µmol L-1, respectivamente. Para a testemunha as sementes foram tratadas com NaCl 0,45%. Testes preliminares de detecção da bactéria usando extrato de sementes (1.000), em meio cultura confirmaram a presença da bactéria nas sementes dos genótipos canola utilizadas neste trabalho.

As sementes de cada genótipo (800 sementes) foram colocadas em placas de Petri, e adicionado 20 mL de cada corante ou NaCl 0,45% (testemunha) e, em seguida, as placas foram incubadas em estufa a 28 °C por 20 minutos. Posteriormente, as sementes foram colocadas a 5 cm de distância da fonte de iluminação (Equipamento AMS-II, sistema de LED de alta potência, emissão 652nm) e irradiadas por 20 minutos. As sementes não irradiadas foram mantidas no escuro em temperatura ambiente.

Controle de Xanthomonas campestris pv. campestris em sementes de canola

Para o controle de Xcc em sementes de canola, foram utilizadas 200 sementes de cada genótipo, com oito repetições de 25 sementes. As sementes foram tratadas com os corantes (AM, AT, AM+AT), irradiadas ou não. Para a testemunha as sementes foram tratadas com NaCl 0,45%. O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado, em arranjo fatorial 4 x 2 (3 corantes +1 testemunha x irradiado/escuro).

As sementes de canola foram colocadas sobre o meio de cultura semi-seletivo NSCAA (2525 Tebaldi, N.D.; Panizzi, R.C.; Sader, R. Detecção, transmissão e efeito de Xanthomonas campestris pv. campestris na qualidade fisiológica de sementes de brócolis. Summa Phytopathologica, Botucatu, v.33, n.3, p.416-418, 2007.) em placas de Petri, e incubadas em estufa a 28 °C por 72 horas. Após este período, avaliou-se o número de sementes com a presença de Xcc, determinando a porcentagem de sementes contaminadas.

Teste padrão de germinação das sementes de canola

O teste padrão de germinação foi realizado de acordo com as Regras para Análise de Sementes (RAS) (22 Brasil. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Regras para Análise de Sementes (RAS). Brasília, DF: Mapa/Assessoria de Comunicação Social, 2009. 395p.), utilizando 200 sementes para cada tratamento. O experimento foi conduzido em delineamento de blocos inteiramente casualizado, com quatro repetições de 50 sementes cada, em um arranjo fatorial 4 x 2 (3 corantes +1 testemunha x irradiado/ escuro)

As sementes foram colocadas sobre duas folhas de papel mata borrão, em caixas tipo gerbox. O papel foi embebido com água, equivalente a 2,5 vezes a massa do papel seco. As sementes foram levadas ao germinador à temperatura de 20-30 °C ±2, com fotoperíodo de 8 h luz/16 h escuro (22 Brasil. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Regras para Análise de Sementes (RAS). Brasília, DF: Mapa/Assessoria de Comunicação Social, 2009. 395p.).

As avaliações foram realizadas pela contagem de plântulas normais emergidas, sendo a primeira e a última contagem, no quinto e sétimo dia, respectivamente. Os resultados foram expressos em % de germinação, conforme critérios estabelecidos pela RAS (22 Brasil. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Regras para Análise de Sementes (RAS). Brasília, DF: Mapa/Assessoria de Comunicação Social, 2009. 395p.).

Índice de velocidade de emergência e emergência de plântulas

O experimento foi realizado em casa de vegetação, utilizando-se 200 sementes, com quatro repetições de 50 sementes. As sementes foram semeadas em bandejas de isopor (25 cm x 20 cm) contendo areia estéril. O experimento foi conduzido em delineamento de blocos casualizados, em um arranjo fatorial 4 x 2 (3 corantes +1 testemunha x irradiado/escuro).

A contagem de plântulas (cotilédones visíveis) ocorreu diariamente, a partir do segundo dia até o nono dia após a semeadura. Ao final das avaliações com o número de plântulas emergidas, calculou-se o índice de velocidade de emergência (IVE) pela fórmula descrita por Maguire (1515 Maguire, J.D. Speed of germination aid in selection and evaluation for seedling emergence and vigor. Crop Science, Madison, v.2, n.2, p.176-77, 1962.).

A emergência de plântulas foi avaliada pelo número de sementes emergidas, no nono dia após a semeadura, calculando-se a porcentagem de plântulas emergidas.

Análise estatística

Os dados obtidos foram submetidos ao teste de pressuposições, teste de normalidade (Shapiro Wilk), homogeneidade (Levene) e aditividade, pelo programa estatístico SPSS Statistics vs. 20 (1010 IBM Corp. IBM SPSS Statistics for Windows. Version 20.0. Armonk: IBM, 2011.). As médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, as análises foram realizadas através do programa estatístico SISVAR versão 5.30 (66 Ferreira, D.F. SISVAR: Sistema de análise de variância. Versão 5.3. Lavras, MG: UFLA, 2010.).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Terapia fotodinâmica na inibição do crescimento de Xanthomonas campestris pv. campestris in vitro

O tratamento da suspensão bacteriana com os corantes azul de metileno (AM), azul de toluidina (AT) e a mistura de ambos (AM+AT), nas três diferentes concentrações 25, 50 e 100 µmol L-1 (Tabela 1), quando não irradiado, no escuro, proporcionaram o crescimento da bactéria em meio de cultura, ou seja, estes tratamentos não erradicaram a bactéria. No entanto, quando a suspensão bacteriana foi irradiada com o uso dos corantes AM a 100 µmol L-1, AT a 50 e 100 µmol L-1 e AM+AT nas três concentrações 25, 50 e 100 µmol L-1 houve inibição do crescimento ou a eliminação total das células bacterianas. A suspensão bacteriana, testemunha no escuro (1,2x108 UFC mL-1) e irradiada (1,2x105 UFC mL-1) houve o crescimento bacteriano.

Tabela 1
Inibição do crescimento de Xanthomonas campestris pv. campestris in vitro, em unidades formadoras de colônia (UFC mL-1), com corantes fotodinâmicos em diferentes concentrações (25, 50 e 100 µmol L-1), sob condições de escuro ou irradiado. Uberlândia MG, 2017.

Somente a combinação entre corantes (AM+AT) nas três diferentes concentrações, quando irradiado, inibiu o crescimento da bactéria, demonstrando que a interação entre os corantes apresentou efeito potencializado.

Os corantes AM e AT foram eficazes na inativação da bactéria Xanthomonas spp. erradicando completamente o crescimento bacteriano (77 Ferreira, S.F. Tratamento fotodinâmico de sementes de tomate (Solanum licopersicon MILL.), na inativação da bactéria Xanthomonas spp. 2012. 61f. Dissertação (Mestrado em Química) – Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia.) e quando os corantes foram associados apresentaram maior efeito tóxico sobre a bactéria.

Longo & Azevedo (1313 Longo, J.P.F.; Azevedo, R.B. Efeito da terapia fotodinâmica mediada pelo azul de metileno sobre bactérias cariogênicas. Revista de Clínica e Pesquisa Odontológica, Curitiba, v.6, n.3, p.249-257, 2010.) encontraram resultados semelhantes a este trabalho, com o AM nas concentrações 25 e 50 µmol L-1 não apresentou efeito bactericida a Escherichia coli. Em contrapartida, a combinação deste corante com irradiação a laser promoveu redução significativa do número de colônias. Tal resultado mostra que, para o sucesso da terapia fotodinâmica é necessário à junção dos fatores luz e agente fotossensibilizador.

Os corantes fotossensíveis absorvem luz em um comprimento de onda específico, o oxigênio presente é transformado para o estado excitado, reagindo com o substrato local, formando espécies reativas de oxigênio, reagindo com a parede celular, ácidos nucleicos, peptídeos, lipídeos e proteínas (55 Donnelly, R.F.; Mccarron, P.A.; Tunney, M. Antifungal Photodynamic Therapy. Microbiological Reasearch, Jena, v.163, n.1, p.1-12, 2008.), e assim promovendo a morte celular por apoptose ou necrose (1414 Machado, A.E.H. Terapia Fotodinâmica: Princípios, potencial de aplicação e perspectivas. Química Nova, São Paulo, v.23, n.2, p.237-243, 2000., 1818 Pelegrino, A.C.; Carolina, M.M.; Gotardo, F.A.; Simioni, A.R.; Assis, M.D.; Tedesco, A.C. Photophysical properties of crowned porphyrins. Photochemistry and Photobiology, Oxford, v.81, n.4, p.771-776, 2005.). Esses corantes possuem a capacidade de passar pela membrana celular, pelos canais de proteínas, presentes nas bactérias Gram-negativas (2828 Usacheva, M.N.; Teichert, M.C.; Biel, M.A. Comparasion of the methylene blue and toluidine blue photobactericidal efficacy against gram-positive and gram-negative microorganisms. Lasers in Surgery and Medicine, New York, v.29, n.2, p.165-173, 2001.).

O corante AM possui afinidade por proteínas presentes na parede celular e na membrana citoplasmática bacteriana (2929 Usacheva, M.N.; Teichert, M.C.; Usachev, Y.M.; Sievert, C.E.; Biel, M.A. Interaction of the photobactericides Methylene Blue and Toluidine Blue with a fluorophore in Pseudomonas aeruginosa cells. Lasers in Sugery and Medicine, New York, v.40, n.1, p.55-61, 2008.). O AT liga-se aos polifosfatos da membrana, sendo capaz de produzir danos moleculares para proteínas, lipídeos e também ao mesossomo (geração de energia), sendo considerado um excelente destruidor da membrana, pela sua ação fotodinâmica (2828 Usacheva, M.N.; Teichert, M.C.; Biel, M.A. Comparasion of the methylene blue and toluidine blue photobactericidal efficacy against gram-positive and gram-negative microorganisms. Lasers in Surgery and Medicine, New York, v.29, n.2, p.165-173, 2001.).

Controle de Xanthomonas campestris pv. campestris em sementes de canola

Nas sementes inteiras de canola dos genótipos Terola 10A40 (2014), Hyola 61(2014) e Terola 10A40 (2013) tratadas com AM (100 µmol L-1), AT (50 µmol L-1), AM+AT (25 µmol L-1) e sem tratamento (testemunha), não foi detectada a presença de Xcc. A não detecção da bactéria na testemunha deve-se provavelmente à baixa taxa de infecção e o reduzido número de sementes utilizados (200 sementes), uma vez que as sementes estavam naturalmente contaminadas, determinado por testes preliminares do extrato de 1.000 sementes. Os corantes também podem ter sido efetivos no controle da bactéria nas sementes, onde não houve a detecção.

A superfície das sementes pode abrigar diversos patógenos e a porcentagem de bactérias presentes nas sementes é muito baixa, quase sempre menor que 1% (2323 Romeiro, R.S.; Moura, A.B.; Monteiro, A.J.A. A bioassay for detection and quantification of Xanthomonas campestris in sunflower seeds. Seed Technology, Lincoln, v.20, n.1, p.94-99, 1998.), o que dificulta a detecção, necessitando assim, nos testes um maior número de sementes. O desenvolvimento de uma doença está relacionado com a concentração de inóculo presente nas sementes, levando a transmissão semente-planta (99 Hirano, S.S.; Upper, C.D. Ecology and epidemiology of foliar bacterial plant pathogens. Annual Review of Phytopathology, Palo Alto, v.21, p.243-269, 1983., 1717 Nesmith, W.C. Influence of antagonists e controlled matric potential on the survival of Pseudomonas solanacearum in four North Carolina soils. Phytopathology, Saint Paul, v.75, n.11, p.1182-1187, 1985.).

Sementes de tomate inoculadas com Xanthomonas spp. quando tratadas com a associação dos corantes AM+AT a 50 μmol L-1 erradicaram 100% da bactéria (77 Ferreira, S.F. Tratamento fotodinâmico de sementes de tomate (Solanum licopersicon MILL.), na inativação da bactéria Xanthomonas spp. 2012. 61f. Dissertação (Mestrado em Química) – Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia.), demonstrando que a terapia fotodinâmica foi eficiente para o controle de bactéria nas sementes, sendo uma medida inovadora no tratamento de sementes e no controle de fitobactérias.

Germinação, índice de velocidade de emergência e emergência de plântulas de sementes de canola

Para a porcentagem de germinação de sementes dos diferentes genótipos de canola, tratadas com diferentes corantes, irradiadas ou não (Tabela 2), houve diferença significativa entre os corantes e o genótipo Terola 10A40 SS, as sementes não tratadas (testemunha) e as sementes tratadas com AM+AT (25 µmol L-1) apresentaram 80 e 77% de germinação, respectivamente, diferindo significativamente dos corantes AM 100 µmol L-1 (64%) e AT 50 µmol L-1 (70%) (Tabela 2).

Tabela 2
Porcentagem de germinação de sementes, de diferentes genótipos de canola, tratadas com diferentes corantes, irradiadas ou não. Uberlândia - MG, 2017.

Para o genótipo Terola 10A40 MT (Tabela 2), o tratamento das sementes com o corante AM (100 µmol L-1) na condição escuro apresentou 78% de germinação das sementes diferindo significativamente dos corantes AM+AT 25 μmol L-1 (96%), AT 50 μmol L-1 (93%) e da testemunha (92%). No entanto, quando as sementes foram tratadas com os diferentes corantes e irradiadas (89 a 91%) não diferiram significativamente da testemunha (89%) na germinação das sementes. Porém, as sementes tratadas com o corante AM 100 μmol L-1 e irradiadas (89%) diferiram significativamente das sementes não irradiadas (78%). No entanto, o tratamento das sementes com AM+AT 25 μmol L-1 houve um aumento na porcentagem de germinação das sementes (96%), quando comparado com a testemunha (92% escuro e 89% irradiado).

Para o genótipo Hyola 61 não houve interação significativa em nenhuma variável, na porcentagem de germinação, variando de 78 a 86%.

De acordo com Ferreira (77 Ferreira, S.F. Tratamento fotodinâmico de sementes de tomate (Solanum licopersicon MILL.), na inativação da bactéria Xanthomonas spp. 2012. 61f. Dissertação (Mestrado em Química) – Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia.) sementes de tomate tratadas com AM ou AT a 50 μmol L-1 e irradiadas apresentaram maior porcentagem de germinação do que a testemunha, resultados semelhantes ao obtido neste trabalho para o genótipo Terola10A40 MT, com AT a 50 μmol L-1. No entanto, houve uma redução na porcentagem de germinação das sementes de tomate (77 Ferreira, S.F. Tratamento fotodinâmico de sementes de tomate (Solanum licopersicon MILL.), na inativação da bactéria Xanthomonas spp. 2012. 61f. Dissertação (Mestrado em Química) – Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia.) quando tratadas com a combinação dos corantes AM+AT a 50 μmol L-1, divergindo dos resultados obtidos neste trabalho, com o uso dos corantes associados AM+AT na concentração de 25 µmol L-1, para as sementes do genótipo Terola 10A40 MT, onde houve um aumento na porcentagem de germinação, provavelmente devido a concentração dos corantes utilizada.

A formação de espécies reativas de oxigênio ativadas pelos corantes fotossensibilizadores podem danificar os componentes celulares das bactérias (1919 Perussi, J.R. Inativação fotodinâmica de microorganismos. Química Nova, São Paulo, v.30, n.4, p.988-994, 2007., 2020 Phoenix, D.A.; Sayed, Z.; Hussain, S.; Harris, F.; Wainwright, M. The phototoxicity of phenotiazinium derivaties against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. FEMS Immunology & Medical Microbiology, Amsterdam, v.39, n.1, p.17-22, 2003., 2121 Pinton, P.C.; Rossi, M.T.; Sala, R.; Venturini, M. Photodynamic Antifungal Chemotherapy. Photochemistry and Photobiology, Oxford, v.88, n.3, p.512-522, 2012.), enquanto que nas sementes, as espécies reativas de oxigênio podem estar presentes nas diferentes fases de desenvolvimento da mesma (1212 Leymarie, J.; Vitkauskaité, G.; Hoang, H. H.; Gendreau, E.; Chazoule, V.; Meimoun, P.; Corbineau, F.; Ei-Maarouf-Bouteau, H.; Bailly, C. Role of reactive oxygen species in the regulation of Arabidopsis seed dormancy. Plant and Cell Physiology, Kyoto, v.53, n.1, p.96-106, 2012.) e qualquer concentração fora do intervalo estabelecido pode impedir a germinação ou diminuir o vigor das sementes (11 Bailly, C.; El-Maarouf-Bouteau, H.; Corbineau, F. From intracellular signaling networks to cell death: the dual role of reactive oxygen species in seed physiology. Comptes Rendus Biologies, Paris, v.331, n.10, p.806-814, 2008.).

Também vale ressaltar a possibilidade de os corantes fotossensibilizadores impedirem o fluxo de água pelos poros da proteína aquaporina, responsável pelo transporte de água para a semente, dificultando a germinação (33 De Groot, B.L.; Grubmuller, H. Water permeation across biological membranes: mechanism and dynamics of aquaporin-1 and GlpF. Science, New York, v.294, n.5551, p.2353-2357, 2001.).

Para o índice de velocidade de emergência (IVE) (Tabela 3), as sementes de canola tratadas com o corante AT (50 µmol L-1) apresentaram os menores índices, independente do genótipo, quando comparado com demais corantes e a testemunha, irradiado e escuro. Os maiores IVE foram observados na testemunha, exceto no genótipo Terola 10A40 SS irradiado (55 Donnelly, R.F.; Mccarron, P.A.; Tunney, M. Antifungal Photodynamic Therapy. Microbiological Reasearch, Jena, v.163, n.1, p.1-12, 2008.,63).

Tabela 3
Índice de velocidades de emergência (IVE) de diferentes genótipos de canola, tratadas com diferentes corantes, irradiadas ou não, em condições de casa de vegetação. Uberlândia - MG, 2017.

No entanto, para o índice de velocidade de emergência de sementes de tomate, Ferreira (77 Ferreira, S.F. Tratamento fotodinâmico de sementes de tomate (Solanum licopersicon MILL.), na inativação da bactéria Xanthomonas spp. 2012. 61f. Dissertação (Mestrado em Química) – Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia.) observou que não houve diferença entre os corantes AM e AT a 50 µmol L-1, e os corantes não reduziram a qualidade fisiológica das sementes de tomate.

Para porcentagem de emergência de plântulas (Tabela 4) do genótipo Hyola 61 não houve diferença significativa entre a testemunha (84%) e as sementes tratadas com os corantes AM+AT (81%) e AM (62%), no entanto, diferiram significativamente do corante AT (36%).

Tabela 4
Porcentagem de emergência de plântulas de diferentes genótipos de canola, tratadas com diferentes corantes, irradiadas ou não, em condições de casa de vegetação. Uberlândia - MG, 2017.

No genótipo Terola 10A40 SS (Tabela 4), quando as sementes foram tratadas com o corante AT 50 µmol L-1 e irradiadas, a emergência de plântulas foi de 11%, diferindo significativamente das sementes não irradiadas (63%), enquanto que os demais tratamentos obtiveram valores acima de 54%. Quando as sementes foram mantidas no escuro, não houve diferença significativa entre os corantes e a testemunha. A interação entre as variáveis, irradiada e escuro, nos tratamentos AT 50 µmol L-1 e testemunha apresentaram diferenças, onde a irradiação afetou a emergência de plântulas.

A porcentagem de emergência de plântulas do genótipo Terola 10A40 MT foi de 93% quando as sementes foram tratadas com AM+AT 25 µmol L-1, diferindo significativamente do tratamento AT 50 µmol L-1 (64%).

Independente dos genótipos de canola analisados, o corante AT (50 µmol L-1) reduziu a emergência de plântulas em condições de casa de vegetação (Tabela 4). Em contrapartida, não houve diferença significativa entre os tratamentos AM 100 µmol L-1, AM+AT 25 µmol L-1 e a testemunha (Tabela 4) para os todos os genótipos. A combinação dos corantes AM+AT a 25 µmol L-1 aumentou a emergência de plântulas de canola, dos genótipos Terola 10A40 SS e Terola 10A40 MT, quando comparado com a testemunha.

A terapia fotodinâmica foi eficiente no controle de Xanthomonas spp. em sementes de tomate, e uma forma alternativa de controle de fitobactérias em sementes (77 Ferreira, S.F. Tratamento fotodinâmico de sementes de tomate (Solanum licopersicon MILL.), na inativação da bactéria Xanthomonas spp. 2012. 61f. Dissertação (Mestrado em Química) – Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia.). O fato das sementes de canola apresentar um tegumento menos rígido, do que as sementes de tomate, e a necessidade das sementes ficarem imersas por 40 minutos em concentrações elevadas dos corantes AM ou AT, durante o tratamento, isto pode interferir na qualidade fisiológica das sementes de canola.

Diante dos resultados obtidos, novos ensaios deverão ser conduzidos utilizando concentrações reduzidas dos corantes AM e AT, no tratamento de sementes de canola. Os corantes fotossensíveis pode ser uma alternativa contra bactérias fitopatogênicas, uma vez que a utilização de agroquímicos não são eficientes.

Os corantes Azul de Metileno, Azul de Toluidina e a associação deles, nas concentrações 100, 50 e 25 µmol L-1 respectivamente, quando irradiados foram eficientes para controle de Xcc in vitro.

A combinação dos corantes Azul de Metileno e Azul de Toluidina a 25 µmol L-1 pode ser utilizada no tratamento das sementes de canola, pois não afetou sua qualidade fisiológica.

O controle da bactéria Xanthomonas campestris pv. campestris nas sementes de canola naturalmente contaminadas, com os diferentes corantes e concentrações não foi possível ser determinado.

AGRADECIMENTOS

À Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão de bolsa a primeira autora.

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    15 Jan 2021
  • Data do Fascículo
    Oct-Dec 2020

Histórico

  • Recebido
    15 Maio 2018
  • Aceito
    20 Ago 2020
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