Detecção de Xanthomonas campestris pv. passiflorae em sementes de maracujá

Detection of Xanthomonas campestris pv. passiflorae in passion fruit seeds

RESUMO

A mancha óleo ou mancha bacteriana do maracujazeiro causada pela bactéria Xanthomonas campestris pv. passiflorae é uma das doenças de maior importância da cultura, levando a danos diretos na produção e na qualidade dos frutos. O uso de sementes livres do patógeno é a principal forma de controle da doença, sendo necessário a detecção da bactéria nas sementes para evitar sua introdução em áreas isentas. O objetivo do trabalho foi detectar a presença de X. campestris pv. passiflorae em sementes de maracujá em meio de cultura. O extrato de sementes inteiras ou quebradas, desinfestadas ou não, de dois genótipos de maracujá provenientes de Uberlândia, MG foram cultivadas nos meios de cultura, 523 e NAS, sem e com a adição de cicloheximida. Não houve diferença significativa entre os meios de cultura no crescimento bacteriano. Os meios de cultura 523 e NAS, com adição de cicloheximida e o uso de sementes de maracujá quebradas foram eficientes para a detecção de X. campestris pv. passiflorae, os quais podem ser utilizados em rotina de laboratório para a detecção da bactéria em sementes.

Palavras-chave
Mancha bacteriana; mancha óleo; meio de cultura; Passiflora edulis

ABSTRACT

Oil spot or bacterial spot of passion fruit, caused by the bacterium Xanthomonas campestris pv. passiflorae, is one of the most important diseases affecting this crop, leading to direct damage to fruit production and quality. The use of pathogen-free seeds is the major form of disease control, requiring bacterial detection in the seeds to prevent introduction into exempt areas. The objective of the present study was to detect the presence of X. campestris pv. passiflorae in passion fruit seeds in culture medium. The extract of whole or broken seeds, disinfected or not, from two passion fruit genotypes from Uberlândia, Minas Gerais State (MG), Brazil, were cultivated in the culture media 523 and NAS without and with the addition of cycloheximide. There was no significant difference between culture media for bacterial growth. Culture media 523 and NAS with the addition of cycloheximide and the use of broken passion fruit seeds were efficient at detecting X. campestris pv. passiflorae, which can be used in laboratory routine for detection of this bacterium in seeds.

Keywords
Bacterial spot; oil spot; culture medium; Passiflora edulis

A mancha bacteriana, mancha óleo ou morte-precoce (¹³) do maracujazeiro, causada pela bactéria Xanthomonas campestris pv. passiflorae (Pereira) Dye, ocasiona grande prejuízo à cultura (³), principalmente em condições de temperatura por volta de 30°C e umidade relativa do ar em torno de 80% (¹³).

A bactéria sobrevive em restos culturais (³), mudas e sementes, podendo ser disseminada e introduzida em novas áreas de cultivo. Como medida de controle recomenda-se o uso de sementes sadias, identificadas a partir de análises laboratoriais.

Diversos meios de cultura já foram descritos para a detecção de bactérias em sementes, como Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli em sementes de feijão (¹⁰), Xanthomonas axonopodis pv. glycines em sementes de soja (¹⁴), Pantoea ananatis em sementes de milho (⁵) e Xanthomonas spp. em sementes de tomate (⁷). Os meios de cultura apresentam vantagens em relação a técnicas moleculares e imunológicas (⁹) por serem de fácil execução, por apresentarem especificidade e sensibilidade (¹²), além de não requerer equipamentos sofisticados. No entanto, para a detecção de X. campestris pv. passiflorae em sementes de maracujá ainda não há uma metodologia descrita na literatura.

Diante disso, o objetivo do trabalho foi detectar a presença de Xanthomonas campestris pv. passiflorae em sementes do maracujá em meios de cultura.

Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Bacteriologia Vegetal (LABAC), do Instituto de Ciências Agrárias (ICIAG), da Universidade Federal de Uberlândia (UFU) em Uberlândia, Minas Gerais.

O isolado UFU A45 de X. campestris pv. passiflorae pertencente à coleção de trabalho do LABAC foi cultivado em meio de cultura 523 (⁴), a 28 ºC por 48 horas. A suspensão bacteriana foi preparada em água filtrada esterilizada, ajustada em espectrofotômetro para OD₆₀₀= 0,3 (10⁸ UFC mL^-1), posteriormente diluída em série (10^-1 a 10^-7) e 100 µL cultivado sobre os meios de cultura 523 e NAS (⁸), sem e com adição de 1 mL de cicloheximida (50 mg mL^-1) por litro de meio de cultura. As placas foram incubadas a 28 ºC por 4 dias e em seguida contadas as colônias bacterianas, calculando-se o número de UFC mL^-1. O ensaio foi conduzido em esquema fatorial 2 x 2 (2 meios de cultura, 2 sem/com fungicida), com 3 repetições. As médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade em software SISVAR (¹).

Para a detecção de X. campestris pv. passiflorae em sementes de maracujá foram avaliadas sementes de dois genótipos de maracujá, um amarelo (Passiflora edulis f. flavicarpa) e um roxo (P. edulis), provenientes de plantas doentes, com sintomas da bacteriose, da estação experimental do ICIAG/UFU, de Uberlândia – MG, ano 2015.

Para a detecção da bactéria nas sementes foram utilizados 7 g (aproximadamente 270 sementes) de sementes maracujá inteiras ou quebradas (com auxílio de um martelo), sem e com desinfestação com hipoclorito de sódio a 3%, por 2 minutos, para cada tratamento. Em seguida as sementes foram colocadas em Erlenmeyers esterilizados, adicionando 14 mL de água filtrada esterilizada e mantidas por 18 h sob refrigeração a 5 ºC. Em seguida, o extrato das sementes foi diluído em série (10^-1 a 10^-2) e cultivado nos meios de cultura descritos anteriormente, e as placas incubadas a 28 ºC por quatro dias. Posteriormente foram quantificadas as unidades formadoras de colônia (UFC mL^-1). Para o método das sementes quebradas e desinfestadas, as sementes foram previamente desinfestadas e posteriormente quebradas.

As colônias amarelas suspeitas foram repicadas para o meio 523 e realizados os testes, Gram, YDC, Oxidação/Fermentação, reação de hipersensibilidade, asparagina (⁸) e inoculação no hospedeiro (²).

O experimento foi conduzido em esquema fatorial (2 genótipos x 2 meios de cultura x 2 sem/com desinfestação x 2 sementes inteiras/quebradas x 2 sem/com fungicida) com três repetições. As médias obtidas foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade pelo software SISVAR (¹).

A partir da suspensão bacteriana de X. campestris pv. passiflorae não houve diferença significativa no número de colônias, entre os meios de cultura 523 e NAS, sem ou com adição de cicloheximida, onde as médias variaram de 2,1 a 2,5 x 10⁸ UFC mL^-1. O uso de cicloheximida não interferiu no crescimento bacteriano e as colônias apresentaram coloração amarela e convexa nos meios de cultura (Figura 1A e B), e no meio NAS pode ser observado a formação de um halo claro ao redor da colônia, devido a hidrólise do amido (Figura 1B). Os meios de cultura 523 e NAS foram eficientes para a detecção da bactéria.

Figura 1
Colônias amarela de Xanthomonas campestris pv. passiflorae em meio 523(A) e em meio NAS (B), com adição de cicloheximida.

Resultados semelhantes foram obtidos por Mehta et al. (⁶) na detecção de Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum em sementes de algodão, onde os meios semi-seletivos avaliados não diferiram estatisticamente no número de colônias, em relação ao meio padrão. Assim como, o uso de meio de cultura semi-seletivo foi eficiente para a detecção de Xanthomonas spp. em sementes de tomate e apresentou índice de supressividade satisfatório (⁷).

Para a detecção da bactéria nas sementes de maracujá o uso de sementes quebradas desinfestadas diferiu significativamente dos demais métodos, para os dois genótipos de maracujá, roxo e amarelo (Tabela 1). A bactéria encontra-se localizada no interior das sementes, e quando quebradas, facilita o fluxo bacteriano para a água, permitindo sua detecção.

Tabela 1
Detecção de Xanthomonas campestris pv. passiflorae em sementes de maracujá, por diferentes métodos de extração e genótipos.

	Genótipos (UFC g-1mL-1)
Sementes	Roxo	Amarelo
CV (%)	42,79
Inteiras, desinfestadas	0 bA	0 bA
Inteiras, não desinfestadas	0 bA	0 bA
Quebradas, não desinfestadas	0 bA	0 bA
Quebradas, desinfestadas	2,4 aB	22,6 aA

• Médias seguidas por letras distintas, minúsculas na coluna e maiúsculas na linha, diferem significativamente entre si, pelo teste de Tukey a 0,05.

A adição do fungicida cicloheximida, aos meios de cultura 523 e NAS não inibiu o crescimento da X. campestris pv. passiflorae nos meios de cultura avaliados (Tabela 2). O método de sementes quebradas e desinfestadas foi o melhor, nos dois meios de cultura avaliados, demonstrando que a desinfestação com hipoclorito de sódio não afetou o crescimento da bactéria. Os meios de cultura 523 e NAS foram eficientes para a detecção da bactéria nas sementes de maracujá.

A bactéria foi detectada nas sementes de maracujá, nos meios 523 e NAS, onde as colônias apresentaram coloração amarela e convexa. Os isolados foram caracterizados como Gram negativo, colônias amarelas em YDC, aeróbicas, reação de hipersensibilidade em folhas de fumo positiva, asparagina negativa, patogenicidade no hospedeiro positivo, aos 8 dias da inoculação, com sintomas de lesão necrótica no limbo foliar e identificados como X. campestris pv. passiflorae.

Tabela 2
Detecção de Xanthomonas campestris pv. passiflorae em sementes de maracujá, por diferentes métodos de extração em diferentes meios de cultura.

	Meio de cultura (UFC g-1mL-1)
Sementes	523	523 + Cicloheximida	NAS	NAS + Cicloheximida
CV (%)	42,79
Inteiras, desinfestadas	0 bA	0 bA	0 bA	0 bA
Inteiras, não desinfestadas	0 bA	0 bA	0 bA	0 bA
Quebradas, não desinfestadas	0 bA	0 bA	0 bA	0 bA
Quebradas, desinfestadas	10,8 aA	14 aA	12,3 aA	13 aA

• Médias seguidas por letras distintas, minúsculas na coluna e maiúsculas na linha, diferem significativamente entre si, pelo teste de Tukey a 0,05.

No presente trabalho, a adição de fungicida cicloheximida ao meio de cultura foi importante, pois inibiu o crescimento de microrganismos saprófitos, facilitando a detecção de X. campestris pv. passiflorae nas sementes de maracujá, o mesmo também foi observado para a detecção de X. axonopodis pv. glycines em sementes de soja (¹⁴). Também neste trabalho, sementes de maracujá provenientes de plantas assintomáticas foram avaliadas, no entanto não houve detecção da bactéria nas sementes (dados não demonstrados).

De acordo com Torres et al. (¹¹) testes laboratoriais foram fundamentais para a detecção de X. axonopodis pv. phaseoli em sementes de feijão, sendo a produção de sementes com alto padrão sanitário, uma das medidas mais eficientes de controle da bactéria.

Para os produtores de maracujá é importante a utilização de sementes livres de bactéria, evitando a produção de mudas doentes e posteriormente a disseminação da patógeno na área de cultivo, assim a qualidade sanitária das sementes de maracujá deve ser avaliada em análises laboratoriais. As sementes de maracujá são duras, quando comparadas com sementes de soja e feijão, por isso é importante que ela seja quebrada, para facilitar o fluxo bacteriano para a água e sua posterior detecção em meio de cultura. Também é importante que as sementes sejam desinfestadas para evitar o crescimento de microrganismos saprófitas e para facilitar a detecção da bactéria nas sementes.

Portanto, os meios de cultura 523 e NAS, com adição de cicloheximida e o uso de sementes de maracujá desinfestadas e quebradas foram eficientes para a detecção de Xanthomonas campestris pv. passiflorae, os quais podem ser utilizados em rotina de laboratório para a detecção da bactéria em sementes.

REFERÊNCIAS

• ¹
  Ferreira, D.F. SISVAR: Sistema de análise de variância. Versão 5.3. Lavras, MG: UFLA, 2010.
• ²
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  » https://doi.org/10.1590/0100-5405/185793
• ³
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  » https://doi.org/10.1590/S0100-41582005000500005
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  Tebaldi, N.D.; Souza, R.M.; Machado, J.C. Detecção de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli em sementes de feijão em meio de cultura semi-seletivo. Fitopatologia Brasileira, Brasília, DF, v.32, n.1, p.56-58, 2007. DOI: 10.1590/S0100-41582007000100008.
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• ¹¹
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  » https://doi.org/10.1590/0100-5405/2127

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  23 Set 2022
• Data do Fascículo
  Apr-Jun 2022

Histórico

• Recebido
  02 Set 2020
• Aceito
  23 Abr 2022