Estrutura genética em microescala espacial de Myrcia splendens (Myrtaceae)

Fine-scale genetic structure of Myrcia splendens (Myrtaceae)

Estrutura genética em microescala espacial de Myrcia splendens (Myrtaceae)

Fine-scale genetic structure of Myrcia splendens (Myrtaceae)

Murilo Malveira Brandão^I; Fábio de Almeida Vieira^II; Dulcinéia de Carvalho^III

^IPrograma de Pós-Graduação em Ecologia Aplicada - Universidade Federal de Lavras, UFLA, Brasil, E-mail: [e-mail]

^IIUniversidade Federal do Rio Grande do Norte, UFRN, Brasil, E-mail: [e-mail]

^IIIUniversidade Federal de Lavras, UFLA, Brasil, E-mail: [e-mail]

RESUMO

Em ecossistemas fragmentados, comuns no sul de Minas Gerais, os corredores de vegetação são elementos de grande importância ecológica para o fluxo gênico. Os corredores de vegetação na região de Lavras, MG, são estreitos (entre 3 e 6m), de vegetação secundária formada pela colonização de valas e interligam fragmentos remanescentes de vegetação primária. Nestes dois ambientes, é comum a ocorrência da espécie Myrcia splendens, que produz frutos de dispersão zoocórica. Objetivou-se, neste trabalho, a avaliação da estrutura genética espacial em microescala de M. splendens nos ambientes de fragmentos e nas suas conexões. Dez primers ISSR foram utilizados em 168 árvores distribuídas nos cinco fragmentos e em 104 árvores nos quatro corredores de vegetação, gerando um total de 70 locos polimórficos. A AMOVA mostrou que a maior parte da diversidade genética ocorre dentro das populações (96,49% nos fragmentos e 91,15% nos corredores). Nas formações primárias (F1 a F5) e nos corredores C1 e C2 os genótipos estão distribuídos de maneira aleatória. Nos corredores C3 e C4 observou-se estruturação genética espacial, com valores de coancestria positiva e significativa na primeira classe de distância, sendo os valores de Sp de 0,012 (P = 0,009) e 0,014 (P = 0,029), respectivamente.

Palavras-chave: Coancestria, Diversidade genética e Espécie arbórea.

ABSTRACT

In fragmented ecosystems, very common in southern Minas Gerais, vegetation corridors are ecologically important elements for gene flow. Vegetation corridors in Lavras, MG, are narrow (from 3 to 6m), with secondary vegetation formed by trench colonization and they connect primary vegetation fragments. In both environments, it is common the occurrence of Myrcia splendens, which produces fruit with zoocoric dispersion. The objective of this work was to evaluate spatial genetic structure in fine-scale of Myrcia splendens (SW.) in environments with fragments and in their connections. Ten ISSR primers were used to access the genetic patterns in 168 trees distributed in five fragments and in 104 trees distributed in four vegetation corridors, totalizing 70 polymorphic loci. AMOVA revealed that most of the genetic diversities occurs within the the populations (96.49% in the fragments and 91.15% in the corridors). In the primary formations (F1 to F5) and in the corridors C1 and C2, the genotypes are randomly distributed. It was noted in C3 and C4 corridors, spatial genetic structure with positive and significant coancestry in the first distance class with Sp = 0.012 (P = 0.009) and 0.014 (P = 0.029), respectively.

Keywords: Coancestry, Genetic diversity and Tree species.

1. INTRODUÇÃO

A Floresta Estacional Semidecidual é uma fitofisionomia característica de grande parte de Minas Gerais, apresentando alta diversidade florística. A rápida devastação dessas florestas alterou seus ecossistemas primários, confinando-os em áreas protegidas ou em locais inadequados para a agricultura, resultando em remanescentes florestais. Essa fragmentação da paisagem tem efeitos em processos ecológicos (COUVET, 2002) e genéticos (LOWE et al., 2005). Portanto, a conexão de fragmentos por corredores de vegetação é um importante elemento mitigador dos efeitos negativos da fragmentação (KIRCHNER et al., 2003; VIEIRA; CARVALHO, 2008).

A paisagem do sul de Minas Gerais é caracterizada pela presença de pequenos fragmentos florestais, circundados por pastagem e cultivo de milho ou café. Esses fragmentos são conectados por corredores de vegetação secundária, originados da colonização de valas. O conhecimento e o entendimento da diversidade genética e estrutura genética espacial em microescala são importantes para o manejo dos recursos genéticos florestais e também para avaliar os impactos da exploração e fragmentação e estabelecer estratégias de amostragem em populações naturais (MORAES et al., 2005; SOUZA et al., 2007).

A diversidade genética de populações naturais de plantas tem sido quantificada por marcadores moleculares como ISSR (GE et al., 2005; MELONI et al., 2006; KUMAR et al., 2010). Marcadores ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) são dominantes, desenvolvidos por Zietjiewicz et al. (1994), e não requerem informações prévias de sequências de DNA da espécie-alvo. Em comparação com outros marcadores baseados em PCR não específicos, como RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), ISSR produzem fragmentos com grande reprodutibilidade e baixo custo de operação. A técnica de ISSR utiliza primers baseados em SSR (microssatélite) ancorado na extremidade 5' ou 3' da sequência, com 2 a 4 bases de purina ou pirimidina.

No sistema de fragmentos-corredores do Município de Lavras (MG), é comum a espécie Myrcia splendens (SW.) DC. (Myrtaceae), principalmente nas bordas dos fragmentos. Sua ocorrência vai desde o México até o sul do Brasil e, segundo Oliveira-Filho (2006), algumas sinonímias são M. acutata DC., M. rostrata DC., M. communis Berg e M. fallax (Rich.) DC. Myrcia splendens foi escolhida para este estudo, devido à sua ocorrência em todos os corredores e fragmentos analisados, sendo considerada uma espécie modelo para futuras comparações com espécies de vida semelhante. A espécie é polinizada por abelhas e dispersão zoocórica (GRESSLER et al., 2006).

Este trabalho teve como objetivos caracterizar os padrões da variabilidade genética dentro e entre populações e a estrutura genética em microescala espacial de Myrcia splendens, em cinco fragmentos e quatro corredores de vegetação, a partir de dados gerados pelos marcadores moleculares ISSR.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. Local de estudo e amostragem

O local do estudo situa-se no município de Lavras, sul de Minas Gerais (Figura 1) entre as coordenadas 21º17'33"S e 44º59'15"W, 21º18'11"S e 44º59'18"W. Os fragmentos de floresta semidecidual possuem de 1 a 11,8 ha e são conectados por corredores de vegetação secundária, com largura de 3 a 6 m e extensão variando de 367 m a 1039 m. Todas as árvores reprodutivas de M. splendens foram amostradas e georreferenciadas espacialmente por meio do Sistema de Posicionamento Global (GPS), sendo 168 árvores nos fragmentos e 104 nos corredores. Amostras foliares de cada árvore foram identificadas e acondicionadas em gelo. As amostras foram armazenadas em deep freezer até o momento da extração do DNA.

2.2. Extração do DNA e eletroforese

A extração do DNA foi realizada pelo método CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) com 0,2% de b-mercaptanol, utilizando 200 mg de folhas, seguida da extração com clorofórmio e álcool isoamílico. Amostras do DNA de cada árvore foram amplificadas pela técnica de PCR (Polymerase chain reaction), utilizando-se primers ISSR. Para a reação de PCR, foi utilizado o volume total de 12 ml, sendo 2 ml de DNA diluídos, e 10 ml do coquetel de reação contendo 1,2 ml de tampão PCR 10X (500mM Tris-HCl pH 8,0; 200mM KCl; 2,5 mg.mL^-1 BSA; 200mM Tartrazine e 1% Ficoll), 1,04 ml dNTP + MgCl₂ (dNTP a 2,5mM; MgCl₂ a 25mM), 0,96 ml de diluente da enzima Taq polimerase, 0,3 ml Taq polimerase (5u.ml^-1) e 2 ml primer ISSR (2mM), e completado o volume com água ultrapura. O programa de amplificação foi de 37 ciclos de 1 minuto a 94 ºC, 47 ºC por 2 minutos e 72 ºC por 2 minutos. A análise dos produtos da reação foi realizada em géis de agarose 1,5%, corados com brometo de etídio e submetidos a uma voltagem de 120 V por 2h30min. Para o controle de pureza dos componentes do coquetel, foram incluídas amostras sem DNA (controle negativo) em cada reação.

2.3. Análise dos dados

A partir das análises das fotografias dos géis, os marcadores ISSR foram genotipados quanto à presença (1) e à ausência (0) das bandas, gerando uma matriz binária, utilizada para a divisão da variância entre seus componentes dentro e entre populações (níveis hierárquicos). A análise de variância molecular (AMOVA) foi realizada de acordo com Excoffier et al. (1992), com o auxílio do programa ARLEQUIN, versão 3.11 (EXCOFFIER et al., 2007). Assumindo que os indivíduos dentro das populações possuem o mesmo padrão de cruzamento, calculou-se a matriz de distância fenotípica para os pares de comparações, utilizando um coeficiente de similaridade genética. Para o cálculo da AMOVA, foi utilizado, como coeficiente, o quadrado das distâncias euclidianas, análogo às análises de Excoffier et al. (1992). A significância dos componentes da variância foi testada com 10.000 permutações.

Para a estrutura genética espacial (EGE), foi estimado o valor de coancestria pelo coeficiente kinship, entre os pares de indivíduos para as diferentes classes de distância (HARDY, 2003), com o uso do programa SPAGeDi, versão 1.2g (HARDY; VEKEMANS, 2002). Na análise, foi considerado coeficiente de endogamia igual a zero. O coeficiente kinship é dado por F_ij = (Q_ij Q_m / 1 Q_m), em que F_ijé o coeficiente kinship de coancestria genética entre i e j; Q_ij é a probabilidade de as amostragens aleatórias de i e j serem idênticas por ascendência; Q_m é a probabilidade média de que amostragem aleatória feita na população seja idêntica por ascendência.

O erro-padrão da média das estimativas foi obtido por reamostragem jackknife e, a partir dele, foram determinados os intervalos de confiança a 95% de probabilidade do coeficiente de coancestria médio estimado para cada classe de distância. A ausência de EGE foi testada dentro de cada classe de distância, utilizando-se 1.000 permutações (HARDY; VEKEMANS, 2002). A magnitude da EGE foi calculada usando a estatística Sp (VEKEMANS; HARDY, 2004): Sp = -b_log/(1-F_{ij (1)}), em que b_log é a inclinação da curva de regressão do coeficiente de coancestria; F_ij(1) é a média do coeficiente de coancestria da primeira classe de distância (F_ij). Os valores Sp foram utilizados para comparar a extensão da estrutura genética espacial entre as populações.

3. RESULTADOS

Os 10 primers ISSR utilizados geraram 70 locos polimórficos (Tabela 1). A análise de variância molecular (AMOVA) indicou que a maior parte da diversidade genética de M. splendens encontra-se dentro das populações, tanto nos ambientes de vegetação primária (96,5%) quanto nos ambientes de vegetação secundária (91,1%), (Tabela 2).

Os resultados da estatística Sp mostram que não há estruturação genética (P > 0,05) nos fragmentos, portanto os genótipos apresentam distribuição aleatória (Tabela 3). Resultados semelhantes foram observados para os corredores C1 e C2. Os corredores C3 e C4 apresentaram estruturação genética na primeira classe de distância (Tabela 3 e Figura 2). O corredor de vegetação C3 apresentou valor de coancestria positiva com F_ij de 0,015 (P = 0,009) na primeira classe de distância (70 m), e no corredor C4 o valor de F_ij foi de 0,050 (P = 0,029) também na primeira classe de distância (27 m). Analisando o sistema corredor de vegetação-fragmentos, observa-se que há estruturação genética, sendo F_ij de 0,036 e significativo (P = 0,000) na primeira classe (184 m).

Na análise de coancestria realizada somente nos corredores, os valores nas duas primeiras classes mostram que as árvores próximas são mais semelhantes entre si (Figura 2) com valores negativos e significativos (F_ij = -0,020; P = 0,000). A partir da sexta classe de distância em diante, as árvores são mais divergentes geneticamente em distância superior a 1.247 m (Figura 2).

4. DISCUSSÃO

4.1. AMOVA

Estimativas feitas com dados oriundos de marcadores moleculares dominantes, em populações de plantas que possuem fecundação cruzada, e calculadas pela AMOVA revelam que, em média, 28% da divergência genética estão entre as populações (NYBOM; BARTISH, 2000). Os resultados de divergência genética obtidos em nosso estudo revelam que 3,5% e 8,9% encontram-se distribuídos entre os fragmentos e corredores, respectivamente. Esses dados são inferiores aos relatados por Nybom e Bartish (2000), mas estão em concordância com aqueles obtidos por Goulart et al. (2005) em Mabea fistulifera, espécie arbórea típica de borda de floresta semidecidual e Oliveira et al. (2008) em Dimorphandra mollis, espécie característica do Cerrado, onde 8,97% e 10,3% de divergência genética foram observadas entre as populações, respectivamente. No mesmo sistema de corredores-fragmentos aqui analisado, Vieira e Carvalho (2008) encontraram uma divergência genética de 3,0% entre populações de Protium spruceanum.

Os resultados de variabilidade genética mostram que a maior proporção da variabilidade genética encontra-se dentro das populações (Fragmentos 96,5% e corredores 91,1%) e estão de acordo com os relatados para outras espécies arbóreas tropicais de fecundação cruzada e vida longa (LOVELESS; HAMRICK, 1984; WHITE et al., 1999; NYBOM, 2004; APTE et al., 2006). Os dados obtidos pela AMOVA podem ser devidos à proximidade dos fragmentos e pelo fato de estarem conectados pelos corredores de vegetação. A divergência entre populações é reduzida com o aumento do fluxo alélico, realizado via pólen e, ou, sementes. A polinização da M. splendens é entomofílica e a dispersão dos diásporos é zoocórica, realizada principalmente por pássaros, pequenos roedores e macacos (GRESSLER et al., 2006). Esses vetores provavelmente têm sua migração entre fragmentos facilitada pelos corredores de vegetação, o que resulta na baixa divergência genética entre os fragmentos.

4.2. Distribuição espacial

Os resultados dos correlogramas (Figura 2) indicam a ocorrência de distribuição aleatória dos genótipos de M. splendens nos fragmentos, devido, possivelmente, ao suficiente fluxo alélico, evitando o agrupamento de indivíduos aparentados. Por outro lado, a estruturação genética detectada nos corredores indica a ocorrência de uma dispersão limitada de sementes no evento de colonização das valas, resultando em agregação dos genótipos das árvores.

A dispersão limitada de pólen e sementes tem sido reportada como a principal causa de estruturação genética espacial dentro de populações de plantas (LATTA et al., 1998; SMOUSE; PEAKALL, 1999). Em estudo realizado em microescala com a espécie Euterpe edulis no sul de Minas Gerais, Vieira et al. (2010) detectaram estruturação genética espacial dos genótipos, sendo esta atribuída à dispersão das sementes nas vizinhanças das árvores maternas.

As classes de distâncias representadas nos correlogramas (Figura 2), além de informação importante para o manejo, é uma indicação da distância mínima entre indivíduos amostrados para programas de melhoramento genético da espécie e para a coleta de sementes para programas de recuperação de áreas degradadas, de forma a obter maior variabilidade genética (KELLY et al., 2004; CLOUTIER et al., 2007). Portanto, os dados obtidos para M. splendens apontam que a distância de 70 m é a ideal para capturar maior variabilidade genética, evitando assim a coleta de sementes que possuem uma estrutura de famílias.

A média de Sp de 0,0068 obtida para M. splendens foi menor que os valores relatados para espécies com dispersão de sementes efetuada por animais (Sp= 0,0088) (VEKEMANS; HARDY, 2004). Entretanto, este valor foi próximo ao encontrado para a espécie Sextonia rubra (Lauraceae) (Sp= 0,006), que é uma espécie hermafrodita, com polinização por insetos e dispersão de sementes por pássaros (HARDY et al., 2006).

5. CONCLUSÃO

A maior parte da diversidade genética da espécie Myrcia splendens encontra-se dentro das populações. Nos fragmentos, não foi observada estruturação genética espacial, indicando que os genótipos de M. splendens estão distribuídos aleatoriamente. Nos corredores C1 e C2, os genótipos das árvores de M. splendens também se encontram distribuídos aleatoriamente. Nos corredores C3 e C4, M. splendens apresentou valores de coancestria positiva a 70 m e 20 m, respectivamente, indicando que as árvores apresentam estrutura de família em curtas distâncias.

6. AGRADECIMENTOS

À Universidade Federal de Lavras, aos membros do Laboratório de Conservação Genética de Espécies Arbóreas (www.dcf.ufla/conservacao). À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), pela concessão da bolsa de estudos. À FAPEMIG pelo apoio financeiro. Aos revisores anônimos, que contribuíram com sugestões valiosas para a melhoria do manuscrito.

7. REFERÊNCIAS

Recebido em 18.02.2009 e aceito para publicação em 02.05.2011.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  10 Out 2011
• Data do Fascículo
  Out 2011

Histórico

• Recebido
  18 Fev 2009
• Aceito
  02 Maio 2011