O impacto na expressão agnors e apoptose na próstata do hamster-mesocricetus auratus (HMA) submetido à aplicação de finasterida

Resumos

OBJETIVO: Avaliar o impacto na expressão AgNORs e apoptose na próstata do hamster-Mesocricetus auratus (hMa) submetido à aplicação de finasterida. MÉTODOS: Vinte roedores da espécie hMa (n=20), machos foram separados aleatoriamente em grupos de dez animais: grupo-Finasterida (n=10) e grupo-Controle (n=10). No grupo-finasterida foi administrado 7,14 ng/mL de finasterida, subcutâneo (SC), no dorso, três vezes por semana, por 90 dias. Foi avaliada a expressão AgNORs como marcador de proliferação celular e a apoptose como marcador de morte celular. RESULTADOS: A expressão de AgNORs foi menor no grupo-finasterida, 2,846±0,877 versus 3,68 ±1,07 grumos argilófilos por micrômetro ao quadrado (µm²) no grupo-controle, p= < 0,0001. A apoptose foi mais frequente no grupo-finasterida, 53,62±1,389 versus 14,76 ± 2,137 µm² no grupo-controle, p= 0,0408. CONCLUSÃO: Observou-se diminuição da expressão de AgNORs e promoção da apoptose na próstata dos roedores em estudo, que foram submetidos à aplicação de finasterida.

Finasterida; Próstata; Mesocricetus

OBJECTIVE: To evaluate the impact on the AgNORs expression and apoptosis in the prostate of the hamster-Mesocricetus auratus (HMA) submitted to the application of finasteride. METHODS: Twenty male rodents of the species HMA (n = 20) were randomly assigned to groups of ten animals: Finasteride group (n = 10) and the Control group (n = 10). In the finasteride group 7.14 ng / mL finasteride was subcutaneously (SC) administered on the back of the animals three times a week for 90 days. AgNOR expression was evaluated as a marker of cell proliferation and apoptosis as a marker of cell death. RESULTS: The expression of AgNORs was lower in the finasteride group, 2.846 ± 0.877 vs. 3.68 ± 1.07 argyrophilic regions per square micrometer (µm2) in the control group, p = <0.0001. Apoptosis was more frequent in the finasteride group, 53.62 ± 1.389 versus 14.76 ± 2.13 per µm2 in the control group, p = 0.0408. CONCLUSION: We observed decreased expression of AgNORs and promotion of apoptosis in the prostate of rodents treated with finasteride.

Finasteride; Prostate; Mesocricetus

ARTIGOS ORIGINAIS

O impacto na expressão agnors e apoptose na próstata do hamster-mesocricetus auratus (HMA) submetido à aplicação de finasterida

Dimas José Araújo Vidigal^I; Alcino Lázaro da Silva, ECBC-MG^II; Felipe Eduardo Costa Vidigal^III

^IMembro Titular da Sociedade Brasileira de Urologia (TISBU)

^IIProfessor Emérito da Faculdade de Medicina da UFMG-MG-BR

^IIIGraduando em Medicina da Faculdade de Ciências Médicas e da Saúde de Juiz de Fora (FCMS-SUPREMA)- MG-BR

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

OBJETIVO: Avaliar o impacto na expressão AgNORs e apoptose na próstata do hamster-Mesocricetus auratus (hMa) submetido à aplicação de finasterida.

MÉTODOS: Vinte roedores da espécie hMa (n=20), machos foram separados aleatoriamente em grupos de dez animais: grupo-Finasterida (n=10) e grupo-Controle (n=10). No grupo-finasterida foi administrado 7,14 ng/mL de finasterida, subcutâneo (SC), no dorso, três vezes por semana, por 90 dias. Foi avaliada a expressão AgNORs como marcador de proliferação celular e a apoptose como marcador de morte celular.

RESULTADOS: A expressão de AgNORs foi menor no grupo-finasterida, 2,846±0,877 versus 3,68 ±1,07 grumos argilófilos por micrômetro ao quadrado (µm²) no grupo-controle, p= < 0,0001. A apoptose foi mais frequente no grupo-finasterida, 53,62±1,389 versus 14,76 ± 2,137 µm² no grupo-controle, p= 0,0408.

CONCLUSÃO: Observou-se diminuição da expressão de AgNORs e promoção da apoptose na próstata dos roedores em estudo, que foram submetidos à aplicação de finasterida.

Descritores: Finasterida. Próstata. Mesocricetus.

INTRODUÇÃO

Trabalhos recentes têm mostrado benefícios do uso de finasterida nos processos proliferativos da próstata^1-3. Esses estudos estão fundamentados em pesquisas clínicas⁴. Investigações em animais com marcadores de proliferação e morte celular podem ser de interesse para comprovação desses resultados.

A anatomia, a histologia e a fisiologia da próstata do hamster-Mesocricetus auratus (hMa) foram descritas por Toma et al.⁵, e propiciam realizar na próstata desses animais experimentos com medicações que possam atuar nessa glândula.

Vidigal et al.⁶, estudaram as próstatas do hMa, quando tiveram a oportunidade de conhecer a anatomia e histologia dessa glândula. Associando a teoria com a prática, percebeu-se que esses roedores eram apropriados para o desenvolvimento desta pesquisa como animais de experimento.

O objetivo deste estudo, portanto, é avaliar o impacto na expressão AgNORs (Argyrophilic Nuclear Organizer Regions - Regiões Argirofílicas Organizadoras Nucleolares), marcador de proliferação celular e Apoptose, marcador de morte celular, na próstata de hMa que fez uso de finasterida.

MÉTODOS

Delineamento experimental

Este trabalho foi realizado de acordo com as recomendações das Normas Internacionais de Proteção aos Animais e do Código Brasileiro de Experimentação Animal (1988) e também por ter sido aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade Presidente Antônio Carlos (UNIPAC), Barbacena, Minas Gerais, Brasil. sob o nº 129/06.

Foram estudados 20 roedores da espécie hMa, adultos, selecionados casualmente entre os disponíveis no biotério, com idade superior a um ano, distribuídos em dois grupos: grupo-finasterida, formado por dez animais (n=10) e grupo-controle também formado por dez animais (n=10).

Os hamsteres foram adquiridos no biotério do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (ICB-UFMG), Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil. O grupo-Finasterida pesava aproximadamente 145±15,27g e o grupo-controle pesava cerca de 129±18,82g.

Os animais ficaram alojados em gaiolas de plástico medindo 40cmx60cmx20cm (dois animais por unidade) forradas com maravalhas próprias para sua acomodação. Alimentação ad libitum: ração preparada para hamsteres e semente de girassol, amendoim e milho. Foi oferecida aos animais, água potável em bebedouros de sucção. Esses ficaram expostos à luz indireta das 6h as 18h e à escuridão por doze horas, a uma temperatura de 21⁰C.

O grupo-finasterida recebeu por via subcutânea, na região dorsal, 0,5mL de solução injetável contendo 7,14ng de solução de finasterida, preparada na concentração de 14,28ng/mL pelo laboratório Citopharma Manipulação de Medicamentos Especiais Ltda®.

Decorridos 90 dias de uso de finasterida, os hamsteres em estudo foram anestesiados com cloridrato de cetamina, para uso veterinário na dosagem de 200mg/kg e diazepam na dosagem de 2,5mg/kg, pela via intraperitoneal⁶, em seringas diferentes. Após serem anestesiados, foram mortos por hipovolemia.

Por laparotomia, as próstatas (ventrais e dorsais) foram retiradas em monobloco juntamente com todo aparelho geniturinário⁶. Foram dissecadas, fixadas em solução de aldeído fórmico a 10%, em seguida, o material foi encaminhado para processamento histológico.

As próstatas, ventrais e dorsais, foram escolhidas de modo aleatorio para exame e submetidas inicialmente à análise histológica em microscópio óptico de luz e posteriormente enviadas para análise morfométrica no Laboratório de Apoptose, Departamento de Patologia Geral do ICB-UFMG.

Parâmetros e estratégia morfométrica

De cada uma das lâminas estudadas, analisou-se a expressão das AgNORs como marcador de ativação e proliferação celular e a identificação in situ da fragmentação do genoma como marcador de apoptose, (reação de TUNEL-Terminal Deoxinucleotidil Transferase Uracil Nick End Labeling).A técnica de TUNEL combina princípios histoquímicos e imuno-histoquímicos para marcar o DNA fragmentado de células apoptóticas in situ. Essa técnica foi aplicada a secções de parafina em corte histológico de 4mm de espessura.Os núcleos obtidos na reação de TUNEL foram contados manualmente.

Foram avaliados 500 núcleos acinares por lâmina para a contagem de grumos argirófilos. Cada animal teve sua respectiva lâmina examinada e a quantidade de grumos argirófilos encontrados representou sua expressão de AgNORs. Em seguida, foi iniciada a análise estatística dos dados encontrados.

Tratamento estatístico

Foram construídas as distribuições de frequências e calculados os valores das médias, medianas (md), desvios padrão (dp) e as proporções relativas às variáveis do estudo: AgNORs e apoptose exibidas pelo grupo-finasterida e grupo-controle.

Os grupos foram comparados em tabelas de contingência tipo RxC, para análise de frequências e em tabela de ANOVA, para efeito de médias.

O significado estatístico das diferenças entre as proporções foi aferido pelo teste exato de Fisher (para as duas extremidades de distribuição) e pelo teste "t" de Student, na comparação das médias.

Quando as variâncias das médias comparadas não eram semelhantes (p< 0,05) no teste de Bartlett, o significado das diferenças entre os grupos foi aferido pelo teste de Mann-Whitney e pelo teste de Wilcoxon. O nível de significância estatística utilizado na análise foi de 5%. Testes de regressão logística foram utilizados para avaliar se a idade e peso interfeririam nos resultados.

RESULTADOS

O grupo-finasterida tinha idade entre 17,7 ± 0,67 meses e o grupo-controle estava na faixa 15,2 ±1,13 meses. O valor de "t" na comparação das médias das idades entre os dois grupos foi de 5,98 e p= 0,001. À média de peso do grupo-finasterida foi de 145±15,27g e o grupo-controle 129±18,82g. A comparação das médias entre os dois grupos quanto ao peso apresentou t= 2,08 e p= 0,0514.

A figura 1 mostra a expressão de AgNORs. Os animais do grupo-finasterida apresentaram média de 2,846±0,87 grumos argirófilos/ìm² e mediana de 3 argirófilos/ìm². Os animais-controle apresentaram média de 3,68±1,07 grumos de argirófilos/ìm² e mediana de 4 argirófilos/µm², a diferença entre as medianas pelo teste de Mann Whitney apresentou p= < 0,0001.

A figura 2 mostra o resultado da apoptose entre o grupo-finasterida e o grupo-controle. O grupo-finasterida apresentou média de apoptose (número de células marcadas no teste de TUNEL de 53,62 ±1,389 e mediana de 54,34, p= 0,0408. O grupo-controle apresentou média de apoptose de 14,76 ±2,137, mediana de 12,50. A apoptose foi mais evidente nos animais que fizeram uso de finasterida.

DISCUSSÃO

A comparação entre os dois grupos, quanto a peso e idade, mostrou serem eles diferentes quanto à idade e que a diferença entre o peso esteve no limite do nível de significância. Testes foram efetuados para determinar a influência desses dois fatores nos efeitos da finasterida no resultado das variáveis estudadas e mostraram que a diferença entre a idade e o peso dos animais não comprometeu a comparabilidade dos dois grupos quanto aos efeitos da finasterida no resultado do estudo da AgNORs e apoptose.

O grupo-controle não foi submetido a qualquer tratamento, nem mesmo à administração de placebo, evitando-se assim o efeito do estresse quanto à manipulação, tendo por objetivo fornecer informações que poderiam servir de parâmetro com os resultados obtidos no grupo-finasterida.

Como o medicamento em clínica é usado de forma contínua para o tratamento da hiperplasia benigna da próstata (HBP), com base no que se deduziu, não haveria necessidade de se acrescentar novos grupos, porque o objetivo era saber se no animal, a exemplo do homem, a finasterida teria ação medicamentosa.

Foi usada nos animais, que fizeram uso de finasterida neste estudo, uma dose mil vezes menor do que a indicada para o tratamento da HBP em um homem adulto de 70Kg, em intervalos de três vezes por semana, mostrando impacto na próstata desses animais. Por dificuldades técnicas, não foi possível aplicar a finasterida todos os dias nos animais. Optou-se pelo uso da medicação três vezes por semana.

O mecanismo celular da finasterida na próstata ainda não é bem compreendido⁷. Já foi comprovada a ação deste medicamento em receptores androgênicos para alfa-5-redutase tipo 2 na próstata de homens ⁸. O presente estudo sugere que os receptores androgênicos da próstata do hMa são também do tipo 2.

Em trabalho experimental⁹, usando o gerbil, Meriones unguiculatus administrou-se a esses animais, finasterida na dosagem de 10mg/Kg ao dia, associada ao letrozole (um inibidor da aromatase) 1mg/Kg ao dia por um prazo de 21 dias. No final do tratamento, foram observadas importantes alterações nas células prostáticas, sugestivas de apoptose.

Estudos feitos em ratos, com dose elevada de finasterida, mostraram atrofia da glândula prostática desses animais ^10-12, e há evidências que a atrofia glandular prostática com uso de finasterida é secundária à apoptose promovida pelo bloqueio da 5áR¹². Esses achados e os apresentados neste estudo mostram que o bloqueio da formação da diidrotestosterona (DHT) intracelular acarreta a atrofia da próstata por apoptose.

Disfunções nos mecanismos apoptóticos estão envolvidas no desenvolvimento e progressão nos processos proliferativos da próstata¹³. Tem-se também demonstrado que a finasterida leva à indução da apoptose e efeito antiangiogênesis na próstata¹⁴. No homem alterações da homeostase entre GF (Growth Factor) e apoptose estão envolvidos na gênese da HBP¹⁵.

Verificou-se também neste estudo diminuição das AgNORs nos animais tratados com a finasterida em relação ao grupo-controle. As AgNORs são importantes marcadores de proliferação celular¹⁶.

Os achados em literatura^17-19 e também aqui, evidenciam que a finasterida protege a próstata de eventos proliferativos, colocando-a como um medicamento promissor no tratamento e prevenção dessas doenças.

Neste estudo a finasterida mostrou-se um fármaco com ação benéfica nos ácinos da próstata do hMa, embora não se possa ainda afirmar que os achados aqui apresentados tenham o mesmo efeito na próstata humana, devido às peculiaridades genéticas entre o Homo sapiens e o Mesocricetus auratus, mas seguramente passou-se a ter um referencial com fundamento científico.

Concluímos neste estudo que a finasterida diminui a expressão de AgNORs e promove a apoptose nos ácinos da próstata do hMa a ela submetido.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Professor Doutor Anilton César Vasconcelos, Titular do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG (ICB-UFMG) e responsável pelo Laboratório de Apoptose da mesma Instituição; à Mestranda em Veterinária Bárbara Lanice Araújo Verçosa da Faculdade de Veterinária da UFMG (FV-UFMG), a Graduanda em Veterinária Nathália Gonçalves de Santana, (FV-UFMG), pela ajuda na feitura da análise morfométrica do presente estudo.

Recebido em 20/11/2010

Aceito para publicação em 22/01/2011

Conflito de interesse: nenhum

Fonte de financiamento: nenhuma

Estudo realizado no Curso de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas à Cirurgia e Oftalmologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais (FM-UFMG)-MG-BR.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  28 Nov 2011
• Data do Fascículo
  Out 2011

Histórico

• Recebido
  20 Nov 2010
• Aceito
  22 Jan 2011