Efeitos do laser de baixa intensidade em cultura bacteriana in vitro e ferida infectada in vivo

Resumos

OBJETIVO:

comparar os efeitos da terapia a laser de baixa intensidade no crescimento bacteriano in vitro e em feridas infectadas in vivo, e analisar a efetividade da tecnologia Laser AsGa, em feridas infectadas in vivo.

MÉTODOS:

in vitro: cepas de Staphylococcus aureus foram incubadas em placas de agar-sangue e irradiadas com laser de 904nm de comprimento de onda e dose de 3J/cm², diariamente durante sete dias. In vivo: 32 ratos machos Wistar foram distribuídos em Grupo Controle (Não Infectado) e Grupo Experimental (Infectados). Metade dos ratos tiveram suas feridas irradiadas e a outra metade não irradiada, como realizado no estudo in vitro.

RESULTADOS:

in vitro: não houve variação estatística significativa entre os grupos experimentais, considerando as placas matrizes e derivadas (p>0,05). In vivo: houve aumento significativo na deposição de colágeno tipo I e III na cicatriz do grupo dos animais infectados e irradiados, quando avaliados no quarto dia de experimento (p=0,034).

CONCLUSÃO:

a Low-Intensity Laser Therapy aplicada com comprimento de onda de 904nm e dose de 3J/cm², in vitro: não alterou o crescimento de S. aureus nos grupos experimentais. In vivo: mostrou aumento significativo na deposição de colágeno tipo I e III na cicatriz no grupo dos animais infectados e irradiados no quarto dia de experimento.

Infecção; Terapia a laser; Terapia a laser de baixa intensidade; Cicatrização; In vitro

OBJECTIVE:

to compare the effects of low intensity laser therapy on in vitro bacterial growth and in vivo in infected wounds, and to analyze the effectiveness of the AsGa Laser technology in in vivo wound infections.

METHODS:

in vitro: Staphylococcus aureus were incubated on blood agar plates, half of them being irradiated with 904 nm wavelength laser and dose of 3J/cm² daily for seven days. In vivo: 32 male Wistar rats were divided into control group (uninfected) and Experimental Group (Infected). Half of the animals had their wounds irradiated.

RESULTS:

in vitro: there was no statistically significant variation between the experimental groups as for the source plates and the derived ones (p>0.05). In vivo: there was a significant increase in the deposition of type I and III collagen in the wounds of the infected and irradiated animals when assessed on the fourth day of the experiment (p=0.034).

CONCLUSION:

low-intensity Laser Therapy applied with a wavelength of 904nm and dose 3J/cm² did not alter the in vitro growth of S. aureus in experimental groups; in vivo, however, it showed significant increase in the deposition of type I and III collagen in the wound of infected and irradiated animals on the fourth day of the experiment.

Infection; Laser therapy; Laser therapy, low-level; Wound healing; In vitro

INTRODUÇÃO

A terapia a laser é um tratamento não invasivo que apresenta registros na literatura indicando efeitos e aplicações variadas na prática clínica, incluindo efeitos sobre cada uma das fases da cicatrização tecidual^{1 - 7}.

A aplicação do laser de baixa intensidade no processo de cicatrização de feridas parece ser interessante e promissor; entretanto, seu uso no manejo de extensas lesões de tecidos moles com imputada contaminação bacteriana não foi, ainda, objeto de investigação adequada.

A influência do laser de baixa intensidade sobre a modulação fenotípica de diferentes populações bacterianas tem sido pobremente discutida na literatura. Como a infecção é uma causa comum de atraso na cicatrização de feridas, é importante compreender o efeito da terapia a laser de baixa intensidade no crescimento bacteriano⁸.

A literatura é controversa no que diz respeito aos efeitos da Low-Intensity Laser Therapy (LLLT) sobre o crescimento bacteriano. Em alguns países essa terapia ainda é vista com certo ceticismo, decorrente da publicação de trabalhos controversos na literatura, mostrando tanto efeitos benéficos, como nenhum efeito da terapia com laser em baixa intensidade^{9 - 12}.

É muito comum, também, que a investigação falhe em demonstrar um efeito particular por causa da existência de ensaios pouco controlados, na sua maioria in vitro, com escolha de parâmetros incorretos e casuística relativamente pequena^{13 - 17}.

Diante desse cenário e da falta de estudos que analisem a efetividade da terapia a laser de baixa intensidade em feridas infectadas, justifica-se a continuidade de pesquisas nesta área.

Os objetivos deste trabalho consistem em comparar os efeitos da terapia a laser de baixa intensidade no crescimento bacteriano in vitro e em feridas infectadas in vivo, e analisar a efetividade da tecnologia Laser AsGa (arseneto de gálio) sobre a cicatrização e infecção, em feridas infectadas in vivo.

MÉTODOS

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Uso de Animais (CEUA) da Pontifícia Universidade Católica do Paraná, sob o registro nº 509.

O uso dos animais seguiu o código de ética do Conselho para Organizações Internacionais de Ciências Médicas para experimentação animal e os princípios do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e a legislação nacional em vigor sobre os procedimentos para uso de animais experimentais (Lei Federal 11.794, de 09 de outubro de 2008).

Bactéria

A bactéria Staphylococcus aureus (S. aureus) foi escolhida por ser comumente associada à infecções de feridas e por ser a bactéria gram-positiva mais comum em infecção de feridas, além de ser a espécie mais virulenta do seu gênero.

A preparação para o experimento in vitro e in vivo foi iniciada com a ativação da bactéria, utilizando uma cepa padrão de S. aureus derivada do ATCC 25923. A bactéria cultivada em caldo BHI (Brain Heart Infusion) foi mantida viva através de uma diluição seriada da bactéria e foi utilizada para fazer uma suspensão da bactéria equivalente a 10^{- 2} unidades formadoras de colônias (ufc)/mL.

Parâmetros do laser

A irradiação foi realizada utilizando um laser arseneto de gálio com comprimento de onda de 904nm. O equipamento encontra-se no espectro eletromagnético infravermelho e possui regime de emissão pulsada com potência média de 0.0120 W, 200ns de tempo de duração do pulso, potência máxima de pico de 30W, diâmetro do feixe de 4mm, frequência de emissão de 2000Hz. O equipamento foi aferido e calibrado antes de iniciar o procedimento experimental.

Procedimento experimental In Vitro

A amostra in vitro foi composta por 45 placas de cultura. Um swab estéril foi utilizado para inocular a bactéria S. aureus em uma placa Müller-Hinton utilizando um método de estrias para permitir a contagem das colónias bacterianas.

Foi realizado um antibiograma para a bactéria S. aureus utilizando o caldo BHI ajustado com turvação da suspensão bacteriana para o equivalente ao tubo 0,5 da escala de Mac Farland para analisar a resistência e sensibilidade da cepa bacteriana frente aos antibióticos.

Três discos de antibióticos específicos para S. aureus (gentamicina, norfloxacina e amoxicilina) foram posicionados na placa controle positivo do estudo. A leitura do antibiograma foi feita a partir da medida do diâmetro de halo de inibição de cada disco, utilizando régua milimetrada. Todos os antibióticos apresentaram ação inibidora contra a cepa bacteriana testada. Isso significa que a bactéria apresentou valor da medida do halo de inibição acima do preconizado para os sete antibióticos, e que o uso desses antibióticos seria eficaz para combatê-la.

Três placas matrizes foram inoculadas com a diluição escolhida e foram identificadas e divididas em três grupos: LASER1, CONTROLE 1 e ANTIBIÓTICO (única). Todas as placas foram incubadas por 48 horas a 35°C. Depois da incubação, as três colônias mais isoladas da placa LASER1 foram irradiadas. Imediatamente após a irradiação, as três colônias foram removidas da placa e diluídas separadamente em três tubos de ensaio contendo solução salina estéril e posteriormente replicadas, mantendo o mesmo método de semeadura por quantificação para três novas placas ágar-sangue. Na placa CONTROLE1 (controle negativo) nenhum tipo de tratamento foi empregado. As três colônias mais isoladas foram diluídas e replicadas utilizando o mesmo método utilizado nas placas LASER1. Todas as placas foram incubadas por 24 horas a 35°.

Após o período de incubação todas as placas tiveram apenas uma colônia mais isolada (Figura 1) escolhida para ser irradiada e replicada no grupo LASER e apenas replicada no grupo CONTROLE. A rotina de irradiações e replicações foram repetidas da forma descrita acima, a cada 24 horas e no mesmo período do dia, até completar sete dias de experimento, para evidenciar possível efeito cumulativo da terapia a laser de baixa intensidade. Todas as placas foram fotografadas nos períodos de 24 (matrizes) e 48 horas (derivadas) após a replicação.

Figura 1
Placa colonizada com colônia isolada escolhida para irradiação em destaque.

A técnica de aplicação empregada foi pontual sobre cada uma das três colônias selecionadas. A caneta permaneceu situada perpendicularmente à placa e manteve-se uma distância de 1cm entre a caneta e a placa. A caneta do laser foi fixada utilizando um suporte regulável com haste e garras para tubo de ensaio, e a dose administrada foi de 3J/cm².

Procedimento Experimental In Vivo

A amostra in vivo foi composta por um total de 32 ratos machos, adultos, da raça Wistar, com peso entre 251-358g. Todos mantidos em gaiolas individuais, com temperatura ambiente controlada (21°C), ciclo claro/escuro de 12h, ração sólida comercial e água ad libitum. Os animais foram randomicamente divididos em dois lotes de 16 animais. Os primeiros oito animais de cada lote foram identificados por número e pertenceram ao grupo GCNI (Grupo Controle Não-Infectados) e os outros oito pertenceram ao grupo GI (Grupo Infectado). Cada grupo teve quatro animais tratados com LLLT e a outra metade não recebeu nenhum tratamento.

Todos os animais foram submetidos ao seguinte procedimento cirúrgico: anestesia com cetamina a 10% (60 a 80mg/kg) e xilazina a 2% (8 a 15mg/kg), tricotomizados na região dorsal e uma incisão cirúrgica linear, sentido crânio-caudal, foi realizada no terço médio da região dorsal (um centímetro abaixo da linha entre as clavículas), com 3cm de comprimento e com profundidade até a visualização da fáscia muscular utilizando bisturi cirúrgico. O grupo Controle teve as bordas das feridas aproximadas e suturadas com dois pontos simples utilizando fio mononylon 3-0 e o grupo dos ratos Infectados teve suas feridas inoculadas com a suspensão contendo a bactéria S. aureus ativada utilizando um swab estéril e posteriormente, todas as feridas também tiveram as bordas aproximadas e suturadas.

A técnica de aplicação empregada foi o método pontual, em três pontos da ferida, mantendo 1cm de distância entre eles. A caneta permaneceu situada perpendicularmente à ferida do animal, mantendo 1cm de distância entre o spot de saída da luz laser e da ferida. Nos animais sem tratamento foi realizada uma simulação da irradiação laser com o aparelho desligado. Os animais foram irradiados a cada 24 horas no mesmo horário, até completar sete dias de tratamento, para evidenciar o possível efeito cumulativo da LLLT. No quarto dia de experimento, metade dos animais tratados do lote (dois de cada grupo) foi sacrificada. A outra metade foi sacrificada no oitavo dia de experimento, utilizando câmara de gás CO₂ para roedores.

Todas as amostras de pele foram coletadas e imersas em frascos contendo formalina 10%. A determinação do crescimento bacteriano foi feita utilizando uma secreção coletada da ferida em dois diferentes animais infectados que se encontravam no oitavo dia de experimento. Todos os testes (inoculação em ágar Mac Conkey, ágar-sangue e ágar manitol salgado, o teste da catalase e coagulase) confirmaram a presença da espécie Staphylococcus aureus.

In vitro: todas as placas fotografadas foram analisadas e o procedimento de leitura seguiu a seguinte padronização: determinar o campo total da placa. A seguir, as imagens das placas matrizes e derivadas foram, uma a uma, submetidas manualmente a uma calibração através de uma seleção de cores, onde o sistema reconheceu a área composta por ágar-sangue pela cor verde e o restante do conteúdo da placa, que representa a área composta por colônias da bactéria, foi ajustado para ser reconhecido pela cor amarela.

In vivo: todas as amostras de pele foram desidratadas em álcool, diafanizadas em xilol e colocadas na parafina. Depois foram cortadas em fragmentos de 4ìm de espessura e coradas com Picrosirius (PS). A leitura das lâminas de PS foi realizada através da obtenção de duas fotomicrografias por lâmina em um microscópio óptico com câmaras de captura, utilizando-se lente polarizada.

As imagens foram capturadas por uma câmera digital e, posteriormente, congeladas e digitalizadas por uma placa digitadora, cuja imagem era enviada a um computador. Para cada corte histológico, foi realizada a leitura de dois campos aleatórios com ampliação de 400x para avaliar a porcentagem de colágeno tipo I e III. A porcentagem de área ocupada pelas fibras vermelhas (colágeno tipo I) e verdes (colágeno III) foi calculada.

Análise estatística

Para a comparação dos grupos em relação à variáveis quantitativas, foi considerado o teste não-paramétrico de Mann-Whitney. Na comparação dos resultados nos dias consecutivos de avaliação, dentro de cada grupo, foi usado o teste não-paramétrico de Friedman. Valores de p<0,05 indicaram significância estatística.

RESULTADOS

In vitro: os resultados das médias obtidas em relação à área/fundo (A/F) que comparou os grupos Laser e Controle durante todos os dias do experimento, considerando as placas matrizes e derivadas, não apresentaram variação significativa entre as médias da A/F entre os grupos experimentais (p>0,05), em outras palavras, os grupos apresentaram características de crescimento semelhantes, com baixa dispersão das médias durante todo o período experimental. As placas matrizes atingiram valores p ainda mais altos do que as placas derivadas, atingindo valor de "1" no segundo e terceiro dia de experimento. Ao longo da execução do protocolo experimental, testou-se, em cada grupo (intragrupo), a hipótese de existir um efeito cumulativo da terapia a laser de baixa intensidade, considerando as placas matrizes e derivadas. O teste afirmou a igualdade dos resultados ao longo dos dias do experimento.

Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos em relação à área sob a curva (ASC), considerando todas as avaliações nos dias consecutivos nas placas matrizes e derivadas. Em valores absolutos, os grupos têm resultados da área sob a curva (ASC) com distribuição normal (Figuras 2 e 3).

Figura 2
Área abaixo da curva nas placas matrizes.

Figura 3
Área abaixo da curva nas placas derivadas.

Os percentuais de variação da variável A/F para cada dois dias consecutivos de avaliação ao longo do experimento foram calculados nos dois grupos experimentais, incluindo as placas matrizes e derivados. Os percentuais não apresentaram diferença estatística significante nas variações (p>0,05). Nas placas matrizes o maior percentual de variação para os grupos ocorreram entre o segundo e o terceiro dia (34,07%, Laser e 20,76%, Controle) e entre o sexto e o sétimo dia (31,73%, Laser e 26,76%, Controle). Nas placas derivadas o maior percentual ocorreu entre o segundo e o terceiro dia (45,98%, Laser e 85,67%, Controle).

In vivo: ocorreu o óbito de dois ratos do grupo Infectado (tratados com irradiação laser) após o procedimento cirúrgico. Não ocorreram quaisquer outras complicações com os animais no decorrer do experimento. Para a comparação dos grupos em relação à área de colágeno, testou-se a hipótese nula de que os resultados são iguais nos dois grupos em comparação versus a hipótese alternativa de resultados diferentes. O resultado da comparação do colágeno entre os grupos experimentais CONTROLE x INFECTADOS (intergrupos), para cada dia de avaliação, indicou diferença significativa apenas entre os grupos experimentais controle e infectados irradiados com a terapia a laser de baixa intensidade, quando avaliados no quarto dia de experimento (p=0,034). Os outros grupos comparados não mostraram variação significativa em nenhuma das duas variáveis (colágeno tipos I e III) em nenhum dos dias de avaliação (Tabela 1).

Tabela 1
Controle x Infectados irradiados com terapia a laser avaliados no quarto dia de experimento.

Variável G r u p o		n	MediaMedianaM í n i m o			Maximo	Desvio padrão	Valor de p
COL I	GC I 4D	16	82,02	88,18	60,15	97,97	12,42
	GI I 4D	14	91,27	91,57	83,28	98,102	39,77	0,034
COL III	GC I 4D	16	17,97	11,81	20,24	39,84	12,42
	GI I 4D	14	87,26	84,26	18,93	16,71	39,77	0,034

Na comparação de colágeno em cada grupo (intragrupo) em relação ao momento de avaliação (4º e 8º dia de experimento) foi testada a hipótese nula de que as médias de deposição de colágeno tipo I e III são iguais para os dois momentos de avaliação, versus a hipótese alternativa de que pelo menos um momento tem média diferente das demais. Em nenhum momento das comparações ocorreu diferença significativa, indicando que os valores são semelhantes em todos os momentos de avaliação em um mesmo grupo.

Na avaliação realizada no quarto e no oitavo dia para os colágenos tipo I e III, no grupo controle irradiado, o valor de "p" atingiu 0,867; no grupo controle não irradiado, valor de p=0,491; no grupo infectado, valor de p=0,104; e no grupo não infectado, valor de p=0,094.

Os resultados da comparação do colágeno em relação à terapia a laser de baixa intensidade, dentro do grupo controle, em cada momento de avaliação, não apresentaram diferença estatística significativa para o efeito do tratamento com LILT. Os animais do grupo controle tratados com LILT não demonstraram maior ou menor efetividade sobre a deposição dos colágenos tipo I e III em relação aos não irradiados, obtendo valor de p=0,867 quando avaliados no quarto dia e valor de p=0,590 quando avaliados no oitavo dia. Comparando a efetividade dentro do grupo dos animais infectados em cada momento de avaliação, apesar de demonstrar um discreto aumento de deposição de colágeno que pode ser observado em um valor maior nas médias, não houve diferença estatisticamente significante. Os animais infectados tratados com LILT não mostraram maior ou menor efetividade na deposição de colágeno tipos I e III em relação ao grupo não irradiado, obtendo valor de p=0,101 quando avaliados no quarto dia e valor de p=0,224 quando avaliados no oitavo dia.

As figuras 4 e 5 demonstram a variação das médias quantificadas em porcentagem das variáveis colágeno tipo I e tipo III em seus diferentes grupos (controle x infectados), subgrupos (irradiados x não irradiados) e tempos de avaliação (quarto e oitavo dia de experimento).

Figura 4
Colágeno tipo I.

Figura 5
Colágeno tipo III.

DISCUSSÃO

A infecção resulta em destruição do tecido afetado e também em atraso da cicatrização da ferida e formação da cicatriz. Pelos achados em trabalhos prévios, notadamente, a eficácia da LILT sobre o reparo tecidual foi verificada em vários protocolos^{9 - 4 , 18}. Nenhum trabalho, até o presente momento, validou o uso da laserterapia quando há a presença de infecção bacteriana na ferida.

Nas referências pesquisadas sobre o emprego da LILT no processo de cicatrização de feridas infectadas, pode-se destacar a variabilidade na metodologia utilizada, bem como, nos resultados encontrados.

A padronização da escolha do equipamento laser e dos parâmetros empregados, como comprimento de onda, tempo, frequência, intensidade para reparação de tecidos concomitante à infecção bacteriana, apresentam grande variação na literatura consultada^{10 , 12 , 15 , 19 - 24}.

O laser arseneto de gálio foi escolhido por ser um dos lasers mais utilizados na prática fisioterapêutica, capaz de produzir alterações significantes em úlceras cutâneas e feridas operatórias de humanos; tem sido utilizado com diferentes doses. Melhores resultados foram observados com doses relativamente baixas. Doses de 3 ou 4J/cm² produzem melhores resultados que 5J/cm, quando avaliado o crescimento celular e a síntese de colágeno em cultura de fibroblastos, e doses acima de 4J por ponto podem inibir a atividade dos fibroblastos²⁵. Esses estudos demonstram que doses muito altas de energia não parecem prover os melhores efeitos de reparação tissular.

A terapia a laser foi empregada diariamente pelo período de sete dias nos estudos in vitro e in vivo. A literatura sugere que o estímulo do crescimento bacteriano é significativamente aumentado por repetidas irradiações se comparadas a uma única exposição.

Tratamentos com laser são geralmente aplicados em feridas três a cinco vezes por semana, e, portanto, em feridas infectadas, deve se considerar os efeitos cumulativos do tratamento²⁶.

A escolha do método de pesquisa in vitro baseou-se em estudos prévios encontrados na literatura^{13 , 19 , 24} que realizaram diversos experimentos avaliando os efeitos do laser sobre diferentes tipos de bactérias utilizando variações no comprimento de onda, dose e frequência^{13 , 19 , 21 , 22 , 24}. A maioria dos estudos praticaram a irradiação das placas em uma única sessão (prática metodológica comum nesse tipo de estudo) ^{21 , 24} e a contagem das colônias bacterianas eram feitas até após 24 horas^{19 , 23 , 24}.

Para este experimento, foi elaborado um desenho de pesquisa voltado para reproduzir, in vitro, condições comuns na prática da fisioterapia atual. Nas pesquisas pré-existentes, quase por unanimidade, os autores sugerem em futuras investigações a necessidade de um número maior de séries de exposição das placas à luz laser com a finalidade de vislumbrar um possível efeito cumulativo da LILT e, também, incorporar a metodologia utilizada em modelos mais complexos, como feridas infectadas in vivo, utilizando modelos animais em primeira instância.

O interesse do estudo de observação in vivo do potencial da LILT é teoricamente baseado na avaliação das citocinas pró-inflamatórias liberadas após exposição celular à laserterapia e avaliação das funções dos monócitos, macrófagos e linfócitos nas feridas, condições que o meio ágar-sangue não é capaz de proporcionar²⁷.

Diferentemente dos demais encontrados na metodologia da literatura, por prevenção e precaução, a LILT foi iniciada apenas 24 horas após o procedimento cirúrgico. No estudo in vitro, este fato é justificado por este ser o período necessário para que as placas semeadas e incubadas em estufa sofram crescimento bacteriano visível a olhos nus. No estudo in vivo, além de manter a padronização dos parâmetros, o fato também pode ser justificado por não ser indicado o uso da terapia a laser durante o sangramento, pois provoca aumento do fluxo sanguíneo.

A terapia a laser, nos parâmetros utilizados, não foi capaz de provocar qualquer efeito bioestimulante sobre as bactérias no meio in vitro. Contudo, vale ressaltar que o modo de aplicação (única dose sobre a colônia isolada sem contato da caneta aplicadora com a placa de cultura), pode ter sido responsável pela ausência de efeitos sobre o crescimento bacteriano, visto que este tipo de aplicação pode ocasionar perda significativa de energia²⁷, pois a irradiação, nesse caso, cai devido à lei do quadrado inverso (a intensidade da radiação incidente é inversamente proporcional ao quadrado da distância entre a fonte e a superfície) e ao aumento da reflexão. O uso de doses relativamente baixas e uma única exposição à irradiação são também fatores que podem justificar a falta de efeitos sobre o crescimento bacteriano in vitro.

De acordo com os achados no presente estudo parece que a condição de cultivo é determinante para o crescimento de micro-organismos. Embora não totalmente compreendido, após a irradiação com LILT, a participação de células hematopoiéticas parece ser fundamental na reação de defesa do hospedeiro. O meio ágar-sangue parece não corresponder às condições in vivo, apesar da presença de alta concentração de hemoglobina. A teoria baseada na observação de citocinas pró-inflamatórias liberadas após a exposição celular ao LILT relatada por Moore²⁷ parece ser a melhor linha de continuidade de estudos nessa área.

É de extrema importância novos estudos que avaliem no meio in vivo os efeitos da LILT sobre o infiltrado inflamatório quando aplicado por período prolongado em feridas infectadas, com a finalidade de buscar mais respostas sobre a existência ou não de interferência no processo de cicatrização das feridas.

Considerando que este trabalho é original, a dificuldade encontrada é a de comparar os resultados com aqueles relatados previamente. Como sugestão de trabalhos futuros, seria de interesse investigar o uso da LILT em um controlado estudo em feridas animais e, posteriormente, humanas para determinar os efeitos do tratamento com a LILT sobre o crescimento da bactéria e também sobre a extensão de cicatrização do tecido hospedeiro.

Os resultados obtidos nesse trabalho permitiram concluir que os efeitos da irradiação com LILT AsGa com comprimento de onda de 904nm, dose de 3J/cm², in vitro, não alterou o crescimento bacteriano de S. aureus nos grupos experimento e controle, nas placas matrizes e nem nas derivadas, até o oitavo dia de avaliação. In vivo, demonstrou aumento significativo na deposição de colágeno tipo I e III na cicatriz nos grupos dos animais infectados e irradiados, quando avaliados no quarto dia de experimento

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• Fonte de financiamento: nenhuma.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Jan-Feb 2014

Histórico

• Recebido
  12 Nov 2012
• Aceito
  05 Jan 2013