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Revista do Colégio Brasileiro de Cirurgiões

versão impressa ISSN 0100-6991versão On-line ISSN 1809-4546

Rev. Col. Bras. Cir. vol.42 no.1 Rio de Janeiro jan./fev. 2015

http://dx.doi.org/10.1590/0100-69912015001009 

Artigos Originais

Estudo preliminar da água de coco para preservação de enxertos teciduais em transplante

Jorge Miguel Schettino César 1  

Andy Petroianu 2  

Leonardo de Souza Vasconcelos 3  

Valbert Nascimento Cardoso 4  

Luciene das Graças Mota 3  

Alfredo José Afonso Barbosa 5  

Cristina Duarte Vianna Soares 4  

Amanda Lima de Oliveira 6  

1Doutor em Medicina pelo Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas a Cirurgia e Oftalmologia da Faculdade de Medicina da UFMG

2Professor Titular do Departamento de Cirurgia da Faculdade de Medicina da UFMG

3Professor Adjunto do Departamento de Propedêutica Complementar da Faculdade de Medicina da UFMG

4Professor Associado da Faculdade de Farmácia da UFMG

5Professor Titular do Departamento de Anatomia Patológica da Faculdade de Medicina da UFMG

6Estudante da Faculdade de Medicina da UFMG

RESUMO

OBJETIVO:

verificar a eficácia da água de coco na preservação de tecidos para transplante.

MÉTODOS:

cinquenta ratas Wistar foram distribuídas aleatoriamente em cinco grupos, de acordo com as seguintes soluções de preservação para enxertos teciduais: Grupo 1- Ringer lactato, Grupo 2- Solução de Belzer, Grupo 3- Água de coco maduro, Grupo 4- Água de coco verde, Grupo 5- Água de coco modificada. No Grupo 5, a água de coco verde foi modificada à semelhança da solução de Belzer. De cada animal, retirou-se o baço, os ovários e um segmento de pele do dorso. Esses tecidos foram preservados durante seis horas em uma das soluções. Em seguida, os enxertos foram reimplantados. A recuperação da função dos tecidos implantados foi avaliada 90 dias após a cirurgia, por meio de cintilografia esplênica, exames de sangue. Os tecidos implantados foram coletados para estudo anatomopatológico.

RESULTADOS:

as dosagens séricas não apresentaram diferença entre os cinco grupos, exceto pelos animais do Grupo 5, que apresentaram valores mais elevados de IgG do que o Grupo 1,e pelas diferenças em relação ao FSH entre os grupos 1 e 2 (p<0,001), 4 e 2 (p=0,03), 5 e 2 (p=0,01). A cintilografia esplênica não foi diferente entre os grupos. O tecido ovariano foi melhor preservado em água de coco maduro (p<0,007).

CONCLUSÃO:

as soluções à base de água de coco preservam baço, ovário e pele de rato durante seis horas, mantendo sua função normal.

Palavras-Chave: Cocos; Soluções para preservação de órgãos; Transplante autógeno; Baço; Pele; Ovário

INTRODUÇÃO

Os métodos para preservar órgãos e tecidos para transplante associam-se à supressão do metabolismo, por hipotermia. O sangue é substituído por solução de preservação para tornar o órgão tolerante à hipotermia. A composição das soluções de preservação é determinante à tolerância do órgão armazenado em hipotermia1 - 4. A introdução da solução da Universidade de Wisconsin ou solução de Belzer, no final da década de 1980, foi um grande avanço na preservação de órgãos2.

Estudos realizados com gametas de várias espécies animais mostraram que a água de coco verde (endosperma da Cocos nucifera L.) pode ser usada com sucesso na preservação dos folículos pré-antrais de caprinos e ovinos, sêmen de ovelhas, porcos e humanos. Essa solução foi testada também como meio de conservação e maturação de oócitos imaturos de ovários bovino e como meio de cultura para embriões de camundongos e bovinos3.

O objetivo deste estudo foi verificar a eficácia da água de coco na preservação de enxertos teciduais, com vista a transplante autógeno, considerando o alto custo das soluções de preservação em uso.

MÉTODOS

Este estudo foi conduzido de acordo com as recomendações das Normas Internacionais para Proteção Animal e do Código Brasileiro de Experimentação Animal (1988), "Princípios Éticos na Experimentação Animal", segundo a Lei Federal nº 11.794, de 08 de outubro de 2008, tendo sido provado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da UFMG sob o nº 220/2009 e pela Diretoria de Ensino, Pesquisa e Extensão do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Minas Gerais, memorando nº 054/11.

Cinquenta ratas Wistar com três meses de vida, pesando entre 200g e 250g foram alocadas em gaiolas apropriadas, cinco animais por gaiola, em ambiente com temperatura entre 20°C e 28°C (M=25°C), umidade natural e fotoperíodos de luz e escuridão de 12/12h, com ventilação natural por exaustão mecânica. Os animais tiveram livre acesso à água e ração padrão de laboratório para roedores (Labina(r),Purina (r) ,Brasil) durante os períodos pré e pós-operatórios.

Após período de adaptação de 15 dias, as ratas foram distribuídas aleatoriamente em cinco grupos com dez animais cada, seguindo orientação de significância estatística. A aleatorização foi feita na distribuição dos animais em gaiolas separadas, sem levar em conta característica alguma. Cabe ressaltar que todos os animais eram provenientes de ninhadas de mesma raça e procedência, reunidas em um único grupo com idades e pesos similares. Os grupos foram determinados pela solução de preservação utilizada: Grupo 1 - Ringer lactato; Grupo 2 - Solução de Belzer (ViaSpan, Bristol-Meyers Squibb Pharmaceutical, Dublin.); Grupo 3 - Água de coco maduro; Grupo 4 - Água de coco verde; Grupo 5 - Água de coco modificada.

Os cocos foram obtidos no mercado local, no dia de sua utilização, íntegros, com oito a 12 meses de idade. Parte do mesocarpo e endocarpo foi removida para expor o endosperma, sem lesá-lo. Após antissepsia de sua superfície com polivinilpirrolidona-iodo, contendo 1% de iodo ativo, polvidona 10% (Rioquímica, São José do Rio Preto, São Paulo), o endosperma foi cortado com lâmina de bisturi estéril e a água do coco foi aspirada com cateter periférico 14G x 22" (B.B. Braun (r) , Melsungten, Germany) e seringa hipodérmica de plástico de 20ml (B.D. Plastipak (r) , Curitiba, PR, Brasil) e transferida para cuba metálica. A esterilidade da água de coco extraída foi confirmada, por amostragem, com sua inoculação em placas de Petri com meio de cultura bacteriana.

A solução de água de coco modificada foi preparada no Centro de Desenvolvimento Analítico Farmacêutico - UFMG, tendo por base a composição hidroeletrolítica da água de coco verde. Foram feitas mudanças em sua composição eletrolítica, para torná-la semelhante à solução de Belzer1. Durante o procedimento, devido à precipitação do sal fosfato de magnésio, foi necessária a redução do pH da solução para 7, pelo acréscimo de ácido clorídrico. A concentração final da solução modificada é mostrada em relação a outras soluções de preservação e as de água de coco verde e maduro, cujas composições eletrolíticas foram dosadas por amostragem e utilizadas neste estudo (Tabela 1).

Tabela 1 - Composição hidroeletrolítica e outros componentes de soluções de preservação tecidual e de água de cocos verde, maduro e modificada (mg/L)4. 

RL ER rER UW Celsior LPD HTK CV CM M
pH 7,4 7,2 - 7,4 7,3 7,4 7,1 6,9 6,9 7,0
Na* 234 180 2070 540 180 3024 27 252,08 466,67 540
K* 7,2 2070 180 2250 27 72 16,2 933,33 3000 2250
Mg2+ - - - 90 23,4 - - 66,26 237,2 90
CI- 196,2 270 270 - 74,7 1854 - - - 2569
Cálcio 5,4 - - - 0,26 - - - - -
SO42- - - 90 - - - - <1 <1 90
PO43- - 1035 1035 450 - 660,6 0 238,7 1324,58 450
HCO3- - 180 180 - - - - - - -
Glicose - 0,35 ,35 - - - - NM 583,33 NM
Lactobionato - - - 180 80 - - - - -
Glutationa - - - 5,4 3 - - - - -
Rafinose - - - 54 - - - - - -
Carboidratohidroxietil - - 0,5 - - - - - - -
Adenosina - - - 9 - - - - - -
Histidina - - - - 30 - 324 - - -
Triptofano - - - - - - 3,6 - - -
Quetoglutarato - - - - - - 1,8 - - -
Manitol - - - - 60 - 54 - - -
Glutamato - - - - 2 - - - - -
Lactato 50,4 - - - - - - - - -
Osmolaridade (mOsm/L) 272 400 380 320 360 285 310 >300 >300 NM

ER - Solução Euro-Collins, rER - Solução Euro-Collins com pouco potássio, UW - Solução de Wisconsin/Belzer, LPD - Solução dextran com pouco potássio/Toronto, RL - Ringer lactato, HTK - Solução de Histidina-triptofano-quetoglutarato, CV - Água de coco verde laboratório, CM - Água de coco maduro, M - Água de coco modificada,Na+ - Sódio, K+ - Potássio, Mg2+ - magnésio, Cl- - Cloro, SO4 2 -- Sulfato, PO4 3 -- Fosfato, HCO3 - Bicarbonato, NM - Não mensurável pelo kit do laboratório Hidrocepe, mOsmol/L - miliosmois por litro.

O peso dos animais foi verificado imediatamente antes do procedimento cirúrgico. O dia da operação foi considerado o primeiro dia do experimento. Sob anestesia geral com infusão intramuscular da associação de cloridrato de quetamina 10% (Agener União, Embu-Guaçu, São Paulo) (60mg/kg) e xilasina 2% (Agener União, Embu-Guaçu, São Paulo) (8mg/kg). Realizou-se tricotomia da parede abdominal e região dorsal interescapular, seguida de antissepsia da parede abdominal e região dorsal, com solução de polivinilpirrolidona, contendo 1% de iodo ativo, polvidona 10% (Rioquímica, São José do Rio Preto, São Paulo).

Através da laparotomia mediana do apêndice xifoide até a região pélvica, o baço e os dois ovários foram retirados após ligadura e secção de seus pedículos vasculares. O baço foi cortado em quatro segmentos, com lâmina de bisturi. Esses órgãos e tecidos foram imediatamente imersos na solução de preservação correspondente ao seu grupo, mantida a 4°C durante seis horas. Após o fechamento do abdome, um segmento de pele total do dorso do animal foi retirado e mergulhado na mesma solução de preservação que já continha o baço e os ovários. As bordas da ferida do local doador foram aproximadas com fio de náilon 4-0.

Durante seis horas, com os órgãos mantidos em solução de preservação, os ratos foram mantidos em gaiolas separadas, sem água ou ração, mas com movimentação livre. Decorrido esse período, os ratos foram novamente anestesiados, de acordo com a técnica descrita. Em seguida, retirou-se a sutura abdominal, abrindo a cavidade. Os quatro fragmentos esplênicos foram suturados lado a lado sobre o omento maior, com fio de náilon 4-05. Todos os procedimentos foram realizados em condições de assepsia6. Ambos os ovários foram fixados com fio de nailon 4-0 na gordura pélvica direita7. A cavidade abdominal foi fechada em dois planos, com sutura contínua, utilizando fio de seda 3-0. Terminada a operação abdominal, abriu-se a ferida cutânea do dorso e o retalho de pele retirado da solução de preservação foi fixado sobre a fáscia muscular superficial do leito da ferida, utilizando fio de náilon 4-08.

Nos três meses seguintes de acompanhamento, os cinco animais foram avaliados diariamente quanto ao seu estado de saúde. Ao final do período de cada acompanhamento, todos os ratos foram pesados e preparados para estudo funcional dos enxertos. Os animais foram novamente anestesiados de acordo com a técnica descrita.

A função fagocitária dos enxertos esplênicos autógenos foi qualitativa e quantitativamente avaliada por meio de cintilografia, utilizando como contraste o radiofármaco fitato de sódio marcado com tecnécio-99m (99Tcm-fitato de sódio) 90 dias após a operação. Em seguida, após a coleta de sangue e morte dos animais, foram retirados três fragmentos do lobo esquerdo do fígado e os enxertos esplênicos para medir sua radiação em um contador de radiação gama. Calculou-se a radiação emitida pelo implante esplênico em relação à média das medidas dos três fragmentos hepáticos. Essa captação representou a quantidade de coloide fagocitada pelo tecido mononuclear fagocitário do fígado e do baço.

Foram coletadas amostras de sangue da veia cava abdominal para dosagem de hemácias, hemoglobina, hematócrito, leucócitos, IgM, IgG, FSH e estradiol. A retirada desse sangue fez com que o rato morresse por hipovolemia.

Após a coleta do sangue, foram retirados os fragmentos esplênicos do omento e ovários implantados na pelve e o enxerto de pele. O aspecto macroscópico dos tecidos foi avaliado e, a seguir, eles foram imersos em solução de formaldeído a 4% (Formol a 10%). Amostras foram recolhidas para processamento histológico e coradas por hematoxilina e eosina, para análise à microscopia óptica, por um único patologista, que desconhecia o grupo ao qual o tecido pertencia. A análise foi qualitativa para os tecidos esplênico, ovariano e cutâneo, variando os valores de 1 a 5, conforme as estruturas teciduais desses órgãos se apresentassem em comparação à estruturas morfológicas de pele, baço e ovários histologicamente normais.

Foram empregados os testes: paramétrico ANOVA, não paramétrico de Kruskal-Wallis, o teste de comparações múltiplas de Tukey, o teste de comparações múltiplas não paramétrico, o teste de homogeneidade de variância de Levene. Os tamanhos amostrais e o poder do teste foram obtidos por meio do software PASS versão 11. As diferenças foram consideradas significativas quando correspondentes a p<0,05.

RESULTADOS

Os animais permaneceram saudáveis, ganhando peso durante o período pós-operatório até a sua morte no 90o dia dos implantes autógenos. Não foram percebidas alterações de comportamento.

Não houve diferença na captação do radiofármaco pelos enxertos esplênicos dos cinco grupos. As dosagens séricas de leucócitos, hemácias, hemoglobina, hematócrito, IgM e estradiol não apresentaram diferença entre os cinco grupos quanto aos parâmetros testados.

O grupo cujos tecidos foram conservados em solução de coco modificado apresentou valores mais elevados de IgG em relação ao grupo cuja preservação foi em Ringer lactato (p=0,03).

Os animais cujos tecidos foram conservados em solução de Ringer lactato apresentaram valores menores de FSH que o grupo com conservação em solução de Belzer, valor de p<0,001. O grupo cuja conservação ocorreu em solução de coco verde mostrou valores de FSH menores que o grupo com conservação em solução de Belzer, valor de p=0,03. No grupo cujos tecidos foram conservados em solução de coco modificado os valores de FSH foram menores que o grupo com conservação em solução de Belzer, valor de p=0,01.

Os fragmentos esplênicos reduziram seu tamanho e estavam aderidos à borda hepática. Os fragmentos ovarianos localizaram-se na gordura pélvica, com tamanho reduzido.

Os implantes cutâneos evoluíram com áreas de necrose durante os primeiros sete dias. Formaram-se, em seguida, áreas de feridas granuladas e, posteriormente, cicatrizes pouco visíveis. O estudo microscópico dos implantes cutâneos não encontrou diferença entre as soluções de preservação estudadas. O estudo microscópico dos implantes esplênicos também não encontrou diferença entre as soluções de preservação estudadas.

Na análise microscópica dos tecidos ovarianos verificou-se a preservação em água de coco maduro mais eficaz do que o grupo cujos tecidos foram preservados pela água de coco modificada (p=0,01) e em relação ao grupo cujos tecidos foram preservados pela solução de Belzer (p=0,007) (Figura 1).

Figura 1 - Cortes histológicos dos tecidos estudados, preservados em água de coco maduro. (HE, 100x). A) Parênquima ovariano com tecido fibroso e processo inflamatório, apresentando folículo ovariano preservado (seta); B) Tecido ovariano com cistos foliculares indicando degeneração tecidual (seta); C) Tecido esplênico hemorrágico com folículos linfáticos, capilares sinusoides e cápsula esplênica íntegra (seta); D) Tecido cutâneo com epiderme (seta) e derme com folículos pilosos e tecido conjuntivo fibroso. 

DISCUSSÃO

A escolha dos tecidos estudados neste trabalho deveu-se à sua facilidade de mobilização e por fazerem parte de linhas de pesquisa iniciadas em 19839 - 12.

As imagens cintilográficas registraram a captação do radiofármaco pelos implantes esplênicos com dificuldade, devido à sobreposição da imagem hepática13. Entretanto, as dosagens de emissão de radiação pelos fragmentos de baço implantados não deixaram dúvida de que 12 semanas tenham sido suficientes para sua recuperação funcional fagocitária13 , 14. Não houve diferença entre os líquidos de conservação estudados em relação à avaliação da função dos implantes esplênicos pela cintilografia, que é método mais sensível para indicar captação por células esplênicas do que as análises sanguíneas14.

Os maiores níveis de IgG observados na conservação com solução de coco modificado em relação à conservação com solução de Ringer lactato pode significar melhor preservação esplênica naquela solução, talvez devido à sua composição química.

Em outros estudos, a solução de água de coco foi tão eficaz quanto à solução de Braun-Collins na preservação do folículo pré-antral de caprinos a 4°C e em temperaturas maiores. Por outro lado, mostrou-se eficaz na preservação de sémen, maturação de oócito e cultura de embrião15. Neste estudo, as soluções de água coco foram tão eficazes quanto as demais soluções na preservação dos implantes esplênico, ovariano e cutâneo. A dificuldade em evidenciar diferença entre a preservação tecidual pelas soluções em estudo pode ser devida ao curto período de preservação (seis horas), insuficiente para determinar o tempo máximo de capacidade conservadora de cada solução.

Outros autores relataram que a água de coco pode ser tão eficaz como solução salina para preservação de folículo ovariano em determinadas condições16. Essa informação justificaria a dificuldade para se evidenciar diferenças entre as soluções de preservação como Ringer lactato e Belzer. Por outro lado, esse período é suficiente na prática para o transporte dos tecidos do doador até seu implante no receptor.

O 3-indol-ácido acético (IAA), presente na água de coco, principal hormônio vegetal, pode ligar-se a fatores animais de crescimento do tecido ovariano e aumentar sua ação15. Entretanto, o presente estudo não evidenciou vantagens das soluções à base de coco na preservação dos tecidos, as quais poderiam dever-se à presença de substâncias como o IAA, exceto por melhor preservação histológica ovariana na solução de coco maduro em relação ás soluções de coco modificado e de Belzer.

A solução de coco modificado possui composição eletrolítica semelhante à solução de Belzer e foi submetida a processo fisicoquímico de esterilização e alteração de pH, o que pode ter alterado as propriedades naturais da água de coco17, justificando preservação não adequada do tecido ovariano, assim como pela solução de Belzer. Os níveis mais elevados de FSH podem sugerir menos eficácia da solução de Belzer para preservação da função ovariana.

Uma das propriedades principais da água de coco é atribuída à atividade antioxidante, por seu conteúdo de ácido ascórbico e glutationa3. A atividade antioxidante, necessária para as soluções de preservação18 diminui ao submeter a água de coco ao calor. A maior concentração de potássio nas soluções de Belzer e coco modificado poderia ser um fator para explicar a pior capacidade de preservação, por causa de particularidades do tecido ovariano19. Entretanto, a água de coco maduro, que possui níveis altos de potássio, foi tão eficaz quanto as demais substâncias na preservação dos implantes em estudo, com tendência a melhor preservação histológica da pele e ovários.

A ausência de glicose na solução de Belzer, presença de substratos inertes como responsáveis pela sua concentração osmótica e sua alta viscosidade20 podem ter prejudicado a preservação do tecido ovariano e talvez o tecido cutâneo. Outros autores observaram que substâncias de preservação enriquecidas com nutrientes apresentaram melhor preservação de alguns tecidos, como fígado, pâncreas e intestino delgado em relação à solução de Belzer 21.

A água de coco foi tão eficaz quanto as demais soluções na preservação dos implantes cutâneos. Alguma alteração da composição química da água de coco com seu amadurecimento, alterações de açúcares ou outros microelementos, redução da atividade enzimática, podem explicar a melhor preservação dos implantes nessa solução22.

Neste estudo observou-se que as soluções à base de água de coco foram tão eficientes como as demais soluções na preservação do baço, pele e ovário de ratos, durante seis horas. Há a necessidade de reforçar os achados deste trabalho com estudos de outros tecidos e órgãos, bem como de maior variabilidade de espécies animais. Há ainda a necessidade de estabelecer o período máximo de conservação tecidual em água de coco resfriada. As soluções de água de coco preservaram a vitalidade tecidual de baço, ovário e pele de rato durante seis horas, mantendo sua função. De acordo com a evolução dos trabalhos para busca de uma solução de preservação, este trabalho poderá gerar uma nova patente útil para o Brasil.

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Fonte de financiamento: nenhuma.

Recebido: 10 de Fevereiro de 2014; Aceito: 25 de Abril de 2014

Endereço para correspondência: Andy Petroianu E-mail: petroian@medicina.ufmg.br

Conflito de interesse: nenhum.

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