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Revista do Colégio Brasileiro de Cirurgiões

versão impressa ISSN 0100-6991versão On-line ISSN 1809-4546

Rev. Col. Bras. Cir. vol.43 no.1 Rio de Janeiro jan./fev. 2016

http://dx.doi.org/10.1590/0100-69912016001007 

Artigo Original

Hiperplasia miointimal na artéria ilíaca em coelhos submetidos à angioplastia e tratados com Moringa oleifera

Jânio Cipriano Rolim1 

Manoel Ricardo Sena Nogueira1 

Paulo Roberto da Silva Lima2 

Francisco Chavier Vieira Bandeira2 

Mizael Armando Abrantes Pordeus1 

Aldemar Araújo Castro3 

Guilherme Benjamin Pitta1 

Margareth de Fátima Formiga Melo Diniz4 

Adamastor Humberto Pereira1 

1. Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS, Porto Alegre, RS, Brasil

2. Universidade Federal de Alagoas - UFAL, Maceió, AL, Brasil

3. Universidade Estadual de Ciências da Saúde de Alagoas - UNICISAL, Maceió, AL, Brasil

4. Universidade Federal da Paraíba - UFPB, João Pessoa, PB, Brasil

RESUMO

Objetivo:

determinar a diferença da média de hiperplasia miointimal pós-angioplastia na artéria ilíaca de coelhos tratados e não tratados com extrato das folhas de Moringa oleifera.

Métodos:

ensaio aleatório em animais de laboratório por cinco semanas de seguimento, desenvolvido no Biotério do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Universidade Federal da Paraíba. Foram utilizadas coelhas da raça Nova Zelândia, submetidas à dieta hipercolesterolêmica e angioplastia da artéria ilíaca externa, randomizadas em dois grupos: Grupo M200 (n=10), coelhas tratadas com 200mg/kg/dia de extrato de folhas de Moringa oleifera, por via oral; Grupo SF (n=10), coelhas tratadas com soro fisiológico 0,9%, por via oral. Após cinco semanas, os animais foram eutanaziados e as artérias ilíacas preparadas para histologia. Os cortes histológicos foram analisados por morfometria digital. A análise estatística foi realizada com o teste t de Student. O nível de significância foi 0,05.

Resultados:

comparando as artérias ilíacas submetidas à angioplastia do grupo M200 com as do grupo SF, não houve diferença significativa da hiperplasia miointimal

Conclusão:

não houve diferença da hiperplasia miointimal nos grupos tratados com soro fisiológico e Moringa oleifera após angioplastia.

Palavras-Chave: Hiperplasia; Artéria Ilíaca; Moringa oleifera; Angioplastia; Coelhos

INTRODUÇÃO

A Cirurgia Vascular reconstrutiva tem enfrentado, na sua história, um fenômeno biológico complexo, comprometendo os resultados, que é a hiperplasia miointimal e a fibroplasia da anastomose, desenvolvida na anastomose vascular ou em seguida à angioplastia por balão, levando muitas vezes à oclusão vascular e insuficiência da revascularização. Diversas pesquisas têm sido dedicadas, ao longo dos anos, ao estudo dos mecanismos da íntima e tentativas de controlar o fenômeno por agentes farmacoterapêuticos, mas os resultados ainda estão longe de serem considerados satisfatórios1.

Hiperplasia miointimal é a proliferação e migração de células musculares lisas da camada média arterial, além de células da medula óssea que migram para a camada íntima diminuindo, dessa forma, o lúmen vascular2.

A Moringa oleifera, Lam (M. oleifera), também conhecida como Moringa pterygosperma Gaertn, é um membro da família de plantas Moringaceae, angiospermas perenes, que inclui 12 outras espécies. Nativa das partes sub-Himalaia do norte da Índia, é cultivada em todas as áreas tropicais e subtropicais do mundo, e é conhecida por vários nomes populares: árvore de baqueta, árvore de rábano e malunggay, este o mais comumente encontrado na literatura3.

A Moringa oleifera é uma planta comestível. Uma grande variedade de virtudes nutricionais e medicinais tem sido atribuída às suas raízes, cascas, folhas, flores, frutos e sementes4,5. Análises fitoquímicas têm evidenciado que as folhas são particularmente ricas em potássio, cálcio, fosfato phorous-ferro, vitaminas A e D, aminoácidos essenciais, bem como, conhecidos antioxidantes, como â-caroteno, vitamina C, e flavonóides6-10.

A flor da moringa tem alto valor medicinal, como estimulante, afrodisíaco, abortivo, anti-inflamatório. Age em doenças musculares, tem ação antitumoral, diminui os triglicérides, bem como, os colesteróis sérico e suas frações - Very Low Density Lipoprotein (VLDL), Low Density Lipoprotein (LDL), melhorando o índice aterogênico. Diminui o perfil lipídico no coração, no fígado e na aorta de coelhos hipercolesterolêmicos e aumenta a excreção fecal de colesterol. Já a folha tem atividades purgativas, aplicada como cataplasma para feridas. Foi usada nos templos para dores de cabeça, bem como, para hemorróidas, febre, dor de garganta, bronquite, olhos e infecções de ouvido, escorbuto e catarro. Acredita-se que o suco da folha é eficiente para controlar os níveis de glicose4.

Dados experimentais11 e as primeiras pesquisas clínicas mostraram que a inibição da hiperplasia miointimal pode ser obtida por administração local de drogas antiproliferativos, como paclitaxel, carregados sobre a superfície de balões de angioplastia. Por conseguinte, os balões eluidores de medicamentos são uma ferramenta promissora para prevenir a reestenose e evitar a persistência indesejável dos polímeros dos stents eluidores de drogas na parede do vaso, aumentando assim, potencialmente, a segurança da intervenção coronariana percutânea12-14.

A presente pesquisa objetivou determinar a diferença de frequência de hiperplasia miointimal pós-angioplastia na artéria ilíaca de coelhos com aterosclerose experimental tratados e não tratados com extrato das folhas da Moringa oleifera.

MÉTODOS

O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal do Laboratório de Tecnologia Farmacológica (CEPA/LTF) da Universidade Federal da Paraíba (UFPB), Campus I, João Pessoa, PB (protocolo 602/2011), e a pesquisa desenvolvida no Biotério do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica.

Tipo de estudo

Ensaio clínico aleatório em animais de experimentação por cinco semanas de seguimento.

Amostra

Critérios de inclusão

Foram incluídos 20 coelhos fêmeas adultos jovens (12 meses de idade e pesando mais de 2kg de peso corporal) da espécie Oryctolagus cuniculus da linhagem Nova Zelândia, submetidos ao processo de hiperplasia intimal da artéria ilíaca comum esquerda pós aterosclerose experimental por gema de ovo15.

Critérios de exclusão

Foram excluídos os coelhos com idade superior a seis meses, peso corporal inferior aos 2kg e superior aos 4kg, portadores de doença prévia ou com alterações anatômicas das estruturas abordadas.

Amostragem

Foram estudados os coelhos selecionados, que formaram uma amostra probabilística.

Randomização

O sorteio dos animais para cada grupo foi feito aleatoriamente por permutação de bloco16 com o auxílio de um programa Research Randomizer (disponível em: http://www.randomizer.org/form.htm), sendo dois blocos com dez números. Cada bloco correspondeu a um grupo e os números gerados aos animais. Constituíram dois grupos com dez coelhas cada.

Os animais receberam uma letra e um número correspondente ao grupo de administração e para identificação do animal (exemplo: M1 - animal 1 do grupo Moringa; C2 - animal 2 do grupo controle). Essa marcação foi feita por meio de escrita feita por tinta azul indelével na face interna da base da orelha com caneta tipo piloto permanente (permanent mark).

A aterosclerose foi induzida, utilizando uma dieta hipercolesterolêmica à base de gema de ovo; 20ml/dia, divididas em duas tomadas, por via oral, num período de 100 dias.

Optou-se pelo manejo fechado dos animais e a experimentação foi realizada no próprio biotério de origem, onde existe um ambiente propício, com sistema de ventilação-exaustão forçado, períodos de luminescência natural, temperatura média de 20oC, ruído mínimo e umidade em torno de 50%. Os animais foram mantidos em gaiolas individuais apropriadas com área de 0,64m2, sem contato com as secreções naturais, pois são adaptadas para que se mantenha a devida higiene. A dieta foi constituída de água e ração comercial granulada ad libtum, antes e durante o experimento, conforme literatura17.

A hiperplasia miointimal foi induzida pela seguinte técnica: as coelhas foram anestesiadas com xilazina na dose de 10mg/kg e ketamina na dose de 40mg/kg, por via intramuscular, na coxa, segunda técnica descrita na literatura. A oxigenação foi mantida por entubação orotraqueal seguindo a técnica de visão direta, acoplada à fonte de O2 com o auxílio de anestesista18. Após indução anestésica, foram realizadas tricotomias nas regiões inferior do abdome e inguinal, seguidas de limpeza adequada do local, e antissepsia com álcool iodado. Procedeu-se, então, a incisão na pele com 2 a 3 cm de extensão no sentido longitudinal na prega inguinal com bisturi lâmina 15, para exposição da artéria femoral direita, que foi reparada com sutura simples de nylon 3.0, ao final do procedimento. Foi coletada amostra de sangue para dosagem de colesterol total, High Density Lipoprotein (HDL), LDL, VLDL e triglicerídeos. Este sangue foi enviado ao laboratório de bioquímica do Biotério para a respectiva dosagem. Foi realizada pequena arteriotomia transversal com bisturi lâmina 11, por meio da qual foi introduzida uma guia metálica número 0,014" (polegadas), pela qual foi introduzido um cateter-balão de 3mm de diâmetro por 20mm de comprimento (raio balão/artéria de 2,5 a 3,0:1), que foi inserido no lúmen da artéria ilíaca direita (AID). Em cada artéria, o cateter-balão foi insuflado pelo tempo de um minuto, na pressão nominal, levando à distensão da parede arterial. Após desinsuflação do balão, foi realizada ligadura das artérias com fio algodão 3.0. Por fim, a pele foi suturada com fio de nylon 3,0. Foram administrados analgésicos (ibuprofeno 10mg/kg por via oral, por cinco dias) e antibióticos (cefaclor 20mg/kg/dia dividido em duas tomadas) para ambos os grupos no pós-operatório para evitar sofrimento do animal. Vinte e quatro horas após a realização da lesão arterial, iniciou-se a administração das drogas de nossa pesquisa nos dois grupos.

O grupo M (Moringa) recebeu 200mg/kg de extrato etanólico bruto das folhas de Moringa oleífera por gavagem por cinco semanas e o grupo C (controle negativo) recebeu soro fisiológico 0,9% 10ml/dia por cinco semanas por gavagem.

Com o término do experimento, os animais foram submetidos à eutanásia sob dose letal do anestésico, e foram coletadas as artérias ilíacas comuns com o seguimento que foi submetido à lesão pelo balão entre as excisões. Além disso, foi coletada nova amostra de sangue para dosagem de colesterol total, HDL, LDL, VLDL e triglicerídeos. Os blocos arteriais foram fixados em formalina a 10% por no mínimo 24h e, em seguida, levados para o preparo rotineiro de lâminas histológicas para microscopia óptica: desidratação gradativa e crescente de álcool a 70% até o álcool absoluto - diafanização em xilol e embebição em parafina líquida a 60oC. Os blocos de parafina, assim preparados, foram cortados no micrótomo com espessura de 3ìm e os cortes montados em lâminas de vidro extrafinas (76 x 25 mm). Em seguida foram coradas em hematoxilina-eosina (HE); depois, montadas com lamínulas e resina natural. As lâminas foram preparadas e examinadas por patologista devidamente credenciado com aumentos de 10 e 40 vezes.

O sangue foi enviado para o laboratório, onde foi realizada a dosagem padrão dos parâmetros acima.

O mascaramento para a microscopia foi realizado pela numeração sequencial, sendo que a verdadeira correlação era conhecida apenas por aquele que realizara a marcação das orelhas (pesquisador principal). A nova identificação foi guardada em envelope selado, que só foi aberto no momento da análise dos dados, após a mensuração da variável primária. O patologista não soube qual método foi utilizado no vaso alvo.

Após análise histológica, as lâminas foram fotografadas com câmera fotográfica digital (Canon Power Shot A640(r)) em aumento óptico de 4x associado a aumentos óptico do microscópio (Nykon(r)) de 2x e 10x.

As imagens dos cortes histológicos, coradas pelo método de HE, foram digitalizadas para análise morfométrica a partir da microscopia óptica convencional com objetiva de 2x, com lentes plano-acromáticas, câmera de circuito fechado colorida com zoom óptico de 4x, gerando arquivos de imagem com 3648 x 2736 pixels. As imagens foram digitalizadas com aumento microscópico de 2x. As medidas morfométricas foram realizadas por meio de sistema de processamento e análise digital "ImageJ64 NIH Image", sem a interferência do observador, mantido "cego" na mensuração. Para cada segmento analisado, foram medidas a área da luz e a área interna das lâminas elásticas interna e externa. Com base nesses resultados, foram calculados: 1) a área da camada médio intimal - subtraindo-se a região da parede do vaso compreendida entre lâmina elástica externa e a luz do vaso; 2) o índice da hiperplasia médio intimal - dividindo-se a área da camada médio intimal pela sua soma com a luz do vaso.

A variável primária foi a diferença de frequência da média de hiperplasia miointimal.

Para a eficácia do tratamento, a hiperplasia miontimal foi avaliada por morfometria; os valores foram em área e em pixels, em seguida, realizada a média de cada grupo. A diferença dessas médias da área é que foi utilizada para afirmar qual tratamento é mais eficiente.

As variáveis secundárias foram o colesterol total e suas frações (HDL, LDL, VLDL) e triglicérides.

Como dados complementares, foram estudados o peso corporal do animal (massa ou quantidade de peso de um indivíduo, expresso em unidades de quilogramas). O quilograma é a quantidade de massa, que é igual à massa do protótipo internacional do quilograma19; idade (calculada, em meses completos, no último dia do mês de referência da pesquisa, com base no dia, mês e ano do nascimento do animal).

Método estatístico

Cálculo do tamanho da amostra

O tamanho da amostra foi arbitrado em 20 coelhos, baseado na literatura, onde há trabalhos que comprovam resultados estatísticos aceitáveis com um número menor de animais no experimento com modelo animal semelhante20-22 e para respeitar as normas da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratórios (SBCAL). A análise estatística foi realizada com o teste t de Student e calculando o intervalo de confiança (IC) de 95% para cada ponto estimado.

Análise estatística

Os dados foram coletados em um formulário padronizado e os dados armazenados em uma planilha eletrônica de dados. A análise descritiva foi realizada calculando o intervalo de confiança de 95% para cada ponto estimado. Os cálculos foram realizados com o auxílio do aplicativo estatístico GraphPad Instat(r) Prism 5 (2012), versão para Mac.

Os dados são apresentados como média e desvio padrão. A comparação entre os grupos foi realizada através do teste t de Student, para os dados histomorfométricos. Os cálculos foram realizados com o auxílio do aplicativo estatístico GraphPad Instat(r) Prism 5 (2012), versão para Mac.

RESULTADOS

Comparando-se a média do complexo médio intimal dos grupos estudados (Média SF = 35,74% da artéria) e (Média M 200 = 38,66% da artéria), não houve diferença estatística quando aplicamos o teste U de Mann-Whitney; P=0,33 (Tabela 1).

Tabela 1 - Complexo Médio Intimal das Artérias Ilíacas. 

P = 0,33

Quando comparados os valores do colesterol total, HDL, LDL e Triglicérides, também não foram estatisticamente significativos.

Em relação ao peso, houve diferença nas médias de ambos os grupos quando comparamos os períodos pré e pós experimento (Tabelas 2 a 5 e Figura 1).

Tabela 2 - Lipidograma pré-medicação - Grupo SF. 

Tabela 3 - Lipidograma pós-medicação - Grupo SF. 

Tabela 4 - Lipidograma pré-medicação Grupo M 200. 

Tabela 5 - Lipidograma pós-medicação - Grupo M 200. 

Figura 1 - Fotomicrografia do complexo miointimal das arterias de coelhos. Esquerda - Grupo da Moringa oleífera 200mg/Kg/dia. Direita - Grupo controle Aumento de 8x HE. 

DISCUSSÃO

A pesquisa foi realizada em coelhos, uma vez que Yanni mostrou que os coelhos New Zealand (Oryctolagus cuniculus) são muito sensíveis à indução de lesões ateroscleróticas e cita como um dos mais importantes modelos de estudo de aterosclerose20. A construção de modelos induzindo a aterosclerose, farmacologicamente ou através de dietas aterogênicas, associada à lesão por balão de angioplastia, resulta em formação de placas similares àquelas encontradas em artérias coronárias humanas20.

Brasselet et al., também utilizaram artérias ilíacas de coelhos submetidos à aterosclerose experimental com dieta com alto teor de colesterol21. No entanto, a análise das artérias ilíacas de coelhos contrapôs a predominância das lesões ateroscleróticas que se encontram, mais frequentemente, no arco aórtico e aorta torácica de coelhos submetidos à aterosclerose experimental, segundo Taylor e Fan22.

O território ilíaco foi escolhido pela existência de dados que demonstram que esse sítio é um território em que a angioplastia pode ser realizada, inclusive com o implante seletivo de stent23, o que não foi realizado nesta pesquisa, uma vez que se optou apenas por angioplastia por balão. Estudo, como o clássico de Indolfi et al., que utilizou cateter de Fogarty para provocar a lesão endotelial mostrou que a reestenose após angioplastia com cateter balão era causada pelo remodelamento elástico negativo e pela proliferação e migração das células musculares lisas vasculares (CMLV)24. No modelo citado, utilizando carótidas de ratos, a resposta da parede arterial ao dano provocado pela angioplastia é a liberação de fatores de crescimento e outros fatores, biologicamente ativos, que mudam a composição da matriz extracelular e promovem a mudança fenotípica das CMLV de contráteis para sintéticas (desdiferenciação), levando à proliferação das células na camada média e migração para a camada íntima, formando a neointima24. Da mesma forma, Mongiardo et al. utilizam o balão de angioplastia para simular com maior fidedignidade o stress induzido pela angioplastia25. A presente investigação foi realizada com insuflação de um balão de angioplastia 3,0 x 20 mm na artéria ilíaca de coelho, utilizando pressão nominal máxima (Pressão de ruptura) do balão por um período de um minuto e obedecendo a uma proporcionalidade (balão:artéria) de 2,5-3,0:1, enquanto o estudo de Taylor22 obedeceu à razão de 1,0-1,2:1.

O resultado da pesquisa não apresentou efeito significativo na redução de peso, colesterol ou triglicérides. Estas variáveis secundárias analisadas, ao contrário do trabalho de Metha et al., que mostrou haver efeito hipolipidêmico e influiu na diminuição do peso dos coelhos26. A presente pesquisa, assim como a de Metha et al., utilizou a dosagem de 200mg/kg/dia de extrato alcoólico de folhas, sendo que aquele autor utilizou os frutos durante o período de 120 dias. Em nosso estudo, a intervenção foi feita em 35 dias, uma vez que o objetivo principal era a avaliação do efeito do extrato de folha Moringa na hiperplasia intimal, já que as fases da hiperplasia intimal giram em torno de quatro semanas, segundo literatura e de acordo com Indolfi et al.24.

Karas et al. defende o modelo suíno como modelo ideal para a reprodução de hiperplasia27. Entretanto, um bom modelo de reestenose necessita de animais mais baratos, acessíveis e fáceis de manusear. Assim como Le Tourneau et al.28, optou-se por utilizar as artérias ilíacas de coelhos hipercolesterolêmicos como modelo animal para aterosclerose e hiperplasia miointimal.

Jain et al. utilizaram até 600mg/kg/dia quando avaliaram a atividade hipolipidêmica da Moringa oleífera Lam29. Dessa forma, outras concentrações maiores podem ser testadas.

Em relação aos níveis de lipídios, não se obteve, também, diferença estatística, talvez porque a dieta aterogênica tenha sido suspensa no período que sucedeu à angioplastia.

Por fim, a investigação não apresentou diferença significativa em relação à área miointimal quando se comparou o grupo controle, em que se utilizou o soro fisiológico, e o grupo em que se administrou o extrato de folhas de moringa na dosagem de 200mg/kg/dia, possivelmente devido à baixa dosagem do extrato de moringa.

Estudos com dosagens maiores do extrato folha de moringa devem ser realizados, podendo ainda submeter outras partes da planta a testes, uma vez que há uma série crescente de trabalhos mostrando efeitos benéficos quando se utiliza com intuitos medicinais.

Concluindo, não houve diferença de frequência de hiperplasia miointimal na artéria ilíaca nos grupos tratados com soro fisiológico e Moringa oleifera, na concentração estudada, após angioplastia.

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Fonte de financiamento: nenhuma.

Recebido: 10 de Setembro de 2015; Aceito: 02 de Dezembro de 2015

Endereço para correspondência:Jânio Cipriano Rolim E-mail: janio_rolim@hotmail.com

Conflito de interesse: nenhum.

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