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Revista do Colégio Brasileiro de Cirurgiões

versão impressa ISSN 0100-6991versão On-line ISSN 1809-4546

Rev. Col. Bras. Cir. vol.43 no.1 Rio de Janeiro jan./fev. 2016

http://dx.doi.org/10.1590/0100-69912016001008 

Artigo Original

O papel da expressão imunoistoquímica do P16ink4a e do P53 na predição da recorrência da nic-ag após tratamento por conização

Fernanda Villar Fonseca1 

Flávio Daniel S. Tomasich2 

Juliana Elizabeth Jung3 

Carlos Afonso Maestri1 

Newton Sérgio de Carvalho4 

1. Serviço de Patologia Cervical do Hospital Erasto Gaertner (HEG), Curitiba, PR, Brasil

2. Universidade Federal do Paraná (UFPR), Curitiba, PR, Brasil

3. Serviço de Anatomia-patológica do Hospital Erasto Gaertner (HEG), Curitiba, PR, Brasil

4. Departamento de Tocoginecologia da Universidade Federal do Paraná

RESUMO

Objetivo

: avaliar a expressão dos biomarcadores p16INK4a e p53, nas peças de conização de pacientes com neoplasia intraepitelial cervical de alto grau (NIC-AG), correlacionando com a capacidade de predizer o risco de recorrência.

Métodos

: estudo retrospectivo de pacientes com NIC-AG em biópsia de colo uterino, tratadas por conização, entre janeiro de 1999 e janeiro de 2006 e seguimento mínimo de 18 meses. A expressão dos biomarcadores p16 e p53 foi avaliada através de técnica de microarranjos teciduais e correlacionada com a recorrência da doença. Para análise utilizou-se o teste das proporções (qui-quadrado), considerando valor p<0,05, IC95% e cálculos de sensibilidade, especificidade e acurácia destes imunomarcadores na predição de recorrência.

Resultados

: oitenta e três pacientes, idade entre 16 e 86 anos (35±11,7), divididas em dois grupos: 30 com recorrência da NIC-AG (grupo estudo) e 53 sem recorrência (grupo controle). A média de idade, paridade, hábito de fumar e técnica de conização foram semelhantes nos dois grupos. A expressão do p53 esteve presente em 43% do grupo estudo e 57% do grupo controle e para o p16 esteve presente em 43% do grupo estudo e 57% do grupo controle (p>0,05). O p53 apresentou valor preditivo positivo (VPP) de 42% e valor preditivo negativo (VPN) de 73%, sensibilidade de 70%, especificidade de 47% e acurácia de 59%. O p16, VPP de 42% e VPN de 72%, sensibilidade de 66%, especificidade de 49% e acurácia de 56%.

Conclusão

: a expressão imunoistoquiímica do p53 e do p16 apresentaram baixa sensibilidade e baixa especificidade como marcadores capazes de predizer a recorrência da NIC-AG tratada por conização.

Palavras-Chave: Neoplasia Intraepitelial Cervical; Conização; Recidiva; Marcadores Biológicos

INTRODUÇÃO

O câncer do colo uterino ainda se apresenta como um problema de saúde pública no Brasil e no mundo, tanto por sua alta incidência, como por sua elevada morbimortalidade1,2.

O que particulariza este câncer em relação às demais neoplasias é o fato de que se desenvolve a partir de lesões pré-invasivas bem definidas, de comportamento conhecido, e de evolução lenta, as chamadas "neoplasias intraepiteliais cervicais (NIC)"3.

Além da recorrência da lesão nos primeiros anos de seguimento, as mulheres que foram tratadas de NIC 2 ou 3 permanecem em risco de desenvolver um carcinoma invasor por um longo período de tempo4.

Os índices de recorrência pós-tratamento conservador variam entre 13 e 26%, nos trabalhos mais recentes5-7. Ainda não é possível predizer quais casos de NIC irão progredir ou regredir. Seguimento regular por citologia pode proporcionar boa eficácia através da detecção das alterações celulares e conseguir, com isso, significante redução nos índices de morbimortalidade do câncer do colo uterino através do diagnóstico precoce, entretanto, o custo-efetividade deste seguimento ainda está em debate8.

A detecção de alterações celulares originadas pela expressão desregulada das oncoproteínas virais aparece como promissor na caracterização de marcadores de progressão tumoral. A identificação e o estabelecimento do padrão de alteração dessas proteínas poderão definir marcadores com alto poder preditivo positivo4.

A proteína supressora tumoral celular p16INK4a tem sido identificada como um marcador da infecção por HPV (human papiloma vírus). Em uma infecção HPV transformante, os oncogenes virais E6 e E7 interferem substancialmente com a apoptose e a regulação do ciclo celular. Células afetadas expressam fortemente a p16 para controlar a ativação do ciclo celular irregular, podendo ser detectado por imunohistoquímica9,10.

A proteína 53 (p53) é uma proteína supressora tumoral que, nos seres humanos, é codificada pelo gene TP5311. Como "guardiã do genoma" pode parar o ciclo celular em resposta a um dano ao DNA da célula. O oncogene viral E6 do HPV modifica a proteína p53 e a inativa, interferindo no controle do ciclo celular11.

A importância da inativação da p53 na carcinogênese cervical tem sido bem documentada, entretanto, estudos têm falhado em demonstrar diferentes escores de imunorreatividade da p53 em neoplasia intraepitelial cervical e o câncer cervical. Também têm reportado resultados conflitantes da relação entre a expressão do p53 e a progressão da neoplasia intraepitelial do colo uterino12.

Poucos estudos têm correlacionado a capacidade de predizer a recorrência da NIC-AG tratada, com a expressão das proteínas tumorais por imunoistoquímica13,14.

Tendo em vista a importância da avaliação do papel dos biomarcadores na predição da progressão das lesões de NIC-AG, o presente estudo visa avaliar a expressão dos biomarcadores p16INK4a e p53, nas peças de conização de pacientes com diagnóstico de neoplasia intraepitelial cervical, utilizando a imunoistoquímica em microarranjos teciduais, e correlacionando esta expressão com a capacidade de predizer recorrência da doença.

MÉTODOS

Foram avaliadas 83 pacientes com diagnóstico histológico de neoplasia intraepitelial cervical de alto grau (NIC 2 e 3), que foram tratadas por conização, no Hospital Erasto Gaertner, Curitiba/PR, no período de janeiro de 1999 a janeiro de 2006.

A amostra de pacientes foi dividida em dois grupos: - Grupo ESTUDO (pacientes com recorrência da NIC-AG, após o tratamento por conização, em seguimento mínimo de 18 meses); - Grupo CONTROLE (pacientes com ausência de recorrência da doença, após tratamento por conização, em seguimento mínimo de 18 meses).

O estudo foi devidamente aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do HEG sob o protocolo no 1947.

Seleção da amostra

Critérios de inclusão: mulheres acompanhadas no Serviço de Patologia Cervical do HEG, entre 16 e 86 anos de idade, que foram submetidas à citologia, colposcopia e biópsia do colo uterino comprovando NIC-AG, e tratadas por conização, identificando qualquer grau de NIC no produto histológico do cone, e com seguimento mínimo de 18 meses. O seguimento foi considerado adequado quando era realizado através de citologia, colposcopia, e, se necessário, biópsia, em intervalo semestral.

Critérios de exclusão: dados insuficientes de prontuário, tempo de seguimento clínico pós-conização inferior a 18 meses, pacientes submetidas à histerectomia por doença benigna, presença de carcinoma invasor em biópsia ou no produto da conização, ausência de evidência de neoplasia intraepitelial cervical após avaliação microscópica do produto de conização e blocos de parafina em condições inadequadas para a realização da imunoistoquímica.

Foi determinado como recorrência da doença a presença de NIC 1, 2 ou 3 em citologia, colposcopia e/ou biópsia de colo uterino durante o seguimento clínico.

Técnica de preparo e leitura das lâminas para realização da imunohistoquímica

A expressão das proteínas foi observada em lâminas de tissue microarray confeccionadas a partir do bloco de parafina do produto de conização.

Foram confeccionados novos cortes histológicos, a partir dos blocos de parafina originais do produto da conização de cada paciente, pela técnica detissue microarray, para serem submetidas à aplicação dos imunomarcadores p53 e p16INK4a, de forma artesanal, no Laboratório de Patologia Experimental da PUCPR.

Cada lâmina de tissue foi confeccionada com 20 amostras, sendo uma de cada paciente, totalizando seis lâminas detissue para cada imunomarcador, sem identificação do grupo pertencente, de modo que a leitura da reação imunoistoquímica fosse feita evitando viés de contaminação.

Os kits de imunoistoquímica utilizados foram: - Anticorpo p53 pré-diluído (monoclonal de rato, clone DO-7, diluído 1:100, Biocare Medical(r), Concord, USA); - Anticorpo p16 pré-diluído (monoclonal de rato, clone 16p04-jc2, diluído 1:100, Bio Sb(r), Santa Barbara, California, USA).

Após preparo, as lâminas foram submetidas aos seguintes processos: desparafinização; recuperação antigênica com citrato pH 6,0; bloqueio de peroxidase endógena; diluição de cada anticorpo a 1:100 e aplicação do anticorpo primário sobre cada lâmina, depois lavagem com PBS específico de cada imunomarcador; aplicação do anticorpo secundário e, finalmente, aplicação do DAB específico e contracoloração.

Foram determinados os seguintes elementos imunoistoquímicos: positividade da reação e sua intensidade (análise qualitativa), padrão de positividade da reação (análise quantitativa) e imunolocalização (avaliada somente para o anticorpo p16).

Os elementos imunoistoquímicos foram definidos em semelhança à pesquisa de Jung et al., publicada em 2010, em seu estudo de marcadores de progressão tumoral15.

A análise qualitativa foi dividida em reação positiva e negativa. A reação foi considerada positiva quando impregnou de coloração amarronada os núcleos e/ou o citoplasma de ao menos 25% da amostra viável e avaliável do tumor. A reação negativa foi considerada quando não houve nenhuma coloração característica da reação imunoistoquímica.

A reação positiva foi dividida em dois grupos: positiva forte (quando a intensidade da coloração foi semelhante ao controle utilizado) e positiva fraca (quando a intensidade da coloração foi substancialmente menor do que a do controle positivo utilizado, só podendo ser observada com clareza com aumento de 100 vezes).

A análise quantitativa foi classificada como: positividade difusa (a reação foi positiva numa extensão que englobava mais de 50% da amostra viável e avaliável), positividade multifocal intensa (a reação foi positiva numa extensão que englobava entre 25 e 50% da amostra viável e avaliável do tumor) e positividade multifocal leve (a reação foi positiva numa extensão que englobava menos de 25% da amostra viável e avaliável).

Para o p16 ainda foi determinado a imunolocalização e ficou assim classificado: padrão nuclear de positividade, padrão citoplasmático de positividade, padrão nuclear e citoplasmático de positividade simultâneos.

O imunomarcador demonstrou coloração castanho-amarronada, em nível nuclear, para os cortes positivos para o p53 e castanho-amarronada, em nível nuclear e citoplasmático, para o p16 (Figura 1).

Fonte: Laboratório de Anatomia-patológica, HEG A- reação negativa para p16 (nem núcleo nem citoplasma coram); Breação positiva para p16 (coloração amarronada nos núcleos e citoplasma); C- reação negativa para p53 (nenhuma coloração nos núcleos); D- reação positiva para p53 (coloração amarronada no núcleos).

Figura 1 - O contraste da expressão imunoistoquímica dos biomarcadores p16INK4 e p53 em peças histológicas contendo neoplasia intraepitelial cervical. 

Depois de aplicados esses critérios, o estudo resultou em 83 pacientes, sendo 30 no grupo estudo e 53 pacientes no grupo controle (organograma, Figura 2).

Figura 2 - Diagrama Consort (Desenho do Estudo). 

Análise estatística

Foi realizada análise estatística das variáveis, utilizando-se o programa SPSS 12.0, buscando Intervalo de Confiança superior a 95% e nível de significância de 5%.

Para a equiparação dos dois grupos estudados foram avaliadas as variáveis idade, paridade, tipo de tratamento realizado e tempo de seguimento pós-tratamento.

Para a comparação da variável idade foi utilizado o teste t deStudent. Para comparação da variável paridade foi utilizado o teste não paramétrico de Mann-Whitney.

Na análise dos imunomarcadores, a comparação da positividade de imunorreação entre os grupos estudo e controle foi realizada por meio do teste do qui-quadrado e/ou teste exato de Fisher e identificado o valor de p. Realizado ainda o cálculo do valor preditivo positivo (VPP) e do valor preditivo negativo (VPN), sensibilidade, especificidade e acurácia de cada marcador para predizer a recorrência.

RESULTADOS

O grupo estudo apresentou média de idade de 36±12 anos (IC95%: 33-40), média de paridade de 3±2 filhos (IC95%: 2-4), 42% tinham hábito de fumar e 95% delas foram tratadas com conização por cautério de alta frequência (CAF) e 5% com conização a bisturi a frio.

O grupo controle apresentou média de idade de 34±12 anos (IC95%: 31-37), média de paridade de 3±2 filhos (IC95%: 2-3), 50% tinham hábito de fumar e 92% delas foram tratadas por CAF e 8% com conização por bisturi a frio.

Não houve diferença estatística entre os grupos quando comparados por idade (p=0.2), paridade (p=0.2), hábito de fumar (p=0.5) e técnica de conização (p=0.7).

Das 83 pacientes analisadas, todas tinham resultado de NIC 2 ou 3 em biópsia de colo uterino prévia à conização e o produto histológico da conização exibiu resultados entre NIC 1 e 3. No produto de conização do grupo controle: três casos de NIC 1, 25 casos de NIC 2, 26 casos de NIC 3. No produto de conização do grupo estudo: três casos de NIC 1, nove casos de NIC 2, 18 casos de NIC 3, não demonstrando diferença estatística quanto ao grau da gravidade da NIC no produto final da conização, entre os grupos, no que tange ao risco de recorrência (p=0.1).

Na análise dos imunomarcadores, cada grupo foi avaliado individualmente para recorrência e/ou cura clínica e feito o cálculo do valor preditivo positivo (VPP) e do valor positivo negativo (VPN) do teste, a sensibilidade, a especificidade e a acurácia de cada marcador na previsão desta recorrência.

O p53 esteve presente em 43% (n=21) das pacientes do grupo estudo e em 57% (n=28) do grupo controle, e da mesma forma, não foi identificado em 73% (n=25) das pacientes do grupo controle e em 26% (n=9) do estudo. Não exibiu, portanto, valor de significância estatística para predizer recorrência da doença, com valor de p igual a 0,1 (Tabela 1).

Tabela 1 - Análise quali-quantitativa da reação imunoistoquímica do p16 e do p53 como testes capazes de prever recorrência da NIC-AG tratada por conização. 

O p16 foi encontrado em 43% (n=20) das pacientes do grupo estudo e em 57% (n=27) do grupo controle. Em contraposto, não foi detectado em 72% (n=26) das pacientes do grupo controle e 28% (n=10) do grupo estudo. Da mesma forma, também não evidenciou valor de significância estatística para predizer recorrência, com valor de p=0,1 (Tabela 1).

Baseado nesses dados, para o P53 o VPP foi 42% e o valor VPN, 73%. Este apresentou sensibilidade de 70%, especificidade de 47% e acurácia de 59% para predizer a recorrência da NIC.

Para o p16, o VPP do exame foi 42% e o VPN, 72%, na mesma situação, demonstrando sensibilidade de 66%, especificidade de 49% e acurácia de 56% do teste para predizer recorrência da doença.

Não houve diferença significante na análise quantitativa da reação imunoistoquímica entre os grupos estudados para o p53 (Tabela 1).

Na análise quantitativa do p16, o único padrão identificado com clareza da reação imunoistoquímica, foi o que distinguiu entre forte, fraco e negativo para a proteína, pois dentre os que exibiram reação forte, 58% deles estavam no grupo estudo, os que exibiram reação fraca 74% estavam no grupo controle e dos que não exibiram reação, 72% estavam no grupo controle, identificando um valor de p=0,02 (Tabela 1).

Também para o p16, quando comparados os grupos na análise quantitativa, identificou-se que 70% dos que não exibiram reação estavam no grupo controle e que aqueles com reação de padrão forte/difuso/corando núcleo e citoplasma, 61% deles estavam no grupo estudo (Tabela1).

DISCUSSÃO

Ao longo das últimas décadas, diversos estudos epidemiológicos e laboratoriais têm demonstrado que o carcinoma invasor do colo uterino é uma doença complexa, com muitos determinantes ambientais e genéticos3. Apesar do adequado tratamento da lesão precursora, a recorrência da NIC ocorrerá em média em 1 a 25% dos casos, o que aumenta o risco para o câncer invasor16,17.

Determinar o risco de desenvolvimento e o prognóstico, bem como, o sucesso do tratamento em resposta a uma determinada medicação e/ou procedimento, constituem a principal razão para a identificação de biomarcadores8.

Muitos estudos recentes têm verificado a importância do p16 e do p53 na neoplasia cervical9,12-14,17-34. Em sua grande maioria avaliaram o percentual de positividade do imunomarcador em relação à presença de neoplasia intraepitelial cervical e correlacionaram com a gravidade da lesão9,12,13,17,18,21-29. Entretanto, poucos foram os estudos que relacionaram imunorreação com recorrência e/ou prognóstico da doença13,14-31.

Um estudo coreano13 tentou correlacionar a via relacionada ao pRb com o risco de recorrência. Analisou 265 blocos histológicos de pacientes tratadas de NIC e submeteu a reação imunoistoquímica para p16 e encontrou percentual menor da reação imunoistoquímica nas pacientes de NIC 1, 2 e 3 que apresentaram recorrência do que no grupo que não encontrou recorrência, semelhante ao estudo aqui realizado.

Um estudo mais recente26, desenvolvido na Grécia, procurou identificar as principais alterações que ocorriam nos biomarcadores relacionados ao HPV após seis meses do tratamento da NIC e tentou identificar como sua expressão poderia prever a falha deste tratamento. E, embora a maioria dos marcadores avaliados, entre eles o p16, obtivesse altas taxas de negativação de sua expressão, concluíram ser ainda necessária a análise de mais casos de falha terapêutica para poder identificar um marcador com acurácia elevada para poder garantir um seguimento de qualidade.

Outro estudo também recente14, analisando 55 casos de NIC 2 e 3 em peças de biópsias de colo uterino, estudou como os marcadores relacionados às vias do pRb e do P53 poderiam ser úteis na identificação da regressão da lesão. Concluiu que o alto percentual de expressão do pRb e do p53 estiveram relacionados à maior chance de regressão, o que, de certa forma, vem de encontro ao estudo aqui relacionado, que não conseguiu relacionar a superexpressão do p16 e do p53 com a recorrência da doença.

De forma diferente, alguns estudos mais antigos tentaram relacionar a expressão do p53 e do p1627,28 com o prognóstico do carcinoma invasor. O primeiro27 conseguiu relacionar a superexpressão do p53 com mau prognóstico do carcinoma invasor do colo uterino e correlacionou esta expressão com menor sobrevida livre da doença e maior risco de recorrência. Entretanto o segundo28, avaliando a expressão do p53 e do p16 em pacientes com estádio clínico 1b e 2a de carcinoma de colo uterino, não conseguiu identificar esta correlação com fatores prognósticos.

Como ainda não há na literatura um padrão absoluto na leitura destes imunomarcadores, os critérios estabelecidos neste estudo foram determinados baseados na orientação do fabricante, nos padrões estipulados pela maioria dos trabalhos estudados e também na avaliação subjetiva dos autores, determinando os seguintes elementos imunoistoquímicos: positividade da reação e sua intensidade (análise qualitativa), padrão de positividade da reação (análise quantitativa) e imunolocalização (avaliada somente para o anticorpo p16).

A maioria dos estudos relacionados acima9consegue identificar uma relação direta entre o percentual de positividade da expressão destes marcadores com a gravidade da doença, entretanto tem dificuldade de encontrar um padrão absoluto e 100% reprodutível que possa identificar a gravidade das lesões9. Talvez esta subjetividade possa ser encarada como um fator limitante da utilização desta tecnologia.

Autores americanos17 encontraram percentual de positividade de 100% na expressão do p16 em lesões intraepiteliais de alto grau, porém correlacionou essa positividade com a presença de HPV de alto risco oncogênico, mostrando uma forte associação entre positividade difusa e forte e lesões por HPV de alto risco17.

Neste mesmo estudo17, encontraram na expressão do p16 positividade difusa em 70,2% dos casos de lesão de alto grau e 37,5% das lesões de baixo grau e que 84,8% da positividade difusa do p16 esteve relacionada à presença de HPV de alto risco oncogênico17.

No presente estudo, pôde-se ver a positividade maior do p16 nas pacientes cuja evolução da NIC 3 foi desfavorável, o que pode correlacionar-se com o tipo de HPV, uma vez que tipos diferentes de HPV podem apresentar graus diferentes de imunoexpressão, mas isto foi uma limitação dessa pesquisa, pois não foi genotipado o HPV no presente estudo.

Comparando os dois grupos ora estudados, não se evidenciou diferença significante na positividade do p16 entre o grupo controle e estudo, porém a positividade comparativa nos dois grupos, no mesmo grau de NIC foi maior no grupo estudo; e 61% dos casos com positividade forte e difusa estavam no grupo com evolução desfavorável, sugerindo uma tendência desta situação e que um estudo com maior número de casos talvez possa confirmar esse padrão de marcação do p16 como próprio de evolução desfavorável e/ou infecção transformante por HPV de alto risco.

Um estudo desenvolvido na Costa Rica, generalizando seus dados para uma coorte de 10.000 mulheres, encontrou um valor preditivo positivo de 13,9% do p16 nas NIC 3 e um valor preditivo negativo de 100%, concluindo que estudos futuros ainda são necessários para avaliar quando o manejo clínico deve ser modificado, baseado nos resultados da positividade do p1622.

Uma meta-análise, em 2006, pondera que nos últimos anos, o p16 tem sido extensivamente estudado como auxílio diagnóstico em vários cenários da doença ginecológica. Assim, como muitos marcadores, o p16 não é 100% sensível e específico para todas as lesões. Entretanto, há muitas áreas em que indubitavelmente se reconhece seu valor, frequentemente em combinação com outros marcadores, o que inclui a identificação de lesões de alto grau focal do colo uterino e a separação de lesões de alto grau de lesões benignas, mimetizando o alto grau10.

Outra meta-análise mais recente, concluiu que apesar das boas evidências da correlação da gravidade infecção pelo HPV com a positividade do p16, sua reprodutibilidade ainda é insuficiente para padronizá-lo na prática clínica9.

Avaliando-se os dados encontrados de positividade do p53 no presente estudo, quando se avalia sua expressão no grupo controle e no grupo estudo, não se encontrou nenhum padrão mais frequente de positividade na análise quantitativa do imunomarcador, reforçando a ideia de melhor valor preditivo negativo que positivo desse imunomarcador, demonstrando que quando o marcador é negativo a chance de ocorrer evolução desfavorável da NIC pós-conização é muito pequena, mas quando é positivo, não se pode prever a sua evolução, a não ser pelo seguimento clínico.

Estudando as lesões intraepiteliais de baixo grau e correlacionado com o tipo de HPV presente, alguns autores11 concluíram que a expressão do p53 em lesões de baixo grau aumenta progressivamente em infecções por HPV de baixo risco oncogênico e se expressa menos, proporcionalmente, em infecções por HPV de intermediário e alto risco oncogênico, fato que pode estar relacionado às diferentes funções da proteína E6 conforme o tipo de HPV e a degradação da p5311.

Outros pesquisadores19,32 não conseguiram identificar um padrão de expressão do p53 gradualmente maior quanto maior a gravidade da doença, concluindo, por seus dados, que alterações na p53 exercem um importante papel na patogênese do carcinoma escamoso cervical, porém a expressão do p53 não é suficiente para concluir sobre a carcinogênese cervical19.

De maneira semelhante ao nosso estudo, três outros estudos12,25,30 avaliaram simultaneamente a positividade do p16 e do p53 nas lesões cervicais HPV-induzidas, entretanto, avaliaram o aumento da positividade dos marcadores com a gravidade da NIC, mas não com a possibilidade de recorrência.

Levando em consideração todos esses dados, ao que parece, a expressão tanto do p16 quanto do p53, em biópsias de conização, evidenciam fortemente a relação de gravidade da infecção do HPV com o desenvolvimento da neoplasia intraepitelial cervical, mas não podem ser considerados marcadores capazes de prever a recorrência da doença após tratamento por conização.

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Fonte de financiamento: nenhuma.

Recebido: 16 de Setembro de 2015; Aceito: 08 de Dezembro de 2015

Endereço para correspondência:Fernanda Villar Fonseca E-mail: fvffonseca74@gmail.com

Conflito de interesse: nenhum.

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