Avaliação da Atividade Proliferativa no Epitélio Mamário Adjacente a Fibroadenoma em Mulheres Tratadas com Tamoxifeno

Evaluation of Proliferative Activity in the Mammary Epithelium Adjacent to Fibroadenoma in Women Treated with Tamoxifen

Resumos

Objetivo: estudar a atividade proliferativa do epitélio mamário normal adjacente a fibroadenoma em mulheres na fase lútea do ciclo menstrual, tratadas com tamoxifeno. Pacientes e Métodos: estudou-se por técnica imuno-histoquímica, com o uso do anticorpo monoclonal MIB-1, a atividade proliferativa no epitélio mamário adjacente a fibroadenoma. O estudo foi randomizado e duplo-cego. As 44 mulheres com fibroadenoma foram divididas em 3 grupos: A (n = 16; placebo), B (n = 15; tamoxifeno, 10 mg) e C (n = 13; tamoxifeno, 20 mg). O tamoxifeno foi utilizado por 22 dias, a partir do 2º dia do ciclo menstrual, e a biópsia realizada no 23º dia. Resultados: a porcentagem média de núcleos corados por 1000 células no grupo A foi 9,2, no grupo B, 4,5, e no grupo C, 3,2. O teste de Fisher revelou que o tamoxifeno reduziu de forma significante a imunoexpressão do MIB-1 nas doses de 10 e 20 mg em comparação com o grupo placebo (p<0,0001) e não houve variação significante da atividade proliferativa nas doses de 10 e 20 mg de tamoxifeno (p = 0,21). Conclusão: conclui-se que o tamoxifeno reduziu de forma significante a atividade proliferativa do epitélio mamário, nas doses de 10 e 20 mg/dia.

Mama; Fibroadenoma; Marcadores tumorais; Imuno-histoquímica; Proliferação celular; Antiestrógenos

Trabalhos Originais

Avaliação da Atividade Proliferativa no Epitélio Mamário Adjacente a Fibroadenoma em Mulheres Tratadas com Tamoxifeno

Evaluation of Proliferative Activity in the Mammary Epithelium Adjacent to Fibroadenoma in Women Treated with Tamoxifen

Juarez Antônio de Sousa, Maria Teresa de Seixas, Geraldo Rodrigues de Lima, Edmund Chada Baracat, Luiz Henrique Gebrim

RESUMO

Objetivo: estudar a atividade proliferativa do epitélio mamário normal adjacente a fibroadenoma em mulheres na fase lútea do ciclo menstrual, tratadas com tamoxifeno.

Pacientes e Métodos: estudou-se por técnica imuno-histoquímica, com o uso do anticorpo monoclonal MIB-1, a atividade proliferativa no epitélio mamário adjacente a fibroadenoma. O estudo foi randomizado e duplo-cego. As 44 mulheres com fibroadenoma foram divididas em 3 grupos: A (n = 16; placebo), B (n = 15; tamoxifeno, 10 mg) e C (n = 13; tamoxifeno, 20 mg). O tamoxifeno foi utilizado por 22 dias, a partir do 2^o dia do ciclo menstrual, e a biópsia realizada no 23^o dia.

Resultados: a porcentagem média de núcleos corados por 1000 células no grupo A foi 9,2, no grupo B, 4,5, e no grupo C, 3,2. O teste de Fisher revelou que o tamoxifeno reduziu de forma significante a imunoexpressão do MIB-1 nas doses de 10 e 20 mg em comparação com o grupo placebo (p<0,0001) e não houve variação significante da atividade proliferativa nas doses de 10 e 20 mg de tamoxifeno (p = 0,21).

Conclusão: conclui-se que o tamoxifeno reduziu de forma significante a atividade proliferativa do epitélio mamário, nas doses de 10 e 20 mg/dia.

PALAVRAS-CHAVE: Mama: doença benigna. Fibroadenoma. Marcadores tumorais. Imuno-histoquímica. Proliferação celular. Antiestrógenos.

Introdução

A quimioprofilaxia do carcinoma de mama com tamoxifeno em mulheres de alto risco vem apresentando resultados animadores^1-3. Entretanto, pouco se sabe a respeito dos efeitos da droga no tecido mamário normal, tanto na dose usual empregada no tratamento adjuvante do câncer de mama, como em doses menores. O tamoxifeno, droga antiestrogênica não esteroídica, é um isômero trans, derivado trifeniletilênico com efeito antiestrogênico e agonista parcial dos estrogênios, facilmente absorvido por via oral na forma do sal citrato. É metabolizado pelo citocromo P450 no sistema microssomal hepático, resultando em vários metabólitos^4-6.

O tamoxifeno e seus similares atuam de modo complexo como antagonistas estrogênicos nas células normais e malignas da mama, e agonistas estrogênicos em outros tecidos do corpo, como ossos, útero e sistema cardiovascular. A atuação da droga é mediada pelos receptores estrogênicos celulares por meio de várias reações complexas^7-11.

A proliferação celular pode ser estudada por vários métodos, como: figuras de mitose, citometria de fluxo, índice de incorporação de timidina, bromodeoxiuridina e por vários marcadores de proliferação, empregando-se métodos imuno-histoquímicos.

O MIB-1 é um anticorpo largamente utilizado no estudo da proliferação celular, que reage com uma proteína (antígeno) nuclear não-histona, composta por dupla banda com aparente peso molecular de 395 e 345 kDa, regulado por um gene localizado no cromossoma 10^12-18.

Poucos são os estudos avaliando a presença deste marcador de proliferação na mama normal, apesar de ser um método bem demonstrado e com valor prognóstico em câncer mamário. Quanto à avaliação da proliferação no epitélio mamário normal, Ribeiro¹⁸ estudou quantitativamente a imunoexpressão do MIB-1 no epitélio mamário, observando uma maior expressão do indicador de proliferação na fase lútea do ciclo menstrual¹⁸.

Pacientes e Métodos

Foram incluídas no estudo 44 pacientes, com idade entre 15 e 45 anos, submetidas a exérese de fibroadenomas no ambulatório de Mastologia do Hospital São Paulo, da Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina (UNIFESP-EPM). O estudo foi prospectivo tipo caso-controle e duplo-cego.

Fizeram parte do estudo mulheres com nódulos sugestivos de fibroadenoma. Além da obtenção da história clínica, todas as mulheres foram submetidas ao exame físico, ultra-sonografia das mamas e PAAF (punção aspirativa por agulha fina), e aquelas com 35 anos ou mais, à mamografia antes da retirada do nódulo, com o intuito de descartar a presença de carcinoma. As pacientes foram distribuídas em três grupos de pesquisa por randomização.

As pacientes do grupo A (n = 16) fizeram uso de um placebo (lactose). No grupo B (n = 15) foi empregado 10 mg/dia de tamoxifeno e no grupo C (n = 13), 20 mg/dia da mesma droga. As pacientes iniciaram o medicamento no 2^o dia do ciclo menstrual, por 22 dias. As cirurgias foram executadas no ambulatório, no 23^o dia do ciclo. Os espécimes de tecido, considerado epitélio normal, foram retirados a pelo menos 1,0 cm do fibroadenoma, não apresentando alterações histopatológicas¹⁹.

O nódulo e o tecido adjacente foram fixados em formol a 10% tamponado por 24 horas, fixados em parafina e seccionados em cortes de 4 micrômetros e corados pela hematoxilina e eosina (HE), para confirmar o diagnóstico de fibroadenoma e a normalidade do tecido adjacente. Foram excluídas as pacientes com alterações fibrocísticas ou inflamatórias.

A expressão do MIB-1 foi quantificada pela técnica imuno-histoquímica da estrepto-avidina-biotina-peroxidase para o anticorpo monoclonal Ki-67, clone MIB-1 (Imunotech, catálogo N^o 0505, lote 001). As lâminas foram desparafinizadas com xilol quente a 60^oC por 15 minutos e em temperatura ambiente por mais 15. Os cortes histológicos foram então hidratados em concentrações decrescentes de álcool (100, 95, 80 e 70%) por 30 segundos cada e lavados em água corrente e destilada²⁰.

A seguir foi feita a recuperação antigênica pelo calor úmido (panela de pressão a 100^oC), mergulhando-se as lâminas em solução tampão de citrato de sódio 10 mM, pH 6,0, durante 5 minutos.

Posteriormente, foram resfriados em temperatura ambiente e lavados em água corrente. O bloqueio da peroxidase endógena foi feito com água oxigenada a 0,3% (diluída em metanol) em três banhos de 5 minutos cada. A seguir foi feita lavagem em água corrente, destilada e em tampão PBS (solução salina tamponada com fosfato 0,01 M e pH entre 7,4 e 7,6).

Seqüencialmente, realizou-se a incubação com o anticorpo monoclonal primário Ki-67 (clone MIB-1) da Imunotech na diluição 1/30 em BSA (albumina sérica bovina a 1%), durante uma noite, a 4^oC, seguida de lavagem em solução PBS.

Seguiu-se incubação com kit (Dako) strepto ABcomplex/HRP duet, Mouse/Rabbit, código K492, na diluição recomendada, por 30 minutos, seguida de nova lavagem em solução PBS.

O próximo passo foi revelar a reação com o substrato cromógeno 3-3' diaminobenzidina (DAB) (0,06 g de DAB e 1 ml de H₂O₂ 20 volumes) por 3 a 5 minutos a 37^oC, ao abrigo da luz. Foi observada ao microscópio a formação do precipitado castanho escuro, quando foi feita a lavagem com água corrente e destilada.

Procederam-se, a seguir, a contracoloração com hematoxilina de Harris por 1 minuto e, depois, imersão das lâminas em água amoniacal e lavagem em água corrente e destilada.

Posteriormente, foi realizada a desidratação em concentrações crescentes de álcool (70, 80, 95 e 100%) por 3 vezes, por 1 minuto cada, diafanização em 3 banhos de xilol, 1 minuto cada, e montagem da lâmina e lamínula com bálsamo (Entellan^®).

A Figura 1 é uma fotomicrografia de corte histopatológico do epitélio mamário corado pelo MIB-1 do grupo A (placebo), mostrando alta expressão de núcleos com coloração acastanhada característica. A Figura 2 mostra o epitélio adjacente de uma paciente do grupo B (tamoxifeno 10 mg), evidenciando uma baixa expressão, o que também pode ser observado na Figura 3, grupo C (tamoxifeno 20 mg).

A imunoexpressão do Ki-67 (MIB-1) foi avaliada contando-se no mínimo 1000 células. Foi avaliado somente o elemento epitelial da amostra, excluindo-se o estroma¹². Para a contagem foi utilizado o sistema de análise digital de imagem "Image-Pro^® Plus version 3.0 for Windows^TM", desenvolvido pela Media Cybernetics, L.P., constituído por um microscópio Olympus BX 40, acoplado a uma videocâmera colorida Sony, modelo CCD-IRIS, que transmite a imagem a um microcomputador Pentium MMX 233 MHz, com 64 megabites de memória RAM.

O teste de Levene foi utilizado para avaliar a homogeneidade entre os grupos A, B e C em relação às variáveis de controle (idade, menarca, número de partos, lactação e índice de massa corpórea)²¹.

A análise de variância foi utilizada para verificar a igualdade das médias de expressão do MIB-1 nos grupos A, B e C. Posteriormente, foi aplicado o teste de comparações múltiplas de Fisher, objetivando encontrar diferenças de expressão do MIB-1 entre os grupos A, B e C^21,22.

Em todos os testes fixou-se em 0,05 ou 5% (a<5%) o nível de rejeição da hipótese de nulidade.

Resultados:

A porcentagem média de núcleos corados no grupo A (placebo) foi 9,2, com erro padrão (Ep) de 1,4. No grupo B (tamoxifeno 10 mg), a média foi 4,5 (Ep = 0,8) e no grupo C (tamoxifeno 20 mg), a porcentagem média foi 3,2 (Ep = 0,6) (Tabela 1).

O tamoxifeno reduziu de forma significante a imunoexpressão do MIB-1 no epitélio mamário adjacente ao fibroadenoma, nas doses de 10 e 20 mg em comparação com o grupo placebo p<0,0001 (Tabela 1, Figura 4).

Os grupos B e C foram considerados semelhantes em relação à imunoexpressão do MIB-1, não havendo, portanto, diferenças com o emprego de 10 ou 20 mg de tamoxifeno (p = 0,21).

Os grupos A, B e C foram considerados homogêneos em relação às seguintes variáveis de controle: idade A = 23, B = 27, C = 24, p = 0,380; menarca: A = 12, B = 12, C = 13, p = 0,744; paridade: A = 1, B = 1, C = 1, p = 0,495; amamentação em meses: A = 3, B = 8, C = 3, p = 0,177; índice de massa corpórea: A = 22, B = 22, C = 21, p = 0,765.

Discussão

A atividade proliferativa do epitélio mamário tem sido alvo de vários estudos. A avaliação de figuras de mitose, largamente utilizada, é pouco sensível, pois a mitose possui curta duração e reflete apenas a fase final do ciclo celular^23-28. A escolha do MIB-1, produzido de partes recombinantes do Ki-67, como marcador de proliferação, foi devida à sua expressão nas fases G1, S, G2 e M do ciclo celular e ausência em GO^13,14,29-31.

A avaliação do índice de proliferação celular com o emprego do anticorpo monoclonal MIB-1 possui valor prognóstico no carcinoma^1,4,12,21,22. Mas poucos são os estudos empregando o MIB-1 em epitélio mamário humano normal³². O tecido mamário adjacente ao fibroadenoma sofre pouca influência do fibroadenoma, que é uma neoplasia benigna autolimitada que não induz angiogênese^33,34.

Estudando-se os diferentes campos selecionados na contagem das células coradas pelo marcador, notou-se grande variabilidade na atividade proliferativa dos lóbulos. A explicação para a redução da proliferação celular pode ser fundamentada no efeito celular modulador atuando nos receptores b de estrogênio do lóbulo mamário, reduzindo a proliferação^9,35, promovendo down regulation nos receptores alfa, caracterizando um efeito agonista parcial do estrogênio^9,35.

Conclui-se que o tamoxifeno reduziu de forma significante a expressão do MIB-1 no epitélio normal adjacente ao fibroadenoma, tanto nas doses de 10 como de 20 mg de tamoxifeno. Esses resultados poderão contribuir para que estudos clínicos e moleculares possam elucidar melhor os efeitos da droga no lóbulo mamário normal na pré-menopausa e uma possível redução na dose quando utilizada na quimioprofilaxia do câncer.

SUMMARY

Purpose: to study the monoclonal antibody MIB-1 in the normal breast epithelium adjacent to a fibroadenoma in women in the luteal phase of the menstrual cycle treated with tamoxifen.

Patients and methods: the proliferative activity of the mammary epithelium adjacent to the fibroadenoma was studied by immunohistochemistry based on immunoexpression of the monoclonal antibody MIB-1. The study was randomized and double blind and was conducted on 44 women with fibroadenomas, divided into 3 groups: A (n = 16; placebo), B (n = 15; tamoxifen, 10 mg), and C (n = 13; tamoxifen, 20 mg). Tamoxifen was administered for 22 days starting on the 2nd day of the menstrual cycle and a biopsy was taken on the 23rd day.

Results: the mean percentage of stained nuclei per 1000 cells was 9.2 in group A, 4.5 in group B, and 3.2 in group C. Fisher's test revealed that tamoxifen significantly reduced the immunoexpression of MIB-1 at the doses of 10 and 20 mg compared to the placebo group (p<0.0001), with no significant differences between doses in terms of proliferative activity (p = 0.21).

Conclusion: we conclude that tamoxifen significantly reduced the proliferative activity of the mammary epithelium at the doses of 10 and 20 mg/day.

KEY WORDS: Breast: benign diseases. Fibroadenoma. Tumoral markers. Immunohistochemistry. Antiestrogens.

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Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo - São Paulo, Brasil.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  06 Out 2003
• Data do Fascículo
  Ago 2000