Tipagem e estado físico de papilomavírus humano por hibridização in situ em lesões intra-epiteliais do colo uterino

Human papillomavirus typing and physical state by in situ hybridization in uterine cervix intraepithelial lesions

TRABALHOS ORIGINAIS

Tipagem e estado físico de papilomavírus humano por hibridização in situ em lesões intra-epiteliais do colo uterino

Human papillomavirus typing and physical state by in situ hybridization in uterine cervix intraepithelial lesions

Lúcia Buchalla Bagarelli; Antonio Hélio Oliani

Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP)

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

OBJETIVO: realizar estudo molecular (hibridização in situ) de pacientes com lesões intra-epiteliais do colo uterino, visando investigar a freqüência e o estado físico do papilomavírus humano (HPV).

MÉTODOS: cortes histológicos de biopsias do colo uterino de 84 pacientes foram avaliados pela hibridização in situ, com sonda de amplo espectro, que permite identificação dos HPVs dos tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 42, 45 e 56, e com sondas específicas para HPV dos tipos 6, 11, 16, 18, 31 e 33. Os padrões físicos de marcação do DNA dos HPV encontrados foram: epissomal, quando todo o núcleo ficou corado pela biotina (marrom); integrado, onde se visualizaram um ou dois pontos marrons no núcleo hibridizado, ou misto, com a associação dos dois padrões anteriores. Das 84 pacientes avaliadas, 31 (36,9%) tinham lesões intra-epiteliais de baixo grau (LIE-BG) e 53 (63,1%) tinham lesões intra-epiteliais de alto grau (LIE-AG) ao exame histológico. Para a análise estatística foi empregado o teste exato de Fisher.

RESULTADOS: do total dos casos, 46 (54,7%) foram positivos para DNA de HPV pela sonda de amplo espectro. Na tipagem dos vírus, o HPV-16 foi mais freqüente nas LIE-AG, com 12 casos – 22,6% (p<0,05). As freqüências dos outros tipos de HPV não foram diferentes entre os casos com LIE-BG e LIE-AG. Na avaliação do estado físico do DNA de HPV, os percentuais de padrões epissomais (mais comum nas LIE-BG) e integrados não foram diferentes entre os dois grupos. Houve predomínio do tipo misto nas LIE-AG em relação às LIE-BG: 26,4% e 3,2%, respectivamente (p<0,01). O estado físico do DNA do HPV, integrado ao da célula hospedeira, foi mais freqüente nos casos mais graves.

CONCLUSÕES: o HPV-16 foi o mais freqüente nas LIE-AG. As freqüências dos outros tipos de HPV não foram diferentes quando se compararam os casos com LIE-BG e LIE-AG. O estado físico do DNA do HPV, integrado ao da célula hospedeira, foi mais freqüente nos casos mais graves.

Palavras-Chave: Papilomavírus humano. Colo do útero: lesões pré-neoplásicas. Hibridização in situ.

ABSTRACT

PURPOSE: to carry out a molecular study (in situ hybridization) on patients who present intraepithelial lesions of the uterine cervix, and to assess the frequency and the physical state of the human papillomavirus (HPV).

METHODS: histological sections of biopsies of the uterine cervix from 84 patients were evaluated by in situ hybridization, with a broad-spectrum probe, which allows the identification of the HPV types 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 42, 45, and 56 and with specific probes for HPV types 6, 11, 16, 18, 31, and 33. The physical patterns of HPV DNA found were: episomal, when the entire nucleus stains with biotin (brown); integrated – one or two brown points in the hybridized nucleus, or mixed, associating both patterns. Of the 84 patients evaluated, 31 (36.9%) had low-grade squamous intraepithelial lesions (LSIL), and 53 (63.1%) had high-grade squamous intraepithelial lesions (HSIL) on histological examination. Fisher's exact test was used for the statistical analysis.

RESULTS: considering all the cases, 46 (54.7%) were positive for HPV DNA with the broad-spectrum probe. Regarding typing, HPV-16 was the most frequent in HSIL (12 cases – 22.6% - p<0.05). The frequencies of the other HPV types did not show statistically significant differences between the LSIL and HSIL cases. By physical condition assessment of the HPV DNA, the percentage of the episomal (most common in LSIL) and integrated patterns showed no significant differences between the two groups; the mixed HSIL type prevailed when compared to LSIL: 26.4 and 3.2%, respectively (p<0.01). The physical condition of the HPV DNA, integrated in the host cell, was more frequent in the most severe cases.

CONCLUSIONS: HPV-16 was the most frequent in HSIL cases. The frequencies of the other HPV types did not show statistically significant differences between the LSIL and HSIL cases. The physical condition of the HPV DNA, integrated in the host cell, was more frequent in the more severe cases.

Keywords: Human papillomavirus. HPV. Cervix: intraepithelial lesion. In situ hybridization.

Introdução

Atualmente, a associação da infecção pelo papilomavírus humano (HPV) com lesões intra-epiteliais de colo, vagina e vulva e com carcinomas escamosos invasores é fato amplamente aceito^1-3. Dos mais de 100 tipos de HPV existentes, aproximadamente 40 afetam o trato genital humano, e destes, 10 a 15 estão associados à carcinogênese cervical. Os HPVs de baixo risco (6, 11, 30, 42, 43 e 44) são encontrados em lesões intra-epiteliais de baixo grau (LIE-BG). Os HPVs de médio risco (31, 33, 35, 39, 51, 52, 58 e 61) são mais encontrados em lesões intra-epiteliais de alto grau (LIE-AG) e, com menor freqüência, em cânceres. Os HPVs de alto risco (16, 18, 45 e 56) são encontrados em LIE-AG e em cânceres cervicais que se apresentam sempre como lesões monoclonais^4,5.

Quando o HPV infecta a célula, pode ser eliminado, ficar latente ou produzir infecção clínica ou subclínica ativa (DNA viral não integrado - epissomal) ou, ainda, integrar seu genoma ao da célula hospedeira imatura, impedindo a diferenciação e maturação celular. A célula transformada não produz mais o vírus, porém, contém o DNA viral^1,3,5. Segundo zur Hausen¹, a integração do genoma viral ao da célula hospedeira deve-se à ação de cocarcinogênios iniciantes ou promotores (genéticos, químicos, imunológicos, infecciosos). Infecção persistente por 10 a 20 anos permite o desenvolvimento de alterações genéticas adicionais e progressão de lesões de baixo, moderado e alto grau para câncer invasor⁵.

O tipo de HPV, a carga viral e a detecção persistente do HPV são marcadores importantes para o risco de progressão para o câncer invasor. Lesões causadas por HPV-16 têm risco cinco vezes maior para progredir em comparação com lesões causadas por outros tipos oncogênicos de HPV^3,6. Brisson et al.⁶ referem risco relativo oito vezes maior para LIE-AG provocadas pelo HPV-16.

A hibridização in situ (HIS) detecta seqüências específicas de DNA ou RNA, utilizando-se seqüência complementar de ácidos nucléicos (sonda) marcada radioativa ou quimicamente. Métodos mais recentes de amplificação dos sinais de detecção utilizando a deposição de catalisador nos sítios de hibridização com deposição de tiramida biotinilada no tecido^7,8 aumentaram a sensibilidade da HIS, sendo possível detectar até uma única cópia viral por célula e permitindo a avaliação do estado físico (epissomal ou integrado ao genoma do hospedeiro) do HPV. A HIS também possibilita estabelecer a correlação com os aspectos histopatológicos^7,8.

Em vista da importante participação do HPV na carcinogênese cervical, propusemo-nos a realizar estudo por HIS de lesões intra-epiteliais do colo uterino, com o objetivo de avaliar a freqüência, tipos mais freqüentes e o estado físico do DNA do HPV em pacientes atendidas em nosso serviço.

Pacientes e Métodos

Foram incluídas, prospectivamente, 84 pacientes atendidas no Serviço de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital de Base da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP), no período de novembro de 1996 a novembro de 2002. Estas pacientes foram encaminhadas para colposcopia e biopsia do colo uterino devido a alterações em seus exames colpocitológicos. Após os resultados anatomopatológicos das biopsias, as pacientes foram divididas em dois grupos de estudo: pacientes com lesão intra-epitelial de baixo grau (NIC-I) - 31 casos (36,9 %), e com lesão intra-epitelial de alto grau (NIC-II e NIC-III) - 53 casos (63,1%).

O estudo de HIS para DNA de HPV foi realizado com uso do sistema Dako Genpoint. Tal técnica consiste na detecção, em cortes histológicos de material fixado em formol, de pequenos segmentos de DNA a partir de sondas específicas, que são seqüências de nucleotídeos complementares desenvolvidos a partir de segmentos conhecidos do DNA ou RNA que se deseja identificar. Cada sonda hibridiza uma região de 7,9 quilobases de pares de DNA. Nesta HIS, as sondas estavam associadas a moléculas sinalizadoras não isotópicas biotiniladas e os sítios de ligação, no núcleo das células, puderam ser localizados por reações de imuno-histoquímica, nas quais a enzima reagiu com um substrato cromógeno (diaminobenzidina), que permitiu a vizualização da reação pela coloração marrom ao microscópio óptico. A contracoloração foi feita com hematoxilina.

Considerou-se HIS positiva quando, aproximadamente, 25% das células apresentaram-se coradas com a biotina. Os padrões físicos de marcação do DNA do HPV foram: difuso ou epissomal, quando todo o núcleo ficou marrom (significa que o DNA do HPV não encontrava-se incorporado ao DNA da célula hospedeira); integrado ou em ponto, quando se visualizaram um ou dois pontos marrons por núcleo hibridizado (significa que houve integração do DNA do HPV ao da célula hospedeira), ou misto, com a associação dos dois anteriores (v. Figura 1).

Utilizamos sonda de amplo espectro, que permite a identificação de 11 tipos de DNA de HPV (6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 42, 45 e 56), e sondas específicas para HPV 6, 11, 16, 18, 31 e 33 para cada caso do estudo. Todos os procedimentos foram acompanhados por controles de células positivos e negativos. Os controles positivos foram obtidos de linhagem celular de carcinoma cervical SiHa, que contém baixo número de cópias de DNA integrado (uma ou duas) do HPV-16 por célula⁷.

Para análise estatística foi empregado o teste exato de Fisher para proporções. Foram estimados percentuais e médias na forma pontual e por intervalo de 95% de confiança.

Este projeto foi aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP).

Resultados

Dos 84 casos, 46 (54,8%) foram considerados positivos pela HIS com a sonda de amplo espectro, sendo 13 casos (41,9%) de LIE-BG e 33 casos (62,3%) de LIE-AG (Tabela 1).

Os casos com resultado positivo pela sonda de amplo espectro e negativos na tipagem viral foram classificados como HPV de outro tipo. Estes foram os mais freqüentes nos grupos de estudo, tendo aparecido em 11 casos (20,7%) nas LIE-AG e 4 casos (12,9%) nas LIE-BG, porém sem diferença significante. O HPV-16 foi mais freqüente nas LIE-AG: 12 casos (22,6%) nas LIE-AG e um (3,2%) nas LIE-BG (p<0,05). Outros tipos de HPV apareceram em menor número de casos e não houve diferenças significantes entre os grupos de estudo (Tabela 2).

Na avaliação do estado físico do DNA do HPV, do total de 84 pacientes, encontramos: 15 casos (17,9%) com padrão misto de DNA de HPV, sendo um (3,2%) nas LIE-BG e 14 (26,4%) nas LIE-AG (p<0,01). Nove casos (10,7%) apresentaram padrão epissomal, sendo 4 (12,9%) nas LIE-BG e 5 (9,4%) nas LIE-AG. Vinte e dois casos (26,2%) tinham DNA de HPV integrados sendo 8 (25,8%) nas LIE-BG e 14 (26,4%) nas LIE-AG (Tabela 3). Considerando apenas os casos positivos, do total de 46 pacientes, encontramos 15 casos (32,6%) com padrão misto de DNA de HPV, sendo um (7,7%) nas LIE-BG e 14 (42,4%) nas LIE-AG. Nove casos (19,6%) apresentaram padrão epissomal, sendo 4 (30,8%) nas LIE-BG e 5 (15,2%) nas LIE-AG. Vinte e dois casos (47,8%) tinham DNA de HPV integrado, sendo 8 (61,5%) nas LIE-BG e 14 (42,4%) nas LIE-AG.

Os núcleos com DNA de HPV em forma epissomal foram mais encontrados nos coilócitos e nas camadas mais superficiais do epitélio. Já os padrões integrados foram encontrados com maior freqüência nas áreas mais profundas e com atipias celulares.

A Figura 1 mostra os padrões físicos do DNA do HPV em cortes histológicos de lesões intra-epiteliais do colo uterino.

Discussão

A HIS é considerada método de boa especificidade, porém de baixa sensibilidade. Segundo Tyring³, a sensibilidade da HIS permite a detecção de 10.000 cópias de HPV por célula. No entanto, a sensibilidade difere de acordo com a técnica utilizada. Técnicas mais recentes, como a utilizada neste estudo, permitem a amplificação dos sinais de detecção, aumentando a sensibilidade em cerca de cem mil vezes, sendo possível a detecção de apenas uma cópia viral por célula⁸.

Observamos que 54,8% dos casos eram positivos pela HIS. Este percentual é mais alto do que o encontrado por Melchers et al.⁹ (46%) e inferior ao de Gómez et al.¹⁰ (69%) e de Lörincz et al.¹¹ (79,3%), sendo que este último incluiu, além das LIE, carcinomas escamosos do colo.

Entre os casos com LIE-BG, 41,9% eram positivos para HPV. Este resultado é próximo ao mencionado por Anderson et al.¹² (52%) e abaixo do encontrado por Nuovo et al.¹³ (72%), Richart e Nuovo¹⁴ (91%), Gómez et al.¹⁰ (65,4%) e Cavalcanti et al.¹⁵ (85,6%). A baixa sensibilidade da HIS explica os baixos percentuais encontrados por nós nas LIE-BG, sabidamente causadas por HPV, nas quais o padrão epissomal de DNA de HPV deveria ter sido detectado mais vezes.

Entre os casos com LIE-AG, 62,3% eram positivos, cifra pouco inferior à encontrada por Fallani et al.¹⁶ (80%), Gómez et al.¹⁰ (78,4%) e Anderson et al. ¹² (67%).

Na tipagem dos vírus, observamos maior freqüência de HPV-16 no grupo das LIE-AG, o que esteve de acordo com a maioria dos estudos^11,13,15,16. Os outros tipos de HPV estiveram presentes em proporções semelhantes nos grupos de estudo. O HPV tipo 18 apareceu nos dois grupos de estudo, geralmente em área de displasia dentro de glândulas endocervicais que sofreram metaplasia escamosa. Este achado também esteve de acordo com outros estudos que mostraram predileção do HPV-18 pelo tecido glandular. O HPV-11 não foi detectado, o que é surpreendente, pois esperava-se encontrá-lo em casos de LIE-BG. Tal fato, talvez, deva-se aos pequenos números da amostra estudada, além da baixa sensibilidade do método.

Encontramos as três formas de estado físico do HPV. O epissomal predominou no grupo de pacientes com LIE-BG, porém a diferença não foi significante. Os casos com padrão integrado de DNA de HPV foram encontrados nos dois grupos em porcentagens semelhantes, já o padrão misto foi mais freqüente nos casos de LIE-AG. Assim como nós, Durst et al.¹⁷, Nagai et al.¹⁸, Skyldberg et al.¹⁹, Gómez et al.¹⁰ e Pirami et al.²⁰ observaram maior freqüência de DNA de HPV epissomal nos coilócitos e nas camadas mais superficiais do epitélio, e integrado, nas áreas mais profundas e com atipias celulares.

Considerando somente os casos positivos, os padrões integrados (somados os isolados e os mistos) foram observados nas LIE-BG em 69,2% e nas LIE-AG em 84,8% dos casos. Gómez et al.¹⁰ e Pirami et al.²⁰ também observaram maior freqüência de integração do DNA do HPV nas LIE-AG, o que reforça a noção de que a integração seja fator de risco para a progressão da lesão.

Quando relacionamos o tipo de HPV com o achado histopatológico, encontramos a maior porcentagem de HPV-16 nos casos mais graves (92% nas LIE-AG). No caso do HPV-18, encontramos 62% deles nas LIE-AG, o que reforça a noção, já bem divulgada em vários estudos, de seu potencial oncogênico como tipo de alto risco, junto com o HPV-16. Os HPVs de médio risco (31 e 33) também foram mais freqüentes nas LIE-AG e o HPV-6 apareceu apenas em três casos, todos nos coilócitos superficiais, em estado epissomal, já que é HPV de baixo risco. Estes achados estiveram de acordo com os de vários autores^{11,12,16,18,21-24}.

A identificação de DNA de HPV de alto risco (principalmente HPV-16 e 18) permite a seleção daquelas mulheres com real risco de câncer cervical. Diante de paciente com diagnóstico suspeito de HPV pelos métodos tradicionais, a realização de exames de hibridização molecular poderia auxiliar no diagnóstico, principalmente para o reconhecimento de HPVs do grupo de alto risco²⁵. Esses testes têm valor, também, para seguimento após tratamento e para o prognóstico dos casos. Devido à baixa sensibilidade da HIS, ela tem sido substituída pela captura híbrida, que permite detectar o tipo de HPV e sua carga viral.

Concluímos que, na comparação entre os grupos, pacientes portadoras de LIE-AG apresentaram, com maior freqüência, o HPV-16, assim como o padrão misto (epissomal e integrado juntos) de DNA do HPV. Apesar da boa especificidade, a HIS mostrou-se método de baixa sensibilidade neste estudo. Sempre que possível, deverá ser substituído por outro mais sensível.

Agradecimentos

Aos Prof. Dr. José Focchi, Prof. Dr. Reinaldo Azoubel, Profa. Dra. Sueli Suzigan, Prof. Dr. José Antonio Cordeiro, Profa. Marli Nogaroto e Profa. Vera Lúcia Buchalla, pelos auxílios para a realização deste estudo.

Recebido em: 19/5/2003

Aceito com modificações em: 27/11/2003

Estudo financiado pela Bolsa de Auxílio à Pesquisa da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto - FAMERP

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  23 Abr 2004
• Data do Fascículo
  Fev 2004

Histórico

• Aceito
  27 Nov 2003
• Recebido
  19 Maio 2003