Produção de interleucina-10 na gestação reduz a taxa de replicação do HIV-1 em culturas de linfócitos maternos

Interleukin-10 production during pregnancy reduces HIV-1 replicaction in cultures of maternal lymphocytes

Resumos

OBJETIVO: avaliar a proliferação de células T e a produção de citocinas em gestantes infectadas pelo HIV-1 e seu impacto na replicação viral in vitro. MÉTODOS: sangue periférico de 12 gestantes infectadas pelo HIV-1 e de seus neonatos, bem como de 10 gestantes HIV-1 negativas, foi colhido e a quantidade de linfócitos TCD4+ e TCD8+ periféricos foi avaliada por citometria de fluxo. Para obter plasma ou células mononucleares periféricas (PBMC), as amostras foram centrifugadas na ausência ou presença de um gradiente de Ficoll-Hypaque, respectivamente. As PBMC foram mantidas em cultura por sete dias na presença de fito-hemaglutinina mais IL-2 recombinante e a resposta linfoproliferativa de células T foi analisada pelo método de exclusão em azul de Trypan. Em alguns experimentos, as culturas foram mantidas na presença adicional de anticorpo anti-IL-10. Os plasmas e sobrenadantes das culturas de PBMC ativadas foram submetidos à análise da produção de citocinas, pelo método ELISA indireto, e a carga viral, detectada pelo RT-PCR. RESULTADOS: independente da carga viral plasmática, a resposta linfoproliferativa em culturas de células obtidas de gestantes infectadas pelo HIV foi inferior às amostras normais [4,2±0,37 vs 2,4±0,56 (x 10(6)) células/mL; p<0.005]. Tanto em gestantes normais quanto em pacientes com cargas virais baixas, os níveis de IL-10 foram mais elevados que os das gestantes com elevada replicação viral (9.790±3.224 vs 1.256±350 pg/mL; p=0.002). Níveis elevados de TNF-alfa no soro (7.200±2.440 vs 510±476 pg/mL) e nas culturas de células (21.350±15.230 vs 1.256±350 pg/mL) correlacionaram-se à carga viral plasmática elevada e a infecção neonatal. O bloqueio da IL-10 endógena com anticorpos anti-IL-10 aumentou a replicação do HIV-1 em cultura de células. CONCLUSÃO: nossos resultados sugerem que a IL-10 exerce influência negativa na replicação viral, o que provavelmente contribui para reduzir o risco de infecção vertical.

Síndrome da imunodeficiência adquirida; Citocinas; HIV-1; Células Th1; Linfócitos t

PURPOSE: to evaluate T cell proliferation and cytokine production in HIV-1-infected pregnant women and their impact on in vitro virus replication. METHODS: peripheral blood from 12 HIV-1-infected pregnant women and from their neonates was collected. As control, 10 samples from non-infected pregnants were also colleted. The CD4+ and CD8+ T cell counts were assayed by flow cytometry. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and plasma were obtained by centrifugation with and without Ficoll-Hypaque gradient, respectively. The freshly purified PBMC were kept in cultures for seven days with PHA plus r-IL-2, and the lymphoproliferative response was assayed by Trypan blue dye exclusion. In some experiments we added anti-IL-10 monoclonal antibody. The plasma samples and supernatants from cell cultures were stored to determine both peripheral cytokine levels, by ELISA sandwich, and viral load, by RT-PCR. RESULTS: the results showed that the lymphoproliferative response was smaller in cultures obtained from HIV-1-infected women than in control cultures [4.2±0.37 vs 2.4±0.56 (x 10(6) cell/mL), p<0.005]. In both control and infected pregnant women who had low plasma viral load, the level of IL-10 was higher than in those with high viral replication (9.790±3.224 vs 1.256±350 pg/mL, p=0.002). The elevated TNF-alpha production detected in serum (7.200±2.440 pg/mL) and supernatants (21.350±15.230 pg/mL) was associated with higher plasma viral loads and vertical infection. The IL-10 blockade by anti-IL-10 antibodies augmented viral replication in the cell cultures. CONCLUSION: these results indicate that IL-10 production exerts a negative influence on virus replication, diminishing the probability of intrauterine HIV-1 infection.

Aqured immunodeficency; Cytokines; HIV-1; Th1-cells; t Lymphocytes

ARTIGOS ORIGINAIS

Produção de interleucina-10 na gestação reduz a taxa de replicação do HIV-1 em culturas de linfócitos maternos

Interleukin-10 production during pregnancy reduces HIV-1 replicaction in cultures of maternal lymphocytes

Bruno Monção Paolino^I; Odalis Karen Vasquez Araoz^I; Ana Cristina Marques Wing^I; Ana Luíza Furtado da Silva^I; Regina Rocco^II; Catharina Lauria^III; Rodrigo Brindeiro^IV; Cleonice Alves de Melo Bento^V

^IGraduando em Medicina da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO)

^IIObstetra do Hospital Universitário Gaffrée Guinle, Universidade do Rio de Janeiro - UNIRIO - Rio de Janeiro (RJ) - Brasil

^IIIBiomédica do Hospital Universitário Pedro Ernesto/Universidade Estadual do Rio de Janeiro - UERJ - Rio de Janeiro (RJ) - Brasil

^IVProfessor Adjunto, Departamento de Genética / Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ - Rio de Janeiro (RJ) - Brasil

^VProfessora Adjunta, Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Universidade do Rio de Janeiro - UNIRIO - Rio de Janeiro (RJ) - Brasil

RESUMO

OBJETIVO: avaliar a proliferação de células T e a produção de citocinas em gestantes infectadas pelo HIV-1 e seu impacto na replicação viral in vitro.

MÉTODOS: sangue periférico de 12 gestantes infectadas pelo HIV-1 e de seus neonatos, bem como de 10 gestantes HIV-1 negativas, foi colhido e a quantidade de linfócitos TCD4⁺ e TCD8⁺ periféricos foi avaliada por citometria de fluxo. Para obter plasma ou células mononucleares periféricas (PBMC), as amostras foram centrifugadas na ausência ou presença de um gradiente de Ficoll-Hypaque, respectivamente. As PBMC foram mantidas em cultura por sete dias na presença de fito-hemaglutinina mais IL-2 recombinante e a resposta linfoproliferativa de células T foi analisada pelo método de exclusão em azul de Trypan. Em alguns experimentos, as culturas foram mantidas na presença adicional de anticorpo anti-IL-10. Os plasmas e sobrenadantes das culturas de PBMC ativadas foram submetidos à análise da produção de citocinas, pelo método ELISA indireto, e a carga viral, detectada pelo RT-PCR.

RESULTADOS: independente da carga viral plasmática, a resposta linfoproliferativa em culturas de células obtidas de gestantes infectadas pelo HIV foi inferior às amostras normais [4,2±0,37 vs 2,4±0,56 (x 10⁶) células/mL; p<0.005]. Tanto em gestantes normais quanto em pacientes com cargas virais baixas, os níveis de IL-10 foram mais elevados que os das gestantes com elevada replicação viral (9.790±3.224 vs 1.256±350 pg/mL; p=0.002). Níveis elevados de TNF-a no soro (7.200±2.440 vs 510±476 pg/mL) e nas culturas de células (21.350±15.230 vs 1.256±350 pg/mL) correlacionaram-se à carga viral plasmática elevada e a infecção neonatal. O bloqueio da IL-10 endógena com anticorpos anti-IL-10 aumentou a replicação do HIV-1 em cultura de células.

CONCLUSÃO: nossos resultados sugerem que a IL-10 exerce influência negativa na replicação viral, o que provavelmente contribui para reduzir o risco de infecção vertical.

Palavras-chave: Síndrome da imunodeficiência adquirida; Citocinas; HIV-1; Células Th1; Linfócitos t

ABSTRACT

PURPOSE: to evaluate T cell proliferation and cytokine production in HIV-1-infected pregnant women and their impact on in vitro virus replication.

METHODS: peripheral blood from 12 HIV-1-infected pregnant women and from their neonates was collected. As control, 10 samples from non-infected pregnants were also colleted. The CD4⁺ and CD8⁺ T cell counts were assayed by flow cytometry. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and plasma were obtained by centrifugation with and without Ficoll-Hypaque gradient, respectively. The freshly purified PBMC were kept in cultures for seven days with PHA plus r-IL-2, and the lymphoproliferative response was assayed by Trypan blue dye exclusion. In some experiments we added anti-IL-10 monoclonal antibody. The plasma samples and supernatants from cell cultures were stored to determine both peripheral cytokine levels, by ELISA sandwich, and viral load, by RT-PCR.

RESULTS: the results showed that the lymphoproliferative response was smaller in cultures obtained from HIV-1-infected women than in control cultures [4.2±0.37 vs 2.4±0.56 (x 10⁶ cell/mL), p<0.005]. In both control and infected pregnant women who had low plasma viral load, the level of IL-10 was higher than in those with high viral replication (9.790±3.224 vs 1.256±350 pg/mL, p=0.002). The elevated TNF-a production detected in serum (7.200±2.440 pg/mL) and supernatants (21.350±15.230 pg/mL) was associated with higher plasma viral loads and vertical infection. The IL-10 blockade by anti-IL-10 antibodies augmented viral replication in the cell cultures.

CONCLUSION: these results indicate that IL-10 production exerts a negative influence on virus replication, diminishing the probability of intrauterine HIV-1 infection.

Keywords: Aqured immunodeficency; Cytokines; HIV-1; Th1-cells; t Lymphocytes

Introdução

A gestação é condição fisiológica com mudanças imunológicas e endócrinas envolvidas na aceitação do feto^1,2. Fortes evidências apontam para uma rede de citocinas produzidas por clones de células T maternas como sendo elemento central na imunomodulação^2-4. Por produzirem grandes quantidades de citocinas que regulam uma variedade de funções, os linfócitos T executam um papel capital na resposta imune. Nesse contexto, durante a resposta imune, os linfócitos T CD4⁺ virgens podem se diferenciar nos fenótipos Th1, Th2, Tr-1 ou Tr-3, que secretam padrões distintos de citocinas e, portanto, medeiam diferentes funções⁵. Vários fatores influenciam a diferenciação final desses linfócitos T ativados, mas citocinas e hormônios parecem ser decisivos no destino do fenótipo diferenciado^1,5-7. Com relação à gestação, dois pólos têm sido o foco dos estudos na imunorregualação materna: os linfócitos Th1 e as células reguladoras Tr-1 e Tr-3. Enquanto dados na literatura apontam que a indução de resposta imune materna do tipo Th1 é deletéria ao desenvolvimento fetal, vários estudos sugerem que citocinas produzidas pelas células T reguladoras 1 e 3 são protetoras^3,4,6-9.

Durante a gestação, o sistema imune materno é desafiado com moléculas de HLA paternas associadas a células fetais que atingem o seu sangue periférico^1,5,8-10. A sensibilização materna contra tais antígenos é orientada pelos linfócitos Th1, que secretam grandes quantidades de interleucina-2 (IL-2) e IFN-g, que auxiliam na ativação dos linfócitos T CD8⁺ dirigidos contra células fetais que expressam moléculas de HLA paternas. Estas células T CD8⁺ sensibilizadas, conhecidas como linfócitos T citotóxicos, além de danificarem diretamente os anexos fetais, amplificam a resposta local por perpertuar a secreção de citocinas pró-inflamatórias, tais como interferon-g (IFN-g) e fator de necrose tumoral (TNF-a). Estas citocinas, por aumentarem o poder microbicida dos macrófagos e das células NK uterinas^4,7-10, estão envolvidas em infartos placentários e descolamento prematuro da placenta, determinantes de sofrimento fetal e elevado risco de óbito perinatal^8,9. Entretanto, para evitar a produção de citocinas embriotóxicas, a mãe deve passar, por um tempo determinado, por mudanças fisiológicas necessárias para dar suporte à gestação. Neste sentido, o cortisol, o estrogênio e, principalmente, a progesterona são responsáveis pela geração de uma rede de citocinas antiinflamatórias, tais como a IL-10 e o fator b de crescimento transformante (TGF-b), que dará suporte ao desenvolvimento fetal na cavidade uterina^{1,2,6,7,10-14} .

A progesterona e o estrogênio, além de atuarem no trofoblasto fazendo-o secretar a IL-10 e o TGF-b^1,6,13, estão também envolvidos na tolerância a antígenos fetais, por induzirem linfócitos T deciduais e periféricos a se diferenciarem em células T reguladores do tipo 1 e 3^3,4,6,13. As células de fenótipo T regulador dos tipos 1 e 3 (Tr-1 e Tr-2) secretam grandes quantidades de IL-10 e TGF-b, respectivamente. A presença dessas citocinas antagoniza a função das células Th1 por bloquear a produção de TNF-a e INF-g^5,13,15.

A freqüência de infecção pelo HIV em mulheres adultas vem aumentando consideravelmente nos últimos tempos, fato esse que tem importância fundamental na transmissão vertical do vírus. A gravidez não afeta o curso da infecção pelo HIV-1¹⁶, mas o impacto dessa infecção sobre a rede de citocinas e na manutenção da gestação tem sido pouco investigado. Sabe-se, por exemplo, que em adultos a infecção crônica pelo HIV-1 está relacionada à ativação do sistema imune com produção elevada de citocinas pró-inflamatórias¹⁷. Algumas delas, como o TNF-a e o IFN-g, favorecem a replicação viral em linfócitos T CD4⁺ humanos¹⁸. A produção sustentada dessas citocinas é garantida não apenas pela resposta mediada pelos linfócitos T CD8⁺ contra antígenos do vírus, como também por uma ativação inespecífica do sistema imunológico induzida por vários produtos do HIV-1^17,18. Ademais, eventos não relacionados à infecção viral, como co-infecções recorrentes ou imunizações, elevam transitoriamente a viremia plasmática por elevar o grau de ativação imune^19-21. O perfil de citocinas em gestantes infectadas pelo HIV deve, portanto, desequilibrar a rede estabelecida no processo natural da gestação em favor das citocinas inflamatórias, o que pode ter implicações deletérias ao desenvolvimento fetal. Neste contexto, a introdução de novas drogas anti-retrovirais (ARVs) no manejo da infecção pelo HIV tem reduzido os distúrbios imunológicos por controlar a replicação viral. Pelo protocolo adotado pelo Ministério da Saúde, mulheres grávidas infectadas pelo HIV-1 devem iniciar o tratamento a partir da 14ª semana de gestação e mantê-lo até o final da mesma. Apesar de os regimes ARVs atualmente disponíveis não erradicarem o HIV-1, seu uso na gravidez trouxe grande impacto na redução dos riscos de transmissão vertical¹⁶.

O objetivo desse trabalho foi avaliar a influência da infecção pelo HIV-1 em alguns eventos imunológicos maternos, como a linfoproliferação e a produção de citocinas definidoras de diferentes fenótipos de resposta imunológica, e o impacto dessa relação na dinâmica da replicação viral.

Métodos

Foi realizado estudo transversal com gestantes infectadas pelo HIV-1 (n=12) com idade entre 21 e 37 anos, acompanhadas no serviço de Obstetrícia do Hospital Universitário Graffrée Guinle (HUGG/UNIRIO). Neste estudo, visamos avaliar o impacto da infecção viral na imunomodulação materna. Para não haver interferência na análise dos dados, gestantes que apresentassem co-morbidades, como outras doenças sexualmente transmissíveis, foram excluídas. Após aprovação pelo Comitê de Ética do HUGG, as amostras de sangue periférico das mães e do cordão umbilical de seus filhos foram colhidas após cada gestante ter lido e assinado o termo de consentimento livre e esclarecido. Como controle, amostras do sangue periférico de 10 gestantes HIV-1 negativas saudáveis, com idade e tempo gestacional compatíveis, foram utilizadas.

Amostras clínicas e obtenção de células mononucleares do sangue periférico

Vinte mL de sangue periférico materno e do cordão umbilical foram colhidos em tubos estéreis contendo heparina. As amostras de sangue materno foram colhidas 24 horas antes do parto cesáreo porque a infusão contínua de AZT durante a cirurgia altera as propriedades físico-químicas das amostras, o que inviabiliza a purificação de células mononucleares periféricas (PBMC) pelos métodos empregados em nosso laboratório. O mesmo procedimento foi conduzido para obtenção de sangue periférico de mulheres normais com o mesmo tempo de gravidez, porém, HIV-1 negativas.

Para obter PBMC, o sangue total foi processado como descrito em Baseler et al.²². Resumidamente, o sangue total foi centrifugado a 1200 rpm por 10 minutos em centrífuga refrigerada a 25ºC. Alíquotas do plasma de cada amostra foram então reservadas para avaliação posterior da carga viral e da presença de citocinas periféricas. O volume total de células e hemácias que ficaram nos tubos contendo heparina foi ressuspenso em solução salina em proporção 1:2 (v/v). Em seguida, 30 mL dessa amostra diluída foram colocados em tubos estéreis contendo 15 mL de solução de Ficoll-Hypaque (d=1.007 g/L) (Pharmigen) e foram submetidos a centrifugação a 2500 rpm/25ºC. Após 25 minutos, os tubos foram removidos e as PBMC recuperadas com uso de pipetas Pasteur estéreis, na interface entre a salina e a solução de Ficoll. As células obtidas foram, em seguida, submetidas a três procedimentos de lavagem com meio de cultura de RPMI 1640 (Sigma Co.).

As PBMC purificadas foram contadas em solução de azul de Trypan a 4% (v/v) e a concentração de células viáveis foi ajustada para 1,5 x 10⁶/mL. Em seguida, a suspensão celular foi diluída em meio RPMI completo antes de ser colocada em cultura em atmosfera úmida a 37ºC/7% CO₂. Esse meio completo é composto de meio de cultura RPMI 1640 suplementado com 50 U/mL de penicilina, 50 mg/mL de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina e 10 mM de tampão HEPES. Para enriquecê-lo, adicionamos soro fetal bovino previamente inativado pelo calor (56^ºC/45 minutos) a 10% (v/v).

Medida da replicação viral plasmática

Para obtenção de plasma, 5 mL de sangue total foram submetidos a centrifugação por 5 minutos a 1200 rpm. Um mililitro do plasma foi recolhido e submetido à avaliação da carga viral plasmática (CVP). A CVP nas amostras maternas e fetais foi medida por procedimento de amplificação de seqüência de ácido nucléico (NASBA, Organon, Holland), com limite de detecção de 80 cópias de RNA do HIV-1 por mL de plasma. Em alguns experimentos, a avaliação da carga viral em cultura foi avaliada na ausência ou presença de doses saturantes de anticorpos anti-IL-10 (Becton-Dickinson, CA, USA), na dose final de 10 mg/mL. Para tanto, aproximadamente 1,5 x 10⁶/mL de PBMC obtidas do sangue periférico de gestantes infectadas pelo HIV-1 (n = 10) com CVP < 10.000 cópias de RNA do HIV-1/ml foram mantidas em cultura por 5 dias na presença conjunta de fito-hemaglutinina (PHA) (5 mg/mL) mais IL-2 (20 U/mL). Para avaliar a replicação, 100 mL do sobrenadante de culturas tratadas ou não com anticorpos anti-IL-10 foram recolhidos e levados para quantificação da carga viral, como descrito na metodologia.

Contagem de linfócitos T CD4⁺ e T CD8⁺ periféricos

A alíquota reservada de sangue total fresco contendo EDTA foi submetida a imunofenotipagem quantitativa das subpopulações majoritárias de linfócitos T periféricos. Para isto, 50 mL do sangue total foram adicionados a tubos contendo combinação de anticorpos anti-CD3 marcados com isotiocianato de fluoresceína (FITC) com anti-CD4 marcados com ficoeritina (PE), e outros 50 mL pipetados dentro de tubos contendo anticorpos anti-CD3-FITC e anti-CD8-PE. Todos os procedimentos subseqüentes foram conduzidos como indicado pelo fabricante (Becton-Dickinson, CA, USA). A contagem final de linfócitos T CD3⁺ CD4⁺ e T CD3⁺ CD8⁺ foi realizada por citometria de fluxo e por FACSCOUNT (Becton-Dickinson, CA, USA), e os resultados expressos em número de cópias de RNA viral/mL.

Avaliação primária da resposta proliferativa das PBMC frescas obtidas das amostras

Aproximadamente 1,5 x 10⁶/mL de PBMC obtidas do sangue periférico de mães normais (n = 10) ou infectadas pelo HIV-1 (n = 12) foram mantidas em cultura por sete dias na presença conjunta de PHA a 5 mg/mL mais IL-2 recombinante humana (Sigma, Co.), a 20 U/mL. As células foram mantidas em placas de 96 poços (200 mL) de fundo redondo, e foram acompanhadas diariamente ao microscópio invertido. Para quantificar a proliferação celular em diferentes tempos, a suspensão celular total foi delicadamente homogeneizada com pipeta de 1 mL, e alíquotas de 20 mL foram removidas e diluídas 200 vezes em solução de azul de Trypan a 4% (v/m). Em seguida, a suspensão celular total foi deixada repousar em câmara de Neubauer por 3 minutos para que o corante pudesse marcar as células mortas. No microscópio óptico, com a objetiva de 100, foram contados os números de células viáveis nos quatro quadrantes. A densidade celular total foi inferida como o número médio de células ± desvio-padrão.

Dosagem de citocinas

Para quantificar a presença de citocinas definidoras de diferentes fenótipos Th (TNF-a, IFN-g, IL-10 e IL-4), amostras dos plasmas e dos sobrenadantes das culturas policlonalmente ativadas ou não foram recolhidas e submetidas à técnica de ELISA indireto, segundo protocolo fornecido pelo fabricante (Pharmigen). Placas de 96 poços foram devidamente sensibilizadas com anticorpo de captura (4 mg/mL) e incubadas por 18 horas a 4^ºC. No dia seguinte, as placas foram lavadas com solução de PBS-Tween a 0,1 % (solução de lavagem), bloqueadas com SFB a 10% diluído em solução de PBS e incubadas a 37^ºC. Ao final de duas horas, as placas lavadas, foram incubadas a 4^ºC com as amostras testes, bem como os padrões. Após 18 horas, as placas foram exaustivamente lavadas e tratadas com o anticorpo de detecção a 4 mg/mL, e incubadas por uma hora a 37^ºC. Ao final deste tempo, as placas foram novamente lavadas e tratadas com estreptoavidina-fosfatase alcalina. Passadas 18 horas a 4ºC, o conteúdo de cada poço na placa foi substituído pelo substrato (PNPP). O produto final da hidrólise pela fosfatase alcalina é o paranitrofenol (PNP), que possui cor amarela. A leitura foi realizada em leitor automatizado BioRad utilizando filtro de 405 nm e a concentração correspondente a cada valor da densidade ótica (D.O.) obtido foi determinada pela comparação com curva-padrão, com concentrações variando de 100 a 5000 pg/mL.

Análise estatística

Para análise estatística da significância das diferenças entre as médias e os desvios-padrão dos valores obtidos entre os grupos de gestantes normais e infectadas com diferentes cargas virais foi utilizado o teste t pareado de Student. As diferenças foram consideradas como estatisticamente significantes quando p<0.05.

Resultados

Como podemos observar na Tabela 1, dentre as gestantes infectadas pelo HIV-1 recrutadas a participar de nosso estudo, 03 em 12 tinham CVP detectáveis, isto é, mais de 80 cópias de RNA do HIV-1/mL. Devido ao reconhecimento tardio do estado de portador do vírus pela equipe médica, a introdução da terapia anti-retroviral foi conduzida em tempos avançados da gestação (34-37 semanas). De todas, apenas uma gestante com CVP detectável não estava sob cobertura terapêutica. Dos filhos, três neonatos tinham CVP detectável e a infecção foi posteriormente confirmada pelo método de PCR do DNA pró-viral (dado não mostrado).

Quando a resposta linfoproliferativa (Figura 1) induzida por ativadores policlonais (PHA + IL-2) foi avaliada, observamos que, apesar de a cinética da linfoproliferação ter sido similar, o nível de expansão policlonal foi maior nas culturas de células obtidas de mulheres grávidas saudáveis do que de pacientes grávidas portadoras do HIV-1⁺ com CVP <10.000 cópias/mL [4,2±0,37 vs 2,4±0,56, (x10⁶) células/mL, respectivamente p<0,005] (Figura 1A). Em ambas as amostras, o pico de proliferação celular foi observado entre 5 e 7 dias de cultura. Nas culturas de células ativadas obtidas de gestantes com elevados níveis de CVP (P06 e P09), o pico de linfoproliferação ocorreu entre 24-48 horas, seguido de perda celular progressiva (Figura 1B). Esses resultados sugerem que amostras de PBMC de mulheres grávidas infectadas pelo HIV-1 têm padrões desregulados de linfoproliferação como resposta a ativadores policlonais in vitro.

Além da proliferação, a produção de determinados padrões de citocinas foi pesquisada em nossas amostras. A princípio avaliamos o padrão periférico de citocina produzido pelos indivíduos de nosso estudo. Como pode ser observado na Tabela 2, tanto em mulheres grávidas normais quanto portadoras do HIV-1 com CVP <10.000 cópias de RNA/mL, os níveis de IL-10 foram elevados (1.015±455 pg/mL). A produção de IL-4, no entanto, foi inconsistente e não significativamente diferente entre os dois grupos (p=0,066). Produção baixa de IL-10 (251±115 pg/mL) e níveis elevados de TNF-a (565±105 pg/mL) foram observados no sangue periférico de gestantes com CVP >40.000 cópias de RNA/mL (P06 e P09). Esses resultados sugerem padrão desregulado na produção de citocinas no sangue periférico de mulheres grávidas com intensa replicação viral. Padrão similar no perfil de citocinas foi produzido por culturas de células policlonalmente ativadas. Como demonstrado na Figura 2, a produção de IL-10 foi detectada no sobrenadante de culturas de células obtidas de gestantes normais ou infectadas pelo HIV-1 com CVP <10.000 cópias de RNA/mL (9.790±3.224 pg/mL). Esse balanço é totalmente rompido em gestantes portadoras do HIV-1 com níveis elevados de CVP (P06 e P09).

O papel da IL-10 endógena na replicação viral foi avaliado a partir do bloqueio funcional desta citocina em culturas de células obtidas das gestantes infectadas pelo HIV-1. Como demonstrado na Figura 3, a adição de anticorpos monoclonais anti-IL-10 aumentou a CVP em todas as culturas de células T ativadas (PHA + IL-2), obtidas de mães que mantinham CVP <10.000 cópias de RNA/mL.

Discussão

A gestação é um estado de tolerância imunológica ao feto. Portanto, o sucesso da gestação se baseia na indução de uma rede de citocinas produzida tanto pela placenta quanto pelos linfócitos T reguladores maternos. A manutenção desse estado de não responsividade aos antígenos fetais é temporária e é mantida por mudanças hormonais, particularmente pela produção de progesterona. Alguns trabalhos sugerem que estes hormônios induzem linfócitos T CD4⁺ e T CD8⁺ maternos a se diferenciarem em células reguladoras que secretam citocinas antiinflamatórias, tais como IL-10 e o TGF-b^2-4. A infecção pelo HIV-1, por outro lado, induz um conjunto de distúrbios imunológicos no homem que é medido em grande parte pela produção crônica de citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF-a e IFN-g¹⁸.

Muitos dos distúrbios imunes em pacientes infectados pelo HIV decorrem da produção elevada de citocinas pró-inflamatórias. Um desses eventos envolve anormalidades proliferativas como resposta a antígenos relacionados ou não ao próprio vírus^17,19. Em nosso estudo, a capacidade de proliferação dos linfócitos T obtidos de gestantes saudáveis foi superior quando comparada às culturas de células de gestantes infectadas pelo HIV-1. Uma maior desregulação foi observada em culturas de células obtidas de mulheres com elevado nível de CVP. Nestas últimas amostras, além de a resposta linfoproliferativa máxima ter sido detectada já nas primeiras 24 horas de cultura, este evento foi seguido de perda celular progressiva. Como a infecção pelo HIV-1 induz apoptose em linfócitos T cronicamente ativados¹⁷, nosso grupo acredita que a elevada produção de citocinas pró-inflamatórias, como o TNF-a detectado em pacientes com elevadas CVPs, esteja envolvida na morte celular induzida por ativação.

No contexto da infecção pelo HIV, o perfil de citocinas secretado pelos linfócitos T maternos pode facilitar a replicação viral. Para entender melhor a interação entre as redes de citocinas nas gestantes infectadas pelo HIV-1, optamos por usar ativadores de linfócitos T que não induzissem padrões restritos de citocinas, como PHA e IL-2 recombinante humana. Nesse sentido, nossos dados revelaram que a produção elevada de IL-10 deve ser originária de linfócitos T reguladores do tipo 1 (Tr-1) em gestantes normais ou infectadas pelo HIV-1 com CVP reduzida. Estes resultados estão de acordo com outros dados publicados na literatura, que revelam tendência materna de desenvolver um padrão de células reguladoras (Tr-1) em resposta a diferentes estímulos antigênicos^{3,4,6,7,13,15}. Quando comparadas às pacientes com CVP indetectáveis ou reduzidas, gestantes com elevado nível de replicação viral, no entanto, apresentaram produção de TNF-a expressivamente superior à de IL-10. Portanto, na infecção pelo HIV a manutenção de um padrão celular Th-1 no sangue materno deve alterar o delicado equilíbrio de citocinas antiinflamatórias produzidas pelas gestantes em condições normais.

A presença de citocinas periféricas, tal como TNF-a, deve facilitar a replicação viral nos reservatórios imunes maternos. O controle da CVP passa a ser fundamental, pois dentre os múltiplos fatores imunogenéticos maternos que podem determinar a taxa de risco de infecção neonatal, o inóculo viral ao qual o filho é exposto é de longe o principal determinante de transmissão vertical. Dados recentes obtidos a partir de coorte de 297 mulheres acompanhadas há cinco anos no Hospital dos Servidores do Estado do Rio de Janeiro demonstram que o risco de transmissão vertical do HIV-1 é amplamente reduzido em mulheres que aderiram mais precocemente à terapia anti-retroviral indicada²³. A replicação viral persistente pode comprometer o desenvolvimento normal do feto, podendo acarretar o nascimento de pequenos para a idade gestacional, partos prematuros e mesmo abortos espontâneos^24,25. Todos esses fenômenos parecem estar associados à produção sustentada de citocinas pró-inflamatórias na interface materno-fetal^26,27. Trabalho recente²⁸ revelou que rejeição ao feto por gatas grávidas infectadas com o vírus da imunodeficiência felina, que possui muitas similaridades biológicas e clínicas com o HIV em humanos, foi um fenômeno imunológico induzido pela expressão de citocinas Th1 na interface decídua-placenta. Apesar de nossa amostra ter sido pequena, nossos dados revelaram estreita relação entre níveis elevados de citocinas Th1 com transmissão vertical do HIV-1.

Um achado interessante do nosso estudo foi que a neutralização da IL-10 endógena com anticorpos monoclonais aumentou a replicação viral em cultura de linfócitos T maternos ativados por PHA mais IL-2 recombinante. Enquanto a produção de IFN-g e TNF-a pode facilitar tanto a infecção produtiva de células-alvo saudáveis quanto amplificar a replicação em células contendo o DNA pró-viral^18-21, a IL-10 e/ou TGF-b mais IL-13 inibem a replicação viral em sistemas de infecção aguda^28-30. A IL-10 e o TGF-b, por induzirem um ambiente antiinflamatório, podem colaborar na proteção do feto na cavidade uterina por bloquear a atividade lítica mediada pelas células uterinas assassinas, tais como NK e T CD8. No momento nosso grupo vem analisando o envolvimento do TFG-b na capacidade replicativa viral, bem como na identificação do subtipo de linfócitos T responsável pela produção dessas citocinas.

Em resumo, nossos resultados sugerem que a produção de IL-10 exerce uma pressão negativa na replicação do HIV-1, o que pode, indiretamente, reduzir o risco de transmissão vertical da infecção. Acreditando nessa inter-relação, nosso grupo atualmente continua coletando amostras de sangue periférico das gestantes visando obter a comparação concreta dessa hipótese.

Agradecimentos

Agradecemos a Kátia Tavares, Silvana Pereira e a Fátima Napoleão pelo apoio técnico fornecido ao trabalho e ao Dr. Regis Mariano de Andrade pelas contribuições na revisão deste manuscrito.

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Recebido em: 125/5/2005

Aceito com modificações em: 12/7/2005

Trabalho realizado no Hospital Universitário Graffrée Guinle (HUGG/UNIRIO)

Correspondência: Cleonice Alves de Melo Bento

Rua Barão do Flamengo, 28/904 Flamengo – 22220-080 – Rio de Janeiro – RJ – Telefones: (21) 2224-4505/2558-7586/9409-4048 – Fax: [phone]-3812 – e-mail: [e-mail]

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Nov 2005
• Data do Fascículo
  Jul 2005