Efeitos do uso crônico do nelfinavir sobre a prenhez da rata albina: ensaio biológico

Effects of chronic nelfinavir treatment on rat pregnancy: biological assay

ARTIGOS ORIGINAIS

Efeitos do uso crônico do nelfinavir sobre a prenhez da rata albina: ensaio biológico

Effects of chronic nelfinavir treatment on rat pregnancy: biological assay

Camila Fernandes Venneri Mathias^I; Cícero Venneri Mathias^II; Ricardo Santos Simões^III; Ricardo Martins Oliveira-Filho^IV; Abes Mahmed Amed^V; Manuel de Jesus Simões^VI; Luiz Kulay Júnior^VII

^IPós-Graduanda do Departamento de Obstetrícia -Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP – São Paulo (SP), Brasil

^IIProfessor Assistente do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Faculdade de Medicina da Fundação do ABC – Santo André (SP), Brasil

^IIIResidente do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia-Universidade Federal de São Paulo – São Paulo (SP), Brasil

^IVProfessor Doutor do Departamento de Farmacologia do Instituto de Ciências Biomédicas – Universidade de São Paulo – USP – São Paulo (SP), Brasil

^VProf. Adjunto do Departamento de Obstetrícia – Universidade Federal de São Paulo – São Paulo (SP), Brasil

^VIProf. Adjunto do Departamento de Morfologia da Universidade Federal de São Paulo – São Paulo (SP), Brasil

^VIIProf. Titular do Departamento de Obstetrícia – Universidade Federal de São Paulo – São Paulo (SP), Brasil

^{Correspondência}

RESUMO

OBJETIVO: avaliar o efeito do uso crônico do nelfinavir sobre o peso de ratas albinas prenhes e seus conceptos, bem como o número de implantações, fetos, placentas, reabsorções e mortalidade materna e fetal.

MÉTODOS: 50 ratas albinas EPM-1 Wistar, prenhes, foram aleatoriamente divididas em cinco grupos: 2 controles, Contr1 (controle do estresse) e Contr2 (controle do veículo), e três experimentais, Exp40, Exp120 e Exp360, que receberam, respectivamente, 40, 120 e 360 mg/kg por dia de nelfinavir por via oral. A droga e o veículo (água destilada) foram administrados por gavagem em duas tomadas diárias (12/12 horas), desde o primeiro dia até o dia 20 da prenhez. No último dia do experimento, todos os animais foram anestesiados e sacrificados. Foram avaliados a evolução do peso, número de implantações, reabsorções, fetos, placentas, óbitos intra-uterinos, o peso dos fetos e das placentas e malformações maiores. A análise estatística foi realizada pela análise de variância (ANOVA) completada pelo teste de Kruskal-Wallis.

RESULTADOS: em relação ao ganho de peso das ratas, houve ganho normal em todos os grupos, não sendo constatadas diferenças significantes entre eles. ANOVA mostrou ausência de diferenças significativas entre os grupos quanto aos parâmetros estudados. As médias do número de fetos foram: controles = 9,7±0,50; grupos tratados com nelfinavir = 9,7±0,81. Para as médias de números de placentas e implantações, controles = 9,7±0,50; grupos tratados com nelfinavir = 9,7±0,78. Quanto às médias de pesos fetais, controles = 4,04±0,50; grupos tratados com nelfinavir = 3,91±0,33 g. Finalmente, para as médias de pesos de placentas, controles = 0,64±0,02; grupos tratados com nelfinavir = 0,67±0,02 g. Além disto, não foram observadas reabsorções, mortalidade das matrizes, óbitos e malformações fetais.

CONCLUSÕES: o nelfinavir, em todas as doses administradas, não influiu no ganho de peso das ratas prenhes e não mostrou efeitos deletérios sobre os conceptos.

Palavras-chave: Nelfinavir/efeitos adversos; Placenta; AIDS; Anti-retrovirais; Transmissão vertical de doença

ABSTRACT

PURPOSE: to evaluate the chronic effects of nelfinavir on body weight gain of pregnant albino rats and their concepts, as well as on the number of implantations, reabsorptions, fetuses, placentae, and maternal and fetal mortality.

METHODS: fifty pregnant EPM-1 Wistar albino rats were randomly divided into five groups: two controls, Contr1 (control of stress) and Contr2 (drug vehicle control), and 3 experimental groups, Exp40, Exp120, Exp360, which received 40, 120 or 360 mg/kg per day of oral solution of nelfinavir, respectively. The drug and the vehicle (distilled water) were administered twice a day (12/12 h) by gavage from the first up to the 20th day of pregnancy. After sacrifice under deep anesthesia, the following parameters were evaluated: number of implantations and reabsorptions, the weight of fetuses and placentae, and the number of intrauterine deaths as well as inspection for major malformations. Data were evaluated by ANOVA followed by the Kruskal-Wallis multiple comparison test.

RESULTS: body weight gain during pregnancy was normal for all the groups, and no significant differences were detected between them. ANOVA did not reveal any significant effect of nelfinavir on the studied parameters. The means of number of fetuses were: control = 9.7±0.50; nelfinavir-treated groups = 9.7±0.81. Regarding the means of number of placentae and implantations, controls = 9.7±0.50; nelfinavir-treated groups = 9.6±0.78. The mean fetal weights were as follows: controls = 4.04±0.50; nelfinavir-treated groups = 3.91±0.33 g. Finally, control placental weights averaged 0.64±0.02; nelfinavir-treated groups = 0.67±0.02 g.

CONCLUSION: nelfinavir was well tolerated at all the administered doses; no damage was produced on the fetuses.

Keywords: Nelfinavir/adverse effects; Placenta; AIDS; Antiretroviral drugs; Disease transmission, vertical

Introdução

Desde o seu reconhecimento como entidade nosológica, há cerca de duas décadas, a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) representa um desafio médico, devido a sua alta taxa de mortalidade e ao número cada vez maior de infectados.

Recentemente o programa de combate a AIDS/HIV das Nações Unidas (UNAIDS) relatou que o mundo registrou 5 milhões de novas infecções, de 3 milhões de mortes e um total de 40 milhões de pessoas infectadas. As mulheres respondem por 50% de toda a população HIV positiva no mundo¹.

O Ministério da Saúde, em 2005, revela que existem aproximadamente 600.000 portadores do HIV e mais de 12.000 grávidas contaminadas. A taxa de mulheres portadoras do vírus no momento do parto gira em torno de 0,5%². A taxa de mortalidade por AIDS no Brasil encontra-se estabilizada desde 1999, com uma média de 6,3 mortes por 100.000 habitantes. Esse índice é fruto da distribuição gratuita de anti-retrovirais. O Brasil é citado como o primeiro país em desenvolvimento a oferecer a terapia anti-retroviral gratuita e universal e um dos primeiros a obter sucesso³.

Desde o estudo do Pediatric AIDS Clinical Group, conhecido como Protocolo 076 (ACTG 076), no qual se demonstrou redução da taxa de transmissão vertical em 70% com a administração de zidovudina (AZT) à gestante⁴, os benefícios da terapia anti-retroviral vêm sendo amplamente estudados em associação com outras intervenções, como cesárea eletiva e supressão de aleitamento materno, a fim de reduzir a taxa de transmissão vertical⁵. Embora inicialmente preconizada a monoterapia com AZT, há recomendações recentes de que as gestantes não devem ser privadas do uso de combinações de drogas potentes, visto que atualmente esses esquemas estão relacionados a menor taxa de transmissão vertical⁶.

O nelfinavir é anti-retroviral inibidor de protease aprovado em 1997 para o tratamento de indivíduos infectados pelo HIV-1 e HIV-2, sendo um dos mais prescritos em adultos, adolescentes e crianças com idade acima de dois anos, e pode ser usado nas gestações com menos de 28 semanas e com carga viral mais acentuada⁷. Interfere nos genes da replicação viral alterando a estrutura de poliproteínas Gag e Gag-pol que alteram a configuração do capsídeo, levando à formação de vírus imaturos e não infectantes⁸.

Poucos trabalhos foram encontrados na literatura sobre o uso de nelfinavir em ratas prenhes. Estudos sobre o potencial do mesilato de nelfinavir em induzir toxidade êmbrio-fetal em ratas e coelhas prenhes que receberam o medicamento por via oral não encontraram alterações nos conceptos nas doses de 200, 500 e 1000 mg/kg por dia do 6º ao 17º dia da prenhez^9,10. No entanto, outros autores, utilizando esse medicamento por gavagem na dose de 97,5 mg/dia desde o dia inicial ao 21º dia de prenhez, observaram, em ratas, aumento significativo nas taxas de perdas pós-implantação e redução significativa nas taxas de viabilidade fetal e no número de fetos por ninhada¹¹.

Devido à ausência de consenso na literatura, realizamos o presente trabalho para averiguar os possíveis efeitos deste fármaco administrado durante toda a prenhez da rata albina.

Métodos

Foram utilizadas ratas (Rattus norvegicus albinus) adultas, virgens, pesando aproximadamente 200 gramas, fornecidas pelo Centro de Desenvolvimento de Modelos de Experimentação (CEDEME) da Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina (UNIFESP/EPM). Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UNIFESP/EPM (parecer nº 1397/04).

Os animais foram mantidos confinados em gaiolas plásticas, no biotério da Disciplina de Histologia, com temperatura ambiente controlada a 22ºC e iluminação artificial, obtida com lâmpadas fluorescentes, sendo o fotoperíodo de 12 horas claro (7:0019:00 h) e 12 horas escuro, com alimentação e água ad libitum.

Após um período de sete dias, os animais foram acasalados na proporção de um macho para três fêmeas, por período de duas horas. O início da gestação (dia zero da prenhez) foi determinado pelo encontro de espermatozóides na vagina da rata¹². Cinqüenta ratas prenhes foram distribuídas, aleatoriamente, em cinco grupos numericamente iguais: Contr1, animais não manipulados; Contr2, animais que receberam 6 mL de água destilada; Exp40, Exp120 e Exp360, animais tratados, respectivamente, com 40, 120 e 360 mg/kg por dia de solução oral de mesilato de nelfinavir. O veículo e a droga foram administrados por gavagem, duas vezes ao dia, com intervalo de 12 horas, desde o dia 0 até o 20º dia da prenhez.

O ganho de peso dos animais foi monitorizado por meio de pesagem nos dias zero, 7, 14 e 20 de prenhez. O ganho de peso porcentual foi calculado de acordo com a seguinte fórmula: D% = (peso no dia X – peso inicial) x 100/peso inicial, onde X indica os dias de pesagem.

Ao termo (20º dia), todos os animais foram anestesiados com mistura de xilazina (0,1 mg/kg) e cetamina (0,1 mg/kg), por via intraperitoneal. Após laparotomia e histerotomia avaliaram-se os seguintes parâmetros: peso das matrizes e dos fetos, número de implantações, de reabsorções, de fetos vivos e mortos, bem como o peso das crias e placentas e presença de óbitos fetais intra-útero e das matrizes. Os fetos foram detalhadamente investigados sob lupa estereoscópica quanto à ocorrência de malformações maiores externas (encurtamento de membros, espinha bífida, fenda palatina, hipospádia e lábio leporino).

Os resultados, após análise de variância, foram analisados por comparações múltiplas pelo teste de Kruskal-Wallis. O nível de rejeição para hipótese de nulidade foi fixado em 5%.

Resultados

Comparando os cinco grupos estudados em relação ao peso inicial (dia zero) das ratas, notamos ganho ponderal de peso durante toda a prenhez. No entanto, não foram encontradas diferenças significantes entre os grupos estudados (Figura 1).

Quanto ao número de fetos, placentas e implantações, verificamos que não ocorreram diferenças entre os grupos de estudo, de tal maneira que os dados foram semelhantes, ou seja, Contr1 = 9,5±0,6; Contr2 = 9,9±0,3; Exp40 = 9,0±0,9; Exp120 = 10,3±0,5 e Exp360 = 9,9±0,9. Igualmente, não houve diferenças significantes quanto ao peso das placentas (Contr1 = 0,6±0,1; Contr2 = 0,6±0,1; Exp40 = 0,7±0,1; Exp120 = 0,7±0,1 e Exp360 = 0,7±0,1 mg) ou dos fetos (Contr1 = 4,1±0,2; Contr2 = 3,9±0,1; Exp40 = 3,9±0,1; Exp120 = 3,9±0,2 e Exp360 = 3,9±0,7 mg). Não foram encontrados casos de reabsorções, malformações fetais maiores externas e óbitos fetais e das matrizes. Estes resultados mostram que não houve diferença significante entre os diversos grupos do experimento (Tabela 1).

Discussão

O nelfinavir é inibidor de protease viral com especificidade para o vírus HIV, utilizado com muita freqüência nos esquemas de anti-retrovirais combinados para as gestantes contaminadas. Recentemente foi relatado que também inibe a ação da glicoproteína Gp41 viral indutora da apoptose nas células placentárias envolvendo a caspase 3 pela via mitocondrial^13,14. Possui poucos efeitos colaterais, dentre eles os mais comuns são os distúrbios gastrointestinais de leve intensidade, além de possuir praticidade posológica de duas tomadas diárias, o que facilita a adesão ao tratamento. Sendo assim, é um dos inibidores de protease mais utilizados. No entanto, pouco se sabe sobre as repercussões desse fármaco sobre a gestação.

A dose de nelfinavir administrada no grupo Exp40 foi proporcionalmente semelhante à recomendada para uso terapêutico em humanos, isto é, 40 mg/kg de peso corporal por dia⁸. Os grupos Exp120 e Exp360 foram tratados com doses 3 e 9 vezes superiores à dose menor, porque o metabolismo hepático da rata estima-se ser três vezes mais eficiente do que aquele encontrado em humanos e também porque a depuração renal desses animais é duas vezes mais eficiente^10,11.

Sabemos que a idade das ratas albinas guarda estreita relação com seu peso, sendo possível calcular um tendo o outro como base. Além disso, há um limite de peso que esses animais atingem, de modo que, ao chegarem a um patamar ponderal corpóreo, o aumento de peso se torna mais limitado¹⁵. Ao que tudo indica, no presente estudo, o aumento dos pesos das ratas prenhes não foi influenciado pelo uso do nelfinavir durante toda a prenhez. O ganho de peso da rata durante a prenhez, porém, não é homogêneo. Sabe-se que a última semana é a fase de maior ganho de peso em qualquer gestação¹⁵. Estes dados estão de acordo com os nossos achados, pois o ganho de peso do 20º dia foi significantemente maior do que no 7º dia, em todos os grupos estudados.

Nossos dados estão de acordo com os achados da literatura em que, utilizando nelfinavir nas doses de 200, 500 e 1000 mg/kg de peso, em ratas do 6º ao 17º dia da prenhez, não foram encontradas alterações em relação ao peso das matrizes. O mesmo aconteceu com estudo realizado com nelfinavir na dose de 97,5 mg/dia administrada a ratas do dia inicial da prenhez ao 21º dia. Já com o estavudina¹⁶ e o ritonavir¹⁷, foi observada redução do peso materno de ratas durante a gestação. Contudo, os mecanismos de ação destes retrovirais são diferentes do nelfinavir.

Tratando-se de drogas e especialmente de anti-retrovirais, sabe-se que os inibidores da transcriptase reversa ultrapassam com mais facilidade a membrana sinciciotrofoblástica placentária do que os inibidores de protease, que apresentam dificuldade em fazê-lo. No curso da última década foi escrita uma pequena família de genes (mdr1, mdr2 e mdr3)¹⁸ com expressão codificada na placenta de roedores, por meio da glicoproteína P. Essa proteína de transporte transmembrana tem como função promover transporte contra gradiente de concentração¹⁹ e exportar compostos orgânicos do citosol para o meio extracelular²⁰. O aumento de sua expressividade está diretamente relacionado com o período de duração do uso dos inibidores da protease e, conseqüentemente, queda da concentração intracelular desses fármacos²¹. Cumpre, portanto, o papel de proteger o feto contra agentes teratogênicos; por outro lado, impede que medicamentos como os inibidores de protease atinjam o feto, privando-o de seus benefícios²². Além disso, é referido que o nelfinavir liga-se fortemente a proteínas plasmáticas, o que dificulta a sua passagem transplacentária²³.

Tal fato pode explicar o porquê de o nelfinavir, apesar de ter peso molecular de livre trânsito pela placenta (peso molecular = 660 kDa), não ter atingido os conceptos e conseqüentemente não ter levado a nenhuma alteração dos parâmetros intra-uterinos, como o número de implantações, reabsorções, peso de feto, placentas e óbitos fetais. A mesma ausência de efeitos no tocante ao conteúdo intra-uterino foi observada em estudo experimental similar usando ritonavir, provavelmente também em função da restrição da passagem transplacentária do fármaco promovida pela glicoproteína P²⁴. Nossos dados discordam dos achados da literatura quanto ao número de fetos. Alguns autores, ministrando nelfinavir a ratas durante toda a prenhez, encontraram aumento do número de perdas pós-implantação e redução do número de fetos por ninhada²⁵. Deve ser ressaltado que estudos em camundongas normais e prenhes relataram haver aumento da depuração hepática do nelfinavir devido à enzima CYP3A4, o que diminuiria sua atividade sobre o concepto²⁶.

Muitos estudos têm referido que a exposição intra-útero de anti-retrovirais, principalmente inibidores de protease, podem estar relacionados com prematuridade e baixo peso ao nascimento²⁷. O aumento da incidência de partos prematuros tem sido visto em associação com o uso de nelfinavir²⁸. Tais achados não foram observados em nossos resultados.

Assim sendo, esta pesquisa experimental procurou, com os resultados encontrados, colaborar no sentido de mostrar a excelente tolerância das ratas e de seus conceptos com relação ao uso do medicamento durante toda a prenhez.

Recebido em: 17/1/2006

Aceito com modificações em: 20/2/2006

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Correspondência:

Camila Fernandes Venneri Mathias

Rua Dr. Esdras Pacheco Ferreira, 143 – Vila Nova Conceição

04507-060 – São Paulo – SP

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  25 Ago 2006
• Data do Fascículo
  Mar 2006

Histórico

• Aceito
  20 Fev 2006
• Recebido
  17 Jan 2006