Prevalência e caracterização de espécies de lactobacilos vaginais em mulheres em idade reprodutiva sem vulvovaginites

Prevalence and characterization of vaginal lactobacillus species in women at reproductive age without vulvovaginitis

ARTIGO ORIGINAL

Prevalência e caracterização de espécies de lactobacilos vaginais em mulheres em idade reprodutiva sem vulvovaginites

Prevalence and characterization of vaginal lactobacillus species in women at reproductive age without vulvovaginitis

Eliane Melo Brolazo^I; Jose Antonio Simões^II; Maria Elena Fátima Nader^III; Maria Silvina Juárez Tomás^IV; Gustavo Bueno Gregoracci^V; Camila Marconi^VI

^IPós-graduanda (Doutorado) em Microbiologia pelo Departamento de Tocoginecologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP - Campinas (SP), Brasil

^IIProfessor do Departamento de Tocoginecologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP - Campinas (SP), Brasil

^IIIDoutora em Microbiologia; Pesquisadora responsável pelo Laboratório de Microbiologia Preventiva do Centro de Referência para Lactobacilos - CERELA - Tucumán, Argentina

^IVDoutora em Microbiologia; Pesquisadora do Laboratório de Microbiologia Preventiva do Centro de Referência para Lactobacilos - CERELA - Tucumán, Argentina

^VPós-graduando (Doutorado) em Microbiologia (Genética e Biologia Molecular) pelo Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP - Campinas (SP), Brasil

^VIPós-graduanda (Doutorado) pelo Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu da Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" - UNESP - Botucatu (SP), Brasil

^{Correspondência}

RESUMO

OBJETIVO: identificar espécies de lactobacilos isolados do conteúdo vaginal de mulheres saudáveis e assintomáticas; determinar as espécies mais prevalentes e caracterizá-las fenotipicamente.

MÉTODOS: lactobacilos foram isolados em meio seletivo a partir de amostras de conteúdo vaginal de 135 mulheres, sem queixa de corrimento e com diagnóstico laboratorial negativo para infecções vaginais, acompanhadas em um ambulatório de Planejamento Familiar. Os isolados foram identificados por PCR multiplex e, quando necessário, submetidos ao sequenciamento do gene RNAr 16S. Foram também avaliados quanto à acidificação do meio de cultura, à produção de ácido láctico, de H₂O₂, bacteriocinas e a capacidade de adesão às células epiteliais.

RESULTADOS: oitenta e três cepas de lactobacilos foram isoladas e identificadas, sendo as espécies predominantes L. crispatus (30,1%), L. jensenii (26,5%), L. gasseri (22,9%) e L. vaginalis (8,4%). Apenas 20 destes isolados não produziram H₂O₂ em quantidades detectáveis. Das 37 linhagens selecionadas para teste de adesão a células epiteliais, 12 apresentaram adesão entre 50 a 69%, 10 apresentaram 70% ou mais, e as restantes pouca ou nenhuma adesão. Nenhum dos isolados produziu bacteriocinas.

CONCLUSÕES: as espécies de lactobacilos mais prevalentes em mulheres sem vulvovaginites, isoladas em meio de cultura seletivo e identificadas por métodos moleculares, foram L. crispatus, L. jensenii e L. gasseri. Além de mais frequentes, tais linhagens também apresentaram melhor produção de H₂O₂ e atingiram menores valores de pH em meio de cultura.

Palavras-chave: Lactobacillus /isolamento & purificação; Lactobacillus/epidemiologia; Vagina/microbiologia; Reação em cadeia da polimerase/métodos; Vulvovaginite

ABSTRACT

PURPOSE: to identify species of lactobacillus isolated from the vaginal contents of healthy and asymptomatic women, determining the most prevalent species and characterizing them phenotypically.

METHODS: lactobacillus have been isolated in selective milieu from samples of the vaginal contents of 135 women without complaints of vaginal secretion, and with negative laboratorial diagnosis of vaginal infection, followed up at an outpatient clinic. After being identified by multiplex PCR, the isolates have been submitted to RNAr 16S gene sequencing, when necessary. They have also been evaluated concerning the production of lactic acid, H₂O₂, bacteriocins and the ability to adhere to epithelial cells.

RESULTS: eight-three lactobacillus strains were isolated and identified, L. crispatus (30.1%), L. jensenii (26.5%), L. gasseri (22.9%) e L. vaginalis (8.4%), being the prevalent species. Only 20 of those isolates did not present H₂O₂ production, in detectable amounts. From the 37 strains selected for the test of adhesion to the epithelial cells, 12 presented 50 to 69% of adhesion, 10 presented 70% or more, and the remaining, little or no adhesion at all. None of the tested strains produced bacteriocins.

CONCLUSIONS: the lactobacillus species more prevalent in women without vulvovaginitis, isolated in selective culture milieu and identified by molecular methods were L. crispatus, L. jensenii and L. gasseri. Besides the fact of being more prevalent, these strains also presented better production of H₂O₂, and reached lower pH values in the culture milieu.

Keywords: Lactobacillus/isolation & purification; Lactobacillus/epidemiology; Polymerase chain reaction/methods; Vagina/microbiology; Vulvovaginitis

Introdução

Em mulheres saudáveis, a flora vaginal é composta predominantemente por lactobacilos. Durante o período reprodutivo, há grande aporte de glicogênio nas células epiteliais da vagina, estimuladas pela presença de estrógenos. Este glicogênio é metabolizado pelos lactobacilos para formação de ácido láctico, o qual inibe o crescimento de outras espécies bacterianas, principalmente patogênicas e constitui o principal mecanismo de defesa local^1,2.

Esta atividade antagonista dos lactobacilos vaginais é um fator importante na proteção contra várias infecções, principalmente a vaginose bacteriana (VB), a vulvovaginite mais comum nas mulheres em idade reprodutiva. A VB causa corrimento vaginal geralmente com mau cheiro, além de consequências mais sérias, como parto prematuro e aumento do risco de contrair e transmitir o vírus da imunodeficiência humana (HIV)^3,4. É caracterizada pela substituição da flora vaginal normal, na qual predominam os lactobacilos por uma proliferação acentuada de Gardnerella vaginalis e outros micro-organismos anaeróbios associados^5,6.

A produção de ácidos orgânicos pelos lactobacilos mantém o pH vaginal menor ou igual a 4,5, criando um ambiente inóspito para os patógenos. O pH ácido, abaixo de 4,5, dificulta o crescimento da G. vaginalis, que tem como faixa ótima de crescimento, pH entre 6,0 e 6,5⁵. Além disto, a fixação dos lactobacilos no epitélio vaginal é favorecida em pH de 3,8 a 4,2, enquanto a G. vaginalis não se fixa às células do epitélio nessas condições de pH⁷.

Além dos ácidos orgânicos, os lactobacilos produzem outras substâncias antimicrobianas como peróxido de hidrogênio (H₂O₂) e bacteriocinas. A inibição de espécies bacterianas pela presença de H₂O₂ também é um mecanismo de antagonismo bastante importante. Os lactobacilos são capazes de oxidar os carboidratos por uma via metabólica, cujo produto final é o H₂O₂ e este na ausência de peroxidase, se acumula. O excesso desse metabólito pode inibir ou matar outros micro-organismos, principalmente os grupos com carência ou baixa produção de peroxidase, como os anaeróbios¹. Por isso, a ausência de lactobacilos produtores de H₂O₂ permite o crescimento dos micro-organismos catalase-negativos, sendo considerado um importante fator na fisiopatologia da VB⁸.

O tratamento preconizado para VB é o metronidazol, efetivo contra a maioria dos micro-organismos anaeróbios envolvidos nesta vulvovaginite. A taxa de cura de sete a dez dias após o tratamento está em torno de 80%, mas a recolonização vaginal com lactobacilos nem sempre ocorre após o tratamento, e as taxas de recidiva para VB chegam a 40% em médio prazo⁹.

Várias alternativas têm sido pesquisadas no sentido de prevenir a recidiva da VB após o tratamento habitual. A alternativa mais promissora seria o uso de lactobacilos probióticos para recolonização vaginal. Infelizmente, nenhuma tentativa neste sentido obteve sucesso. A maior dificuldade parece estar no encontro da "linhagem ideal" de lactobacilos, capaz de recompor a flora vaginal, visto que a grande maioria das cepas experimentadas nem conseguem aderir ao epitélio vaginal^10,11. Assim, o objetivo deste estudo foi identificar taxonomicamente as espécies de lactobacilos isolados do conteúdo vaginal de mulheres saudáveis e assintomáticas; determinar as espécies mais prevalentes e caracterizá-las quanto à capacidade de acidificação, produção de ácido láctico, H₂O₂, bacteriocinas e sua capacidade de adesão às células do epitélio vaginal. Estas propriedades nos permitem selecionar um grupo de cepas para potencial aplicação biotecnológica, ou seja, com características de interesse para composição de um produto para a reconstituição de microbiota vaginal.

Métodos

Foram convidadas a participar do estudo mulheres em idade reprodutiva, sem queixa de corrimento vaginal, acompanhadas no ambulatório de Planejamento Familiar da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). As 135 mulheres selecionadas, após assinarem o termo de consentimento livre e esclarecido aprovado pelo Comitê de Ética, sob número #202/2005, passaram por consulta ginecológica. Durante a consulta, foi realizada coleta do material vaginal para o isolamento dos lactobacilos e para a bacterioscopia de secreção vaginal corada por Gram para confirmação da ausência de infecções vaginais. Nos esfregaços corados, os morfotipos bacterianos foram quantificados de acordo com os critérios de Nugent, Krohn e Hillier¹². Apenas as pontuações de 0 a 3 foram consideradas como ausência de infecções genitais. Amostras endocervicais foram coletadas em UCM (Universal Collection Médium, Digene, São Paulo, Brasil), para posterior detecção de Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhea, utilizando o hc2 CT/GC DNA test (Digene, Galtehrsburg, EUA). Além disso, foi colhida uma lâmina para realização de citologia para detecção de HPV (papiloma vírus humano) e alterações celulares neoplásicas.

As amostras de conteúdo vaginal, coletadas em meio de transporte Amies com carvão (CB Products, Corumbataí, Brasil), foram semeadas em duas placas de ágar seletivo De Man-Rogosa-Sharpe (MRS, Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) e incubadas a 37 ºC por 24 a 48 horas, em atmosfera anaeróbica (Forma Anaerobic System, Thermo Electron Corporation, Waltham, EUA), com 5% de CO₂ (Forma Series II Water Jacketed CO₂ incubator - Thermo Electron Corporation). As colônias isoladas foram previamente identificadas com base nas características morfotintoriais (bacilos Gram-positivos) e reação negativa a catalase, e armazenadas a 70 ºC negativos, em caldo MRS suplementado com 10% de glicerol.

Identificação dos lactobacilos

Para a identificação molecular, o DNA das linhagens isoladas foi extraído e purificado através do kit MasterPure and Ready-Lyse (Epicentre Biotechnologies, Madison, EUA). A identificação da espécie foi realizada por PCR multiplex em duas etapas, de acordo com o método descrito por Song et al.¹³. Um conjunto de iniciadores (primers) foi utilizado para agrupar os lactobacilos. Em função do tamanho do fragmento amplificado, outro conjunto de iniciadores foi empregado para a identificação da espécie em cada um dos quatro grupos de lactobacilos¹³.

As reações foram realizadas em Termociclador Mastercycler gradient (Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha) com volume final de 30 µL, empregando Taq DNA polimerase (Fermentas, Burlington, Canadá).

Os primers específicos utilizados foram desenhados por Song et al.¹³, com base nas sequências dos genes 16S e 23S, além da sequência contida no espaço intragênico 16S-23S. Os amplicons foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 2,5% corado com brometo de etídio.

Para padronização do método, foram utilizadas 11 linhagens padrão adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, EUA): L delbrueckii (ATCC 10705), L. acidophilus (ATCC 4356), L. crispatus (ATCC 33820), L. gasseri (ATCC 9857), L. jensenii (ATCC 25258), L. paracasei (ATCC 27092), L. rhamnosus (ATCC 53103), L. fermentum (ATCC 14932), L. plantarum (ATCC 14917), L. reuteri (ATCC 53608) e L. salivarius (ATCC 29602).

Sequenciamento do gene RNAr 16S

Oito linhagens de lactobacilos não puderam ser identificadas através da técnica de PCR Multiplex e foram submetidas ao sequenciamento do gene RNAr 16S. O DNA extraído previamente dos isolados de lactobacilos foi submetido à amplificação de um fragmento de aproximadamente 1.400 bp do gene RNAr 16S, utilizando os primers p27-forward (5'- AGA GTT TGATCM TGG CTC AG -3') e p1401-reverse (5'- CGG TGT GTA CAA GGC CCG GGA ACG -3').

As reações de sequenciamento foram realizadas utilizando o ET Terminator^TM Mix (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, Reino Unido), utilizando primers internos do gene rRNA 16S, B4 (5'- TAT TAC CGC GGC TGC TGG CA -3') e (5'- TGC CAC CAG CCG CGG TAA TA), conforme descrito anteriormente¹⁴. As reações foram realizadas segundo instruções do fabricante (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, Reino Unido) e a incubação, em termociclador Eppendorf.

Os produtos da reação de sequenciamento foram submetidos à purificação com ExoSAP-IT (USB Corporation, Cleveland, EUA), conforme instruções do fabricante. A reação de sequenciamento foi precipitada com etanol absoluto, lavada com etanol 70% e ressupendida em tampão contendo formamida (conforme instruções do fabricante). Foram então submetidas ao sequenciamento em Megabace 1000 System (GE Healthcare).

As sequências obtidas para cada amostra foram alinhadas através do programa Clustal W, gerando uma sequência de aproximadamente 1.100 bp do gene rRNA 16S. As sequências obtidas foram analisadas utilizando o BLAST para identificação da espécie¹⁵. Todos os isolados foram identificados com similaridade mínima de 98% entre a sequência analisada e aquelas existentes no banco de dados.

Caracterização dos lactobacilos

Produção de ácido láctico

Os lactobacilos foram semeados em caldo LAPTg (extrato levedura/peptona/triptona/tween80/glicose)¹⁶ , pH 6,5 e incubados a 37 ºC por 24 horas em anaerobiose. Após o período de incubação, foram medidos no sobrenadante os valores de pH com potenciômetro (Testo AG, Lenzkirch, Alemanha). O ácido láctico produzido foi quantificado utilizando-se o kit D-Lactic Acid (Boehringer, Mannheim, Alemanha) com leitura da absorbância a 340 nm, em espectrofotômetro (Celm, Barueri, Brasil).

Produção H₂O₂

Os lactobacilos foram cultivados a 37 ºC em condições anaeróbias por 48 horas, em ágar MRS contendo 0,25 mg/mL de TMB (tetrametilbenzidina, Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) e 0,01 mg/mL de horseradish peroxidase (Sigma-Aldrich). As colônias de lactobacilos produtores de peróxido apresentam coloração azul quando expostas ao ar e a intensidade desta coloração foi avaliada em cruzes (muito intensa 4+, intensa 3+, moderada 2+, fraca 1+ e ausente 0). Dada a subjetividade desta avaliação, a dosagem semiquantitativa com Meckoquant strip test (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) também foi empregada, após cultivo em caldo MRS.

Produção de bacteriocinas

Os lactobacilos foram cultivados em caldo MRS e a partir destes cultivos foram preparados filtrados dos sobrenadantes. Estes filtrados foram adicionados a orifícios feitos no ágar de placas recém-semeadas com o micro-organismo indicador (Gardnerella vaginalis ATCC 14018) para detecção de bacteriocinas, através da formação de halos de inibição do crescimento do micro-organismo indicador nestas placas. Visando descartar a ação de ácidos provenientes do metabolismo e de H₂O₂, o procedimento foi repetido com os sobrenadantes neutralizados (ao pH inicial do meio) e o peróxido foi degradado com a utilização de catalase (Sigma Chemical Co., Saint Louis, EUA).

Capacidade de adesão às células do epitélio vaginal

Foi realizada de acordo com metodologia desenvolvida previamente¹⁷. As células do epitélio vaginal foram coletadas em meio de cultivo comercial (Advanced MEM, Gibco, Paisley, Reino Unido), centrifugadas e lavadas repetidamente até a remoção da microbiota original. A concentração desta suspensão celular foi ajustada a 10⁵ células/mL. Os lactobacilos provenientes de subcultivos em meio seletivo foram lavados e ressuspensos em Advanced MEM, com concentração ajustada a 10⁷ lactobacilos/mL. Volumes iguais das duas suspensões foram misturados e incubados por uma hora a 37 ºC, em estufa de CO₂. Como controle negativo foi feita uma suspensão de células vaginais apenas com Advanced MEM, sem suspensão de lactobacilos. As misturas foram então lavadas e centrifugadas repetidamente até a remoção das bactérias não aderidas. A partir dos pellets lavados, foram preparadas lâminas coradas pelo método de Gram. A leitura foi feita contando-se o número de lactobacilos aderidos a cada célula observada, número de células com lactobacilos aderidos e número total de células observadas. A partir destes dados, foi calculado o índice de adesão (número de bactérias aderidas ou o de células com bactérias aderidas) e a porcentagem de adesão (número de células com bactérias aderidas ou número total de células contadas).

Resultados

A média da idade das 135 mulheres foi de 31,6±6,1 anos. O pH vaginal aferido em média foi de 4,2±0,4 e o escore de Nugent 1,4±0,9 (média±desvio padrão). Das 135 amostras coletadas, 11 foram excluídas por infecções (oito positivas para Chlamydia trachomatis ou Neisseria gonorrhea, duas para Candida sp e uma com os dois tipos de infecção concomitantes). Todas as mulheres incluídas no estudo apresentaram resultado de citologia oncótica dentro dos limites da normalidade. Das amostras efetivamente incluídas, foram isoladas 83 cepas de lactobacilos. Destes, 75 linhagens (90%) foram identificadas pelo método do Multiplex PCR e as oito restantes foram submetidas ao sequenciamento do gene RNAr 16S. Os resultados obtidos por essa técnica permitiram a identificação de 100% das linhagens testadas. Das oito linhagens sequenciadas, sete se alinharam com a espécie Lactobacillus vaginalis e uma com a espécie Lactobacillus mucosae.

A espécie predominante foi L. crispatus, presente em 25 de 83 amostras (30,1%), seguida de L. jensenii (26,5%), L. gasseri (22,9%) e L. vaginalis (8,4%) (Tabela 1). As outras espécies isoladas foram L. delbrueckii, L fermentum, L reuteri e L. rhamnosus, com duas cepas cada uma, e L. mucosae e L. salivarius com uma cepa cada (Tabela 2).

Quanto à capacidade de acidificação, as espécies que apresentaram maior redução de pH em meio de cultura foram L. jensenii, com valor médio de 3,65 e L. gasseri, com 3,72. Apesar da significativa acidificação do meio de cultura observada, nenhuma das linhagens avaliadas apresentou alta produção de ácido láctico. Das 83 cepas de lactobacilos analisadas, apenas 20 não apresentaram produção de H₂O₂ detectável pela técnica de cultivo em ágar MRS com TMB (tetrametilbenzidina, Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA). Destas, 18 foram consideradas boas produtoras (3+), e quatro como muito boas (4+). Neste grupo, notou-se predomínio das espécies L. jensenii, com três cepas muito boas e dez boas produtoras, L. crispatus com seis cepas boas produtoras, L. gasseri com três boas produtoras e uma muito boa.

A análise semiquantitativa da produção de H₂O₂ pelo sistema Meckoquant strip test foi menos sensível, com 40 linhagens consideradas negativas para produção de H₂O₂ (dados não apresentados). Quanto à produção de bacteriocinas, em todos os sobrenadantes testados foi observada uma diminuição na concentração de colônias ao redor dos orifícios, ou seja, ocorreu uma redução do crescimento do micro-organismo indicador, mas sem a formação de um halo verdadeiro (dados não apresentados). Dada esta inibição parcial, os sobrenadantes foram tratados e testados novamente, mas nesta etapa não houve formação de halo ou redução de crescimento.

A partir dos resultados de produção de H₂O₂, foram selecionadas 37 linhagens para o estudo de adesão ao epitélio vaginal. Destas, 12 apresentaram porcentagem de adesão entre 50 e 69% e dez, um índice igual ou maior a 70%. As restantes apresentaram pouca capacidade de aderir às células epiteliais.

Discussão

A espécie L. crispatus foi a mais frequente em nosso estudo, presente em quase um terço das amostras, seguida de L. jensenii e L. gasseri, o que corrobora estudos prévios utilizando técnicas moleculares para identificação de lactobacilos isolados de mulheres aparentemente saudáveis^18,19. Estudos mais recentes realizados nos Estados Unidos, Japão e Europa, utilizando técnicas de biologia molecular têm mostrado que além de L. crispatus, L. jensenii e L. gasseri outras espécies bastante frequentes são L. iners e L. vaginalis^20-22.

A espécie L. iners tem características muito distintas dos outros lactobacilos, não é cultivável em meio MRS e apresenta grande variedade morfológica e tintorial, sendo descrita como bacilos curtos Gram-negativos e tem sido encontrada no ambiente vaginal em estudos que avaliam a microbiota por métodos moleculares, os quais independem de cultivo e isolamento prévio^21,23. A capacidade de produção de substâncias inibidoras de patógenos por esta espécie não foi estudada, portanto não se conhece sua influência no equilíbrio da microbiota vaginal. A espécie L. vaginalis, no entanto, foi encontrada em 8,4% de nossas amostras.

Os lactobacilos das espécies L. vaginalis e L. mucosae só foram identificados através do sequenciamento do gene que codifica o rRNA 16S, pois a técnica de identificação por PCR Multiplex foi desenvolvida inicialmente para lactobacilos intestinais e o conjunto de primers utilizados mostrou-se insuficiente para a identificação de todas as espécies de origem vaginal.

Outras espécies (L. fermentum, L. delbrueckii, L. reuteri, L. rhamnosus e L. salivarius) foram pouco frequentes, provavelmente por se tratar de mulheres saudáveis, sugerindo que as mesmas não tenham as mesmas características competitivas quando comparadas às espécies mais frequentes²⁴.

Do total de amostras estudadas, foram encontradas duas ou mais espécies de lactobacilos em apenas 7,2%, ou seja, a grande maioria das mulheres saudáveis é colonizada por uma única espécie dominante de lactobacilo, o que é consistente com os dados de outros estudos^24,25.

Em relação às características consideradas potencialmente benéficas em lactobacilos, foram avaliadas a produção de ácido através da redução de pH do meio de cultura, e através da quantificação de ácido láctico. As espécies de L. jensenii e L. gasseri estudadas foram as únicas que atingiram valores médios de pH em meio de cultivo, menores do que 4,0 (3,65 e 3,72, respectivamente), enquanto a média de L. crispatus foi levemente superior, 4,13, o que confirma que estas espécies são importantes para a acidificação do meio vaginal. Estes dados são compatíveis com os achados de Boskey et al., os quais compararam o pH inicial do meio de cultura e a concentração de bactérias, e observaram que os lactobacilos vaginais param de crescer e acidificar quando atingem o pH na faixa de 3,2 a 4,8, valores estes comparáveis com o pH observado in vivo²⁶

A produção do ácido láctico foi baixa para todas as linhagens avaliadas, comparando-se com dados de literatura que descreveram a variabilidade de tal produção entre 1,5mg/mL a 2.250 mg/mL⁵. Esta discrepância entre os valores de ácido láctico pode ser decorrente da inadequação do método utilizado, pois apesar desta baixa detecção de ácido láctico, várias linhagens mostraram capacidade de acidificar o meio de cultura. Outra possibilidade é a produção de outros ácidos orgânicos, como o ácido acético, já que este pode não ser o único responsável pela redução do pH do meio⁵. Já foi reportado que o ácido láctico e o acético produzidos por bactérias lácticas podem agir sinergicamente para inibir o crescimento de patógenos²⁷

Quanto à produção de H₂O₂, das 83 linhagens de lactobacilos analisadas, apenas 20 não apresentaram produção de H₂O₂ detectável pela técnica de crescimento em ágar MRS com TMB. Contudo, a técnica de detecção de H₂O₂ pelo sistema Meckoquant strip test apresentou menor sensibilidade, com 40 linhagens consideradas negativas para produção de H₂O₂. As melhores produtoras de H₂O₂ foram as espécies L. jensenii, L. crispatus e L. gasseri, resultados que concordam com outros estudos que mostraram que espécies como L. gasseri e outras do grupo do L. acidophilus (L. crispatus e L. jensenii) são caracteristicamente boas produtoras de H₂O₂²⁸. Alguns autores acreditam que deve haver relação entre a espécie e a capacidade de produção de H₂O₂ e que não há relação entre a origem da linhagem (proveniente de mulheres com ou sem VB) e a produção de H₂O₂²².

A não observação de halos verdadeiros indica a ausência de produção de bacteriocinas pelas cepas testadas. A redução de crescimento observada sem o tratamento dos sobrenadantes, e ausente após tratamento, sugere a ação de H₂O₂ e redução de pH por ácidos, ao invés de bacteriocinas.

Das 37 linhagens selecionadas para avaliação da capacidade de adesão, as espécies L. rhamnosus, L. reuteri, L. delbrueckii e L. salivarius e uma de L. fermentum testadas apresentaram porcentagem de adesão maior que 70%; entretanto, estas apresentaram baixa capacidade de produção de H₂O₂. Das linhagens com porcentagem de adesão igual ou maior que 70%, uma da espécie L. crispatus, duas L. jensenii e uma L. gasseri apresentaram também boa produção de peróxido.

A predominância dos lactobacilos tem sido reconhecida como responsável pela manutenção do equilíbrio do ecossistema vaginal. A perda dos lactobacilos pode predispor a mulher à aquisição de infecções geniturinárias. Por esta razão, o uso de lactobacilos selecionados pode ser efetivo na restauração da microbiota vaginal e na prevenção de infecções. Para isso, é necessário identificar corretamente e caracterizar as linhagens de lactobacilos com relação à produção de substâncias inibidoras e quanto à capacidade de adesão às células do epitélio vaginal²⁹.

Para preparação de um produto para a reconstituição da microbiota vaginal, estas linhagens com características mais promissoras devem ser estudadas mais profundamente, quanto às suas propriedades biotecnológicas e ausência de infectividade ou efeitos colaterais, a fim de serem testados e aplicados em humanos²⁹.

Apesar de limitações da metodologia escolhida, a respeito da produção de ácido láctico e do isolamento da espécie L. iners, foi possível caracterizar e identificar todos os isolados.

Em conclusão, este estudo mostrou que as espécies mais prevalentes em mulheres saudáveis, isoladas em meio de cultura seletivo e identificadas por métodos moleculares, são L. crispatus (30,1%), L. jensenii (26,5%), L. gasseri (22,9%) e L. vaginalis (8,4%). Além de mais prevalentes, as espécies L. crispatus, L. jensenii e L. gasseri foram as que atingiram, em média, menores valores de pH (próximos a 4,0) e apresentaram melhor produção de H₂O₂, características sugeridas como importantes para proteção contra várias infecções, principalmente a VB.

Agradecimentos

À Sirlei Morais pela colaboração nas análises estatísticas.

Recebido 9/4/09

Aceito com modificações 29/4/09

Este projeto foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), processo 05/52649-4, pelo Programa de Doutorando no Brasil com Estágio no Exterior (PDEE) - Capes Processo: 4624/06-8 e subsídios do Conselho Nacional de Investigações Científicas e Técnicas da Argentina (CONICET).

Ambulatório de Planejamento Familiar da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP - Campinas (SP), Brasil.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  29 Jun 2009
• Data do Fascículo
  Abr 2009

Histórico

• Recebido
  09 Abr 2009
• Aceito
  29 Abr 2009