Expressão da proteína erbB-2 e dos receptores de hormônios na transição das regiões in situ para invasora de tumores da mama

ErbB-2 expression and hormone receptor status in areas of transition from in situ to invasive ductal breast carcinoma

ARTIGO ORIGINAL

Expressão da proteína erbB-2 e dos receptores de hormônios na transição das regiões in situ para invasora de tumores da mama

ErbB-2 expression and hormone receptor status in areas of transition from in situ to invasive ductal breast carcinoma

Raquel Mary Rodrigues Peres^I; Sophie Françoise Mauricette Derchain^II; Juliana Karina Ruiz Heinrich^III; Kátia Piton Serra^IV; Glauce Aparecida Pinto^V; Fernando Augusto Soares^VI; Luís Otávio Zanatta Sarian^VII

^IPós-graduanda (Doutorado) do Programa de Tocoginecologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP – Campinas (SP), Brasil

^IILivre-docente do Departamento de Tocoginecologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP – Campinas (SP), Brasil

^IIISupervisora da Seção de Laboratórios Clínicos Especializados do Centro de Atenção Integral à Saúde da Mulher da Universidade Estadual de Campinas – CAISM-UNICAMP – Campinas (SP), Brasil

^IVPós-graduanda (Mestrado) do Programa de Tocoginecologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP – Campinas (SP), Brasil

^VSupervisora do Laboratório de Patologia Experimental do Centro de Atenção Integral à Saúde da Mulher da Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP – Campinas (SP), Brasil

^VIProfessor Titular de Patologia Geral da Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo – USP – São Paulo (SP), Brasil. e Diretor do Departamento de Anatomia Patológica do Hospital do Câncer A. C. Camargo, Fundação Antônio Prudente

^VIIProfessor do Departamento de Tocoginecologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP – Campinas (SP), Brasil

^{Correspondência}

RESUMO

OBJETIVOS: avaliar a expressão de erbB-2 e dos receptores hormonais para estrógeno e progesterona (RE/RP) nas regiões de transição entre as frações in situ e invasoras de neoplasias ductais da mama (CDIS e CDI, respectivamente).

MÉTODOS: oitenta e cinco casos de neoplasias mamárias, contendo regiões contíguas de CDIS e CDI, foram selecionados. Espécimes histológicos das áreas de CDIS e de CDI foram obtidos através da técnica de tissue microarray (TMA). As expressões da erbB-2 e dos RE/RP foram avaliadas por meio de imunoistoquímica convencional. A comparação da expressão da erbB-2 e dos RE/RP nas frações in situ e invasoras da mama foi realizada com emprego do teste de McNemar. Os intervalos de confiança foram determinados em 5% (p=0,05). Foram calculados coeficientes de correlação intraclasse (ICC) para avaliar a concordância na tabulação cruzada da expressão de erbB-2 e RE/RP nas frações de CDIS e CDI.

RESULTADOS: a expressão da erbB-2 não diferiu entre as áreas de CDIS e CDI (p=0,38). Comparando caso a caso suas áreas de CDIS e CDI, houve boa concordância na expressão da erbB-2 (coeficiente de correlação intraclasse, ICC=0,64), dos RP (ICC = 0,71) e dos RE (ICC = 0,64). Considerando apenas tumores cujo componente in situ apresentasse áreas de necrose (comedo), o ICC para erbB-2 foi de 0,4, comparado a 0,6 no conjunto completo de casos. Os ICC não diferiram substancialmente daqueles obtidos com o conjunto completo de espécimes em relação aos RE/RP: para RE, ICC=0,7 (versus 0,7 no conjunto completo), e para RP, ICC=0,7 (versus 0,6 no conjunto completo).

CONCLUSÕES: nossos achados sugerem que as expressões de erbB-2 e RE/RP não diferem nos componentes contíguos in situ e invasivo em tumores ductais da mama.

Palavras-chave: Neoplasias da mama/patologia, Neoplasias da mama/metabolismo, Receptor erbB-2/metabolismo , Receptores estrogênicos/metabolismo, Receptores de Progesterona/metabolismo, Invasividade neoplásica

ABSTRACT

PURPOSE: to evaluate the expression of erbB-2 and of the estrogen and progesterone (ER/P) hormonal receptors in the transition regions between the in situ and the invasive fractions of ductal breast neoplasia (ISDC and IDC, respectively).

METHODS: Eighty-five cases of breast neoplasia, containing contiguous ISDC and IDC areas, were selected. Histological specimens from the ISDC and the IDC areas were obtained through the tissue microarray (TMA) technique. The erbB-2 and the ER/PR expressions were evaluated through conventional immunohistochemistry. The McNemar's test was used for the comparative analysis of the expressions of erbB-2 protein and the ER/PR in the in situ and invasive regions of the tumors. The confidence intervals were set to 5% (p=0.05). Intraclass correlation coefficients (ICC) were calculated to assess the cross-tabulation agreement of the erbB-2 and the ER/PR expression in the ISDC and the IDC areas.

RESULTS: the erbB-2 expression has not differed between the ISDC and the IDC areas (p=0.38). Comparing the two areas in each case, there was agreement in the expression of erbB-2 (ICC=0.64), PR (ICC=0.71) and ER (ICC=0.64). Restricting the analysis to tumors with the in situ component harboring necrosis (comedo), the ICC for erbB-2 was 0.4, compared to 0.6 for the whole sample. In this select group, the ICC for PR/ER did not differ substantially from those obtained with the complete dataset: as for the ER, ICC=0.7 (versus 0.7 for the entire sample) and for PR, ICC=0.7 (versus 0.6 for the entire sample).

CONCLUSIONS: our findings suggest that the erbB-2 and the ER/PR expressions do not differ in the contiguous in situ and invasive components of breast ductal tumors.

Keywords: Breast neoplasms/patologia, Breast neoplasms/metabolism, Receptor, erbB-2/metabolism, Receptors, pstrogen/metabolism, Receptors, progesterone/metabolism, Neoplasm invasiveness

Introdução

Recentes evidências apoiam o conceito de que a evolução do carcinoma ductal in situ (CDIS) da mama para a forma invasora (CDI) seja controlada por um pequeno número de genes¹. Mais da metade do CDIS evolui para CDI, apesar da alta variabilidade em termos de tempo para que tal transformação ocorra. De 11 a 20% do CDIS estão associados com CDI quando completamente removidos, e entre 1 e 32% dos casos de recorrência de CDIS ocorrem na forma invasora. As principais alterações nos padrões de expressão gênica ocorrem na transição do tecido mamário normal para CDIS. Na fase de transição de CDIS para CDI, as alterações genômicas são menos intensas². A avaliação histológica se mostrou insuficiente para predizer o potencial de evolução para formas invasoras³, e os mecanismos moleculares responsáveis por esta evolução são pouco conhecidos.

Os marcadores biológicos atualmente usados na predição do prognóstico e planejamento terapêutico para o carcinoma da mama, seja CDIS ou CDI, são os receptores de estrógenos (RE) e progesterona (RP) e a expressão da proteína erbB-2. O gene responsável pela codificação da proteína erbB-2 está amplificado em cerca de 30% dos casos de CDI, e em mais de 60% do CDIS de alto grau. A erbB-2, uma proteína transmembrana, está envolvida em uma série de processos biológicos importantes, como: ciclo celular, apoptose, migração e adesão celular. A erbB-2 pertence à família dos receptores epidérmicos de controle do crescimento (EFGR), tendo função tirosina quinase^4,5. Já o estrógeno é um dos fatores mais importantes na estimulação da multiplicação e desenvolvimento celular no câncer de mama. O RE faz parte da família dos receptores nucleares, e sua forma "alfa" está expressa em mais da metade dos CDI^6,7.

Muitos estudos foram conduzidos com o intuito de avaliar se esses marcadores seriam capazes de predizer o potencial de invasão futura do CDIS, e os resultados foram decepcionantes. A maior parte dos relatos é concordante em afirmar que o estado dos receptores hormonais não é um fator prognóstico de importância no CDIS. O mesmo é verdade com relação à expressão da erbB-2, sendo a maioria dos estudos convergentes para o conceito de que, à parte as demais características histológicas do CDIS, esta proteína não teria valor prognóstico adicional^8-10.

Alguns estudos detectaram que certas áreas de CDI, ao redor de áreas de CDIS com expressão positiva de erbB-2, não expressam a proteína. Este achado levou muitos pesquisadores a suspeitar que a amplificação do gene ERBB2 pode não ser essencial para a progressão do CDIS para CDI¹¹. Entretanto, nenhum estudo examinou a expressão dessa proteína e dos receptores hormonais nas regiões onde ocorre a transformação do CDIS para CDI. Além disso, a maior parte dos estudos disponíveis avaliou grupos diferentes de mulheres com, respectivamente, CDI e CDIS, ou seja, não compararam a expressão dos marcadores em CDIS e CDI no mesmo espécime. O objetivo deste estudo foi, portanto, avaliar a expressão da proteína erbB-2 e dos receptores hormonais nas regiões de transição entre CDIS e CDI. Com esta metodologia, eliminamos fatores de confusão, como backgrounds genéticos diversos (o que ocorreria se os casos de CDI e CDIS fossem obtidos de pacientes diferentes) e clones mutantes diferentes.

Métodos

Pacientes

Para este estudo de corte transversal foram selecionados 107 casos de tumores de mama, contendo regiões contíguas de CDI e CDIS. As pacientes haviam sido tratadas com cirurgia no serviço de mastologia da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) entre 2004 e 2006. As características clínicas e epidemiológicas das mulheres foram obtidas dos prontuários médicos. Foram, então, excluídas da análise 22 mulheres devido a dificuldades técnicas na avaliação concomitante de erbB-2 e dos RE/RP, resultando em uma amostra de 85 casos. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da instituição (CEP #314/2008). Por conta da natureza retrospectiva do estudo, os pesquisadores foram eximidos de obter consentimento informado das mulheres.

A amostra foi composta por mulheres com média etária de 45 anos. Doze mulheres tinham história familiar de câncer de mama, 33 tinham tumores com diâmetro menor que 2,0 cm, e apenas três mulheres tinham doença estágio IV. A maioria (76/85) dos tumores era de alto grau. Considerando os componentes in situ, aproximadamente 38% das lesões foram classificadas como carcinoma e 66% foram consideradas como sendo de alto grau nuclear (grau 3). A maioria (90%) dos componentes CDI foi considerada como "pouco diferenciados" (Tabela 1).

Características dos espécimes

Lâminas para coloração com hematoxilina e eosina foram produzidas a partir dos blocos originais que contivessem regiões contíguas de CDI e CDIS. Um patologista experiente usou essas lâminas para determinar as melhores e mais representativas áreas de CDI e CDIS para a montagem dos tissue microarrays (TMA). Uma das principais preocupações era a de que tais áreas deveriam ser contíguas. Com base nas marcações do patologista, cilindros de tecido com 1 mm de diâmetro foram obtidos dos blocos doadores e arranjados em um único bloco de TMA. As lâminas foram, então, cortadas a partir destes blocos, sobre as quais os testes de imunoistoquímica foram realizados, conforme técnica descrita a seguir.

Técnicas de detecção

As lâminas para imunoistoquímica foram desparafinizadas com xilol e desidratadas em uma série de álcoois. Lavagens em peróxido de hidrogênio foram realizadas, seguidas por lavagens em água destilada. Para recuperação dos antígenos, banhos em vapor foram usados e as lâminas foram imersas em tampão citrato com pH 6,0 durante 30 minutos. As lâminas foram secas em temperatura ambiente e novamente lavadas em água destilada. Após esse procedimento, as lâminas foram incubadas em câmara úmida, com o anticorpo primário específico, a 4ºC (erbB-2: clone CB11/diluição 1:200, Novocastra; RE: clone 6F11/diluição 1:80, Novocastra; RP: clone PGR312/diluição 1:100, Novocastra). As lâminas foram lavadas em PBS pH entre 7,4 e 7,6.

Como sistema de detecção, a lâmina foi incubada em polímero Novolink (Novocastra) a 37ºC por uma hora e lavada em PBS. Depois, foi aplicado substrato DAB (3'-diaminobenzidina, SIGMA, # D5637) na proporção de 0,06 g para 100 mL de PBS, 500 microlitros de peróxido de hidrogênio a 3% de dimetilsulfoxido (DMSO) a 37ºC por cinco minutos. Finalmente, a lâmina foi lavada em água de torneira e contracorada com hematoxilina. Após serem desidratadas, as lâminas foram montadas em resina (Entellan^®). Controles positivos internos e externos foram usados para validar as reações. Os procedimentos de montagem das lâminas de TMA foram realizados no Hospital do Câncer AC Camargo, em São Paulo.

Imunoistoquímica

As colorações para erbB-2 e ER/PR foram avaliadas por um único examinador, que não estava informado sobre as características clínicas e patológicas da doença. Dois conjuntos de TMA foram usados para cada marcador, ou seja, cada área tumoral foi avaliada duplamente. Na análise post-hoc, se os escores diferissem entre cada uma das avaliações, a coloração mais intensa era a considerada. Para a erbB-2, a coloração das membranas celulares foi considerada, enquanto a coloração nuclear foi usada para RE e RP.

A coloração para erbB-2 foi graduada em quatro categorias: 0 (negativo): nenhuma coloração; 1+: coloração em <10% das células tumorais de fraca intensidade; 2+: coloração em 10% a 30% das células tumorais de moderada intensidade, incompleta na membrana; 3+: coloração de forte intensidade, em toda a membrana, em >30% das células tumorais (Figura 1)¹². O percentual de núcleos celulares corados para RE/RP foi categorizado em três grupos: negativo, com menos de 10% dos núcleos corados; 10 a 50% de núcleos corados; >50% de núcleos corados (Figura 2).

Para fins de análise estatística (Tabela 2), os casos foram dicotomizados, com relação à erbB-2, em negativo (negativo, 1+ e 2+) e positivo (3+), e em relação aos RE/RP, como negativos (<10% dos núcleos corados) ou positivos (>10% dos núcleos corados). A classificação completa foi usada na tabulação cruzada entre as áreas in situ e invasora (Tabelas 3 e 4).

Todos os cálculos estatísticos foram realizados com o programa R para computação estatística¹³. A comparação da expressão da erbB-2 e dos RE/RP nas frações in situ e invasoras da mama foi realizada com emprego do teste de McNemar. Os intervalos de confiança foram determinados em 5% (p=0,05). Foram calculados coeficientes de correlação intraclasse (ICC) para avaliar a concordância na tabulação cruzada da expressão de erbB-2 e RE/RP nas frações de CDIS e CDI.

Resultados

Aproximadamente 31% das áreas CDI foram classificadas como 3+ para erbB-2, comparado a 27% nas regiões de CDIS. Aproximadamente 61% das áreas CDI tiveram expressão de RE em >10% dos núcleos, e 69% da CDIS expressou este marcador. Com relação aos RP, 33% das frações CDI expressaram o marcador em >10% das células, contrastando com 49% nas frações de CDIS. A expressão de erbB-2 não diferiu nas regiões de CDIS e CDI (p=0,3). Não houve diferença quanto à expressão de RE (p=0,1). Em contraste, houve desequilíbrio em relação aos RP (p<0,01) (Tabela 2).

Os coeficientes de correlação intraclasse (ICC) mostraram boa concordância na comparação caso a caso da expressão da erbB-2 (ICC=0,6), de RP (ICC=0,7) e dos RE (ICC=0,6) nos componentes CDI e CDIS. Concordância completa (exatamente o mesmo escore) foi mais comum nas extremidades das escalas, isto é, nos escores negativo e 3+ para erbB-2, e negativo ou >50% para os receptores hormonais. A discordância completa, isto é, expressão negativa em um dos componentes contrastando com expressão máxima no outro ocorreu em apenas dois casos para erbB-2, em três para os RE, e nenhum dos RP (Tabela 3).

Considerando apenas tumores cujo componente in situ apresentasse áreas de necrose (comedo), o ICC para erbB-2 foi de 0,4, comparado a 0,6 no conjunto completo de casos. Os ICC não diferiram substancialmente daqueles obtidos com o conjunto completo de espécimes em relação aos RE/RP: para RE, ICC=0,7 (versus 0,7 no conjunto completo) e para RP, ICC=0,7 (versus 0,6) (Tabela 4).

Discussão

Nossos achados sugerem que as expressões da erbB-2 e dos RE/RP são muito semelhantes nas frações in situ e invasora de neoplasias ductais da mama, especialmente na região de transição de um componente para o outro. Nosso estudo examinou a expressão destes marcadores na região de transição entre CDIS e CDI. Com essa estratégia, pudemos avaliar regiões fisicamente vizinhadas, porém, com perfis morfológicos e com potenciais clínicos distintos. É razoável supor que a transformação maligna (obtenção do potencial de invasão) dos carcinomas in situ esteja ocorrendo nestas áreas dos tumores e que, portanto, os processos moleculares que levam a tal transição estejam ativos ali.

Algumas implicações e inferências teóricas podem ser obtidas da análise conjunta de nossos dados com aqueles originados de estudos anteriores. As expressões de receptores esteróides e da proteína erbB-2 são exemplos de fatores preditivos e prognósticos consolidados em patologia mamária, enquanto o papel preditivo e prognóstico das características morfológicas das lesões já foi explorado até seu pleno potencial. As classificações histológicas dos carcinomas in situ da mama têm sido usadas amplamente, e resultaram em algumas informações de relevância clínica. No entanto, o papel da biologia molecular como instrumento auxiliar na avaliação dessas lesões ainda está em estudo. Com relação ao gene ERBB2 (que dá origem à proteína erbB2), sabe-se que sua amplificação em casos de câncer de mama está associada à velocidade de proliferação celular, mobilidade celular, invasividade tumoral, evolução locorregional e através de metástases, angiogênese e redução da apoptose¹⁴. Contudo, a quantidade de informações na literatura sobre a ação deste gene e de sua proteína na passagem do CDIS para CDI é escassa. O conhecimento sobre o papel dos receptores esteroides nesse processo também é muito limitado, o que justifica a realização do presente estudo.

Um estudo recente que analisou a assinatura genética de células epiteliais em tumores com componentes in situ e invasor concomitantes demonstrou que ambos os componentes são muito semelhantes. Em contraste, células isoladas de CDIS puro tinham assinaturas muito diferentes daquelas de células encontradas em CDI puro¹⁵. Esses autores propuseram duas explicações para seus achados: um pequeno número de genes regula a transição de CDIS para CDI, e as alterações moleculares relacionadas à transição da forma CDIS para a CDI precedem em muito tempo as alterações morfológicas detectadas ao microscópio. Essas são explicações perfeitamente aplicáveis aos nossos achados, embora tenhamos que adicionar que, se elas estiverem corretas, é provável que as alterações moleculares que ocorrem antes das transformações morfológicas persistam inalteradas na forma invasora do tumor.

Existem outras linhas atuais de evidência sugerindo o mesmo processo, ou seja, que a manifestação histológica de invasão só ocorre após grandes alterações em nível molecular. Essas alterações moleculares devem se somar aos fatores do microambiente (decorrentes da ação de células mioepiteliais e estromais) para que o CDIS evolua para CDI¹⁶. Os fatores do microambiente podem explicar porque alguns CDIS progridem para CDI, enquanto outros CDIS não progridem, embora possuam semelhantes perfis moleculares.

É importante ressaltar que nosso estudo demonstrou que a proteína erbB-2 não está envolvida na aquisição da capacidade de invasão pelos tumores de mama. Em concordância com outros estudos^11,15,17,18, podemos afirmar que os componentes CDIS e CDI de um determinado tumor mamário costumam ter perfis moleculares semelhantes.

Estudos anteriores sugerem que clones celulares com funções biológicas associadas à invasão podem ser gerados a partir da perda de expressão de RE e aumento da expressão de erbB-2^19,20. Concomitantemente à perda da expressão de RE e aumento da expressão da proteína erbB-2, tais clones passariam a expressar vários genes relacionados à perda da capacidade de apoptose e aquisição de potencial de invasão. Esses achados foram obtidos a partir da análise comparativa entre células tumorais recobrindo áreas de membrana mioepitelial íntegra com células encontradas nas circunvizinhanças de áreas de invasão. Nossos achados não estão em concordância com esses estudos, pois não detectamos diferenças de expressão da erbB-2 e dos RE/RP nas regiões de transição entre CDIS e CDI.

A associação da erbB-2 com achados patológicos específicos da mama foi estudada amplamente na última década. A maior expressão da erbB-2 tem sido consistentemente associada a maiores graus de necrose tipo "comedo" em CDIS^21-24. A positividade para erbB-2 em CDIS variou de 24 a 38%, discretamente acima daquela em tumores invasores. Nós detectamos a mesma tendência em nossa amostra. É importante citar que a maior proporção de casos positivos para erbB-2 em nossa amostra, comparada àquela relatada em outros estudos, pode ser decorrente de características clínicas e epidemiológicas, posto que temos alta proporção de casos de alto grau e doença avançada.

Alguns aspectos metodológicos do nosso estudo precisam ser discutidos. O uso da imunoistoquímica pode ser aplicado com segurança em combinação com a técnica do TMA, que foi descrita pela primeira vez em 1998²⁵, sendo que as vantagens do uso de TMA são o baixo consumo de reagentes e uniformidade da reação em diferentes amostras²⁵. Em nosso estudo, a técnica TMA também permitiu a obtenção de amostras em regiões precisas dos tumores de mama, o que tornou viável a avaliação da região de transição CDIS-CDI.

Em essência, nossos achados confirmam a tese de que nem o status da proteína erbB-2 nem a expressão dos RE e RP desenvolvem um papel significativo na progressão do CDIS para o CDI. Nosso estudo, sendo a primeira tentativa de avaliar a zona de transição de um componente para o outro, avalia uma região em que importantes processos moleculares estariam, ao menos em tese, em pleno andamento.

Agradecimentos

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, processo 2008/08536-9) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, processo 307988/2008-2) pelo suporte financeiro.

Ao Departamento de Anatomia Patológica do Hospital do Câncer A. C. Camargo, Fundação Antônio Prudente, agradecemos pela preparação dos blocos de "tissue microarray" e pela preparação das lâminas para avaliação dos marcadores.

Recebido 22/7/09

Aceito com modificações 18/8/09

Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP – Campinas (SP), Brasil.

Os autores declaram não haver conflito de interesse.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  21 Out 2009
• Data do Fascículo
  Set 2009

Histórico

• Aceito
  18 Ago 2009
• Recebido
  22 Jul 2009