Efeitos da administração diária da associação estavudina/nelfinavir sobre os fetos e placentas da rata albina

Effects of daily administration of a stavudine/nelfinavir association on the fetuses and placentas of female albino rats

ARTIGO ORIGINAL

Efeitos da administração diária da associação estavudina/nelfinavir sobre os fetos e placentas da rata albina

Effects of daily administration of a stavudine/nelfinavir association on the fetuses and placentas of female albino rats

Gisela Maria Vieira Rodrigues de Carvalho^I; Mary Uchiyama Nakamura^II; Ricardo Santos Simões^III; Eliana Maria Restum Antonio^I; Adriana Wagngner^I; Tereza Maria Pereira Fontes^I; Luiz Kulay Júnior^IV

^IPós-Graduanda do Departamento de Obstetrícia da Escola Paulista de Medicina da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP – São Paulo (SP), Brasil

^IIProfessora Associada do Departamento de Obstetrícia da Escola Paulista de Medicina da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP – São Paulo (SP), Brasil

^IIIPós-Graduando do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo – USP – São Paulo (SP), Brasil

^IVProfessor Titular do Departamento de Obstetrícia da Escola Paulista de Medicina da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP – São Paulo (SP), Brasil

^{Correspondência}

RESUMO

OBJETIVO: avaliar o efeito da administração da associação estavudina/nelfinavir durante toda a prenhez da rata, avaliando seu peso e dos conceptos, bem como o número de implantações, fetos, placentas, reabsorções e mortalidades materna e fetal.

MÉTODOS: quarenta ratas albinas EPM-1 Wistar, prenhes, foram aleatoriamente divididas em quatro grupos: GCtrl (controle do veículo) e três experimentais, ExpI, ExpII e ExpIII, que receberam, respectivamente, 1/40, 3/120 e 9/360 mg/kg por dia de estavudina/nelfinavir por via oral. As drogas e o veículo (água destilada) foram administrados por gavagem em duas tomadas diárias (12/12 horas), desde o dia 0 até o 20º dia da prenhez. No último dia do experimento, todos os animais foram anestesiados e eutanasiados. Foram avaliados a evolução do peso materno no 7º, 14º e 20º dias, número de fetos, placentas, implantações, reabsorções, óbitos intrauterinos, malformações maiores e o peso dos fetos e das placentas. A análise estatística foi realizada por análise de variância (ANOVA), complementada pelo teste de Kruskal-Wallis (p<0,05).

RESULTADOS: em relação ao peso corporal das ratas, houve ganho gradual e progressivo durante o decorrer da prenhez em todos os grupos, sendo este ganho mais evidente no período final; porém não foram constatadas diferenças estatisticamente significantes entre eles. O número de fetos, placentas, implantações, assim como os pesos fetais e placentários também não mostraram diferenças estatisticamente significantes entre os grupos analisados. Não foram observadas, também nos grupos experimentais, reabsorções e malformações fetais maiores externas, no entanto, observamos entre o 8º e o 14º dias de gestação um caso de morte materna em cada grupo experimental.

CONCLUSÕES: a administração da associação estavudina/nelfinavir não mostrou efeitos deletérios sobre os conceptos.

Palavras-chave: Estavudina, Nelfinavir/Efeitos adversos, Anti-retrovirais, Ratos, Prenhez

ABSTRACT

PURPOSE: to evaluate the effect of administration of a stavudine/nelfinavir combination on the rat pregnancy by assessing maternal and concepts weights, as well as the number of implantations, fetuses, placentas, resorptions and maternal and fetal mortality.

METHODS: forty adult pregnant Wistar rats of the EPM-1 strain were randomly divided into four groups: control (GCtrl – drug vehicle control, n=10), and three experimental groups, which were treated with an oral solution of stavudine/nelfinavir (ExpI – 1/40 mg/kg b.w., n=10; ExpII – 3/120 mg/kg b.w., n=10; ExpIII – 9/360 mg/kg b.w., n=10) from day 0 to the 20th day of pregnancy. Maternal body weights were determined at the start of the experiment and on the 7th, 14th and the 20th day thereafter. At term (20th day) the rats were anesthetized and, upon laparotomy and hysterotomy, the number of implantations, resorptions, living fetuses, placentae and intrauterine deaths were recorded. The collected fetuses and placentae were weighed and the concepts were examined under a stereomicroscope for possible external malformations. Statistical analysis was performed by analysis of variance (ANOVA) complemented by the Kruskal-Wallis test (p<0.05).

RESULTS: there was a progressive and gradual increase in body weight during the course of pregnancy in all groups, which was more evident in the final period, but with no significant difference between groups. The mean number of fetuses, placentas, implantations, and fetal and placental weights showed no significant differences between groups. Also, no resorptions or external malformations were found in the experimental groups. However, between the 8th and 14th days of gestation, there was one case of maternal mortality in each experimental group.

CONCLUSIONS: the administration of a stavudine/nelfinavir combination had no deleterious effects on the concepts.

Keywords: Stavudine, Nelfinavir/Adverse effects, Anti-retroviral agents, Rats, Pregnancy, animal

Introdução

Com a facilidade de diagnóstico da síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA/AIDS), do parto cesáreo programado, a suspensão do aleitamento materno e a terapia antirretroviral combinada de alta potência, denominada highly active antiretroviral therapy (HAART) ocorreu redução acentuada da transmissão vertical do vírus da imunodeficiência humana (HIV) aumentando muito a sobrevida do recém-nato^1-3. Esta terapia compreende a associação de drogas e promove importante e sustentada supressão da replicação viral, aumentando a sobrevida dos pacientes soropositivos e, consequentemente, a prevalência dessa infecção⁴. A redução da mortalidade é particularmente evidente em países industrializados de alta renda onde o acesso aos cuidados de saúde e tratamentos antirretrovirais são facilitados⁵.

Recentemente o Programa das Nações Unidas sobre HIV/AIDS da Organização Mundial da Saúde UNAIDS/OMS estimou que a epidemia global da AIDS, em 2009, atingiu cerca de 33,3 milhões de pessoas, sendo destes, 10 milhões (9 – 11 milhões) em países de média e baixa renda e que necessitavam urgentemente da terapia antirretroviral (TARV)⁶. Assim o acesso à TARV é uma "emergência de saúde global", pois além de melhorar e prolongar a vida dos indivíduos infectados, reduz a transmissão do HIV. Neste sentido, o custo da terapia antirretroviral combinada de alta potência diminuiu devido a várias iniciativas internacionais⁷. Em vários países em desenvolvimento, o National AIDS Control Organization (NACO) já introduziu medicamentos baratos e genéricos, de tal maneira que um número crescente de indivíduos infectados pelo HIV estão recebendo tratamento⁸.

No entanto, deve-se salientar que estudos que avaliem a segurança desses medicamentos durante a gravidez ainda são necessários, especialmente quanto à sua toxicidade e potencial teratogênico. Dentre essas substâncias interessamo-nos pela estavudina e o nelfinavir.

A estavudina (d4T) é um medicamento que já foi considerado de primeira linha nos países em desenvolvimento. É relativamente barata e fácil de usar. É um nucleosídeo sintético análogo à timidina. Atua como agente antirretroviral que inibe a transcriptase reversa do HIV devido à competição com o substrato natural, o trifosfato de timidina. Inibe também a síntese do DNA viral devido à ausência do grupo 3'-hidroxil, que é necessário à elongação da cadeia⁹. No entanto, a Organização Mundial da Saúde (OMS), na década de 90, recomendou aos países que, gradualmente, substituíssem a estavudina por alternativas menos tóxicas e "igualmente eficazes" como a zidovudina (AZT) ou o tenofovir (TDF), pois essa droga gera distúrbios neurológicos, causando formigamento e queimação nas mãos e pés, além da distribuição anormal de gordura corporal (lipodistrofia), sequelas que foram consideradas "incapacitantes e desfigurantes"^1,2. No entanto, essa substância ainda vem sendo utilizada em combinação com outros antirretrovirais nos países em desenvolvimento¹⁰.

Já o nelfinavir, um antirretroviral inibidor de protease, aprovado em 1997 para o tratamento de indivíduos infectados pelo HIV-1 e HIV-2, foi um dos mais prescritos em adultos, adolescentes e crianças com idade acima de dois anos, sendo usado nas gestações com menos de 28 semanas e com carga viral mais acentuada¹. No entanto, devido à contaminação do produto em 2008, determinou-se suspensão de sua venda, uma vez que interfere nos genes da replicação viral, alterando a estrutura de precursores das poliproteínas Gag e Gag-pol que alteram a configuração do capsídeo, levando à formação de vírus imaturos e não infectantes¹¹.

Apesar do nelfinavir estar sendo susbstituído pela segunda geração de inibidores de protease do HIV, que permitem melhores tratamentos em combinação com outros antirretrovirais, esta droga volta a ser foco de interesse devido a efeito paradoxal: o nelfinavir estimula a apoptose de células tumorais e a morte celular por mecanismo independente das mitocôndrias, ligado ao retículo endoplasmático, é o denominado estresse do retículo endoplasmático¹². Além disto, foram descritos efeitos antimicrobianos, incluindo eficácia contra a malária, tuberculose e síndrome respiratória aguda (SARS). Estudos clínicos com o nelfinavir referem que o mesmo poderia ser utilizado nas estratégias de tratamento do câncer, funcionando como um quimioterápico¹³.

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ação da associação estavudina/nelfinavir em ratas prenhes e sua prole, partindo da constatação da ação lesiva da estavudina e da ação protetora do nelfinavir.

Métodos

Foram utilizadas ratas albinas da linhagem EPM-1 Wistar (Rattus norvegicus albinus) de aproximadamente 90 dias de idade, virgens, pesando aproximadamente 200g, oriundas da Central de Desenvolvimento de Modelos Experimentais para Medicina e Biologia (CEDEME) da Universidade Federal de São Paulo/Escola Paulista de Medicina (UNIFESP/EPM), onde o experimento se desenvolveu após aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) (Parecer nº 1517/06).

Foram acomodados cinco animais em cada gaiola e mantidos em biotério sob temperatura ambiente de 22ºC, iluminação artificial fluorescente, com fotoperiodiocidade 12/12h (7 às 19h – claro), oferta de ração balanceada para ratos e água ad libitum. Após período de adaptação de 15 dias, foram acasalados na proporção de um macho para duas fêmeas, por um período de 2 horas. O diagnóstico da prenhez foi realizado pela identificação de espermatozóides na luz da vagina. O período de 24 horas logo após o acasalamento foi considerado dia 0 da prenhez14.

Em seguida, as 40 ratas prenhes foram distribuídas aleatoriamente em quatro grupos, a saber: um controle (GCtrl) tratado com água destilada; e três experimentais ExpI, ExpII e ExpIII, que receberam durante toda a prenhez, respectivamente, 1, 3 e 9 mg/kg de estavudina (d4T) (Stavudine^® Bristol-Myers Squibb Canada Inc.) associado a 40, 120 e 360 mg/kg de mesilato de nelfinavir (NFV) (Viracept^® Laboratório Roche). O veículo e as drogas foram administrados por gavagem, duas vezes ao dia (12/12 h), num volume final de 1,0 mL, iniciando-se no dia zero até o termo da prenhez.

Todos os animais foram pesados nos dias 0, 7º, 14º e 20º da prenhez, sendo os dados expressos em ganho percentual que foram calculados de acordo com a seguinte fórmula:

∆%=(peso no dia X - peso inicial) x 100/peso inicial; onde X representa os dias da pesagem (7°, 14° e 20°).

Ao termo (20º dia), todas matrizes foram anestesiadas usando-se uma mistura de cloridrato de xilazina 20 mg/kg (Rompun^®) e cloridrato de quetamina 10 mg/kg (Ketalar^®), por via intraperitoneal. Sob efeito anestésico, foi realizada laparotomia xifopúbica seguida de histerotomia, sendo anotados os seguintes parâmetros: número de sítios de implantação e de reabsorção, número de placentas e de fetos vivos ou mortos, pesos das placentas e dos fetos. Em seguida, os fetos foram detalhadamente e cuidadosamente examinados sob lupa estereoscópica para detectar a presença de malformações maiores externas (encurtamento de membros, espinha bífida, fenda palatina, hipospádia e lábio leporino).

Os resultados foram inicialmente submetidos a análise de variância (ANOVA) e posteriormente analisados por comparações múltiplas pelo teste de Kruskal-Wallis. O nível de rejeição para hipótese de nulidade foi fixado em 5%.

Resultados

Comparando-se os quatro grupos estudados em relação ao ganho de peso corporal desde o início do experimento (dia 0), notou-se ganho ponderal durante todo o período de prenhez, nos vários grupos de estudo. O maior ganho ocorreu no último terço de gestação, no entanto, não foram constatadas diferenças estatiscamente significantes entre os valores registrados, embora o maior ganho de peso tenha sido observado no grupo ExpIII (Figura 1). As médias do número de fetos foram: GCtrl=11,3±2,4; ExpI=11,5±1,4; ExpII=12,0±2,1 e ExpIII=9,7±3,5. Igualmente, não foram observadas diferenças estatisticamente significantes quanto ao peso das placentas – GCtrl=0,6±0,1 g; ExpI=0,6±0,1 g; ExpII=0,61±0,05 g e ExpIII=0,69±0,24 g – ou dos fetos – GCtrl=3,85±0,31 g; ExpI=4,4±0,4 g; ExpII=4,4±0,3 g e ExpIII=4,3±0,3 g. Não foram encontradas malformações fetais maiores externas. No entanto, observamos entre o 8º e o 14º dias da gestação um caso de mortalidade materna em cada grupo experimental e uma morte fetal no ExpI (Tabela 1).

Discussão

Embora o financiamento para terapia de alta potência tenha se expandido nos últimos anos, os recursos com saúde ainda são limitados, especialmente nos países em desenvolvimento. Os custos do tratamento da AIDS, sobretudo, são altos. Assim, os agentes de primeira escolha mais utilizados nos países em desenvolvimento são os mais comuns e baratos tais como AZT, d4T, DDI e NVP. Estes são antirretrovirais genéricos produzidos geralmente por empresas farmacêuticas localizadas na China¹⁵, onde o custo de produção é muito mais barato. Em vista disto, resolvemos estudar a ação da associação estavudina/nelfinavir na prenhez da rata, com a finalidade de averiguar os possíveis efeitos indesejáveis dessa associação.

As drogas utilizadas foram administradas durante todo o período de prenhez (do dia 0 ao 20º dia de prenhez). Desta forma, pretendíamos avaliar as fases de nidação e embriogênese (até o 14º dia) e o desenvolvimento fetal (a partir do 15º dia), sempre com foco nos possíveis efeitos deletérios da associação medicamentosa sobre as matrizes e suas crias. Para o ExpI, as doses de d4T/NFV foram proporcionalmente semelhantes às recomendadas para uso terapêutico em humanos, isto é, respectivamente 1 mg/kg de d4T e 40 mg/kg de NFV por dia. Já em ExpII e ExpIII os animais foram tratados com doses três e nove vezes superiores à dose menor. Esta conduta fundamentou-se no fato de que o metabolismo hepático da rata é três vezes mais rápido que o dos humanos e também porque a depuração renal destes animais é duas vezes mais rápida^14,16-18.

Com relação ao ganho de peso materno obtido nos 7º, 14º e 20º dias, que correspondem às fases finais desses 3 períodos, não foram observadas diferenças estatisticamente significantes entre os grupos estudados. Deve-se frisar que a análise do peso inicial não mostrou diferença estatisticamente significante entre os quatro grupos estudados, mostrando uma boa homogeneização dos animais utilizados. Em todos os grupos estudados, a análise do ganho de peso percentual ao logo da prenhez traduziu uma curva de normalidade não homogênea, característica do ganho ponderal das matrizes no decorrer da gestação, com aumento gradativo até o 14º dia e, a seguir, aumento exponencial até o 20º dia, sendo concordantes com inúmeros trabalhos da literatura que relataram que a última semana de prenhez na rata é a fase de maior ganho ponderal^14,17,19-21.

Em estudo com uso isolado de d4T, nas mesmas doses de nossa pesquisa (1, 3 e 9 mg/kg), foi observado discreto aumento de ganho ponderal no 20º dia no grupo tratado com a maior dose do antirretroviral. No entanto, não foi encontrada significância estatística²⁰. O mesmo fato ocorreu com a administração de NFV; durante a prenhez das ratas^22,23.

Como a principal toxicidade da d4T é a neuropatia periférica, acreditávamos que as doses maiores poderiam levar a uma diminuição da atividade de locomoção. É bem estabelecido que a neuropatia periférica habitualmente se traduz em muitas dores nas extremidades corpóreas durante locomoção. Imaginávamos que, em decorrência destes sintomas dolorosos, haveria diminuição de locomoção por parte das ratas com consequente diminuição do gasto energético e aumento de peso. Contudo, isto não ocorreu em nosso experimento. Estudo prospectivo randomizado mostrou que os inibidores da transcriptase reversa, em especial a d4T, estão associados à diminuição do tecido subcutâneo²³. Estudos recentes recomendam a utilização da d4T na terapia antirretroviral de alta potência, em dosagens menores que as inicialmente preconizadas, o que inibiria a ocorrência da lipodistrofia^10,24.

A implantação e desenvolvimento da placenta e do embrião são dependentes do óxido nítrico nos mecanismos de invasão trofoblástica, no entanto, é sabido que alguns antirretrovirais, como a d4T, podem atuar em mecanismos intercelulares, interferindo na ação desse potente vasodilatador, ocasionando falhas na reprodução²⁵. Porém, estudos utilizando NFV não demonstraram efeito embriotóxico deste fármaco^21,25,26. Por outro lado, o NFV foi responsabilizado pela elevação da taxa de perda pós-implantação e redução na taxa de viabilidade fetal, como também pela diminuição do número de fetos por ninhada²².

Deve ser mencionado que as complicações mais temíveis relatadas com o uso de d4T são o óbito por acidose lática em mulheres grávidas ou no período puerperal, a pancreatite e a hepatite medicamentosa, e estes efeitos ocorrem principalmente quando esse fármaco está associado a outro ARV²⁷.

Em nosso experimento encontramos um óbito materno em cada grupo experimental, que ocorreu provavelmente devido ao processo de administração da droga. No entanto, outros autores, utilizando d4T por gavagem na dose de 97,5 mg/dia desde o dia inicial ao 21º dia de prenhez observaram, em ratas, aumento significativo nas taxas de perdas pós-implantação e redução significativa nas taxas de viabilidade fetal e no número de fetos por ninhada²⁸.

Com relação aos parâmetros fetais (número de fetos, peso e malformações maiores), placentários (número de placentas, peso e implantações) assim como mortes maternas e fetais nos vários grupos de estudo, apesar de haver uma morte materna em cada um dos grupos experimentais, este fato não mostrou significância estatística entre os vários grupos de estudo. A d4T ministrada em altas doses (60, 240 ou 480 mg/kg) a camundongas desde o 6º até o 16º dias de prenhez, induziu o aparecimento de malformações fetais tais como fenda palatina e hidrocefalia²⁹, no entanto, outro estudo refere que o uso isolado da d4T durante a prenhez da rata, embora sem resultados estatisticamente significantes, revelaram aumento do número de implantações e reabsorções fetais no grupo exposto à dose de 9 mg/kg²⁰.

O NFV é um inibidor de protease viral com especificidade para o vírus HIV, utilizado com muita frequência nos esquemas de antirretrovirais combinados para as gestantes infectadas. Recentemente, foi relatado que também inibe a ação da glicoproteína Gp41 viral indutora de apoptose nas células placentárias normais, envolvendo a caspase 3 pela via mitocondrial. Além disto, estimula a morte de células tumorais por mecanismo relacionados ao retículo endoplasmático, denominado de estresse do retículo endoplasmático¹². Por outro lado, pouco se sabe sobre as repercussões desse fármaco sobre a gestação. Parece ter poucos efeitos colaterais, entre os quais os mais comuns são os distúrbios gastrointestinais de leve intensidade, além de possuir praticidade posológica de duas tomadas diárias, o que facilita a adesão ao tratamento. No ano de 2007, esta substância foi retirada parcialmente do mercado devido a indícios de contaminação durante sua produção com o metano sulfato de etila, agente cancerígeno^30,31.

Muitos estudos têm relatado que a exposição intrauterina a antirretrovirais, principalmente aos inibidores da protease (IsP), pode estar relacionada a prematuridade e baixo peso ao nascer. O aumento da expressividade da glicoproteína P (P-gp) está diretamente relacionado ao período de duração do uso dos IsP e, consequentemente, sua queda na concentração intracelular. A P-gp está situada na superfície materna da placenta e sua função é expulsar xenobióticos das células trofoblásticas de volta à circulação materna, limitando a exposição fetal às drogas. Ela é codificada pelos genes MDR presentes em humanos e roedores. Em ratas, a concentração destes genes foi demonstrada em torno do 11º dia de gestação e sua expressão eleva-se com o evoluir da gestação até níveis máximos, observados ao final da prenhez. Seu objetivo é proteger o feto de possíveis efeitos nocivos desses xenobióticos nas trocas materno fetais^32,33.

Assim, esta pesquisa procurou estudar os possíveis efeitos da administração diária da associação estavudina/nelfinavir sobre as ratas prenhes e seus conceptos, especialmente sob o aspecto toxicidade no desenvolvimento fetal. Acreditamos que os objetivos da pesquisa foram alcançados e consistentemente demonstrados. Concluímos que a associação estavudina/nelfinavir em todas as doses ministradas não interferiu no ganho de peso das ratas prenhes e não mostrou efeitos deletérios sobre os conceptos.

Recebido 09/05/2011

Aceito com modificações 30/05/2011

Conflitos de interesse: não há.

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Correspondência:

Luiz Kulay Júnior

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  15 Ago 2011
• Data do Fascículo
  Maio 2011

Histórico

• Recebido
  09 Maio 2011
• Aceito
  30 Maio 2011