Resposta imune específica de bovinos experimentalmente sensibilizados com inóculos inativados de Mycobacterium bovis e Mycobacterium avium

Specific immune response of cattle to experimental sensibilization by inactivated Mycobacterium bovis and Mycobacterium avium

Resposta imune específica de bovinos experimentalmente sensibilizados com inóculos inativados de Mycobacterium bovis e Mycobacterium avium

Specific immune response of cattle to experimental sensibilization by inactivated Mycobacterium bovis and Mycobacterium avium

Robson F.C. Almeida^I; Claudio R. Madruga^II; Cleber O. Soares^II; Marta C. Fernandes^III; Nilton M. Carvalho^IV; Klaudia S.G. Jorge^V; Ana Luiza A.R. Osório^V,*

^IMestrando do Programa Ciência Animal da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS)

^IIEmbrapa Gado de Corte, Caixa Postal 154, Campo Grande, MS 79002-970

^IIIAcadêmica de Medicina Veterinária, UFMS

^IVLaboratório de Anatomia Patológica, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FAMEZ), UFMS, Cidade Universitária, Campo Grande, MS 79002-900

^VLaboratório de Micobacteriologia da FAMEZ, UFMS

RESUMO

O diagnóstico presuntivo da tuberculose bovina é baseado na análise da resposta imune celular a antígenos micobacterianos. Procedeu-se à simulação experimental de sensibilização por Mycobacterium bovis e Mycobacterium avium inativados em bovinos a fim de acompanhar a resposta imune a partir do teste cervical comparativo e da evolução da produção específica de interferon-gama, além de identificar a interferência de reações inespecíficas por M. avium nos resultados dos testes. Verificou-se que os animais desencadearam resposta de hipersensibilidade tardia contra os bacilos inativados, e que ambos os testes diagnósticos da tuberculose bovina foram eficientes na identificação dos animais sensibilizados com M. bovis e na discriminação das reações geradas pela inoculação dos bovinos com M. avium.

Termos de indexação:Mycobacterium bovis, Mycobacterium avium, interferon-gama, tuberculina, resposta imune.

ABSTRACT

The presumptive diagnosis of bovine tuberculosis is based on analysis of the immune response to micobacterial antigens. This experimental simulation of sensibilization by Mycobacterium bovis and Mycobacterium avium in cattle aimed to verify the immune response by both the cervical comparative test and the evolution of the specific production of gamma-interferon, and also to identify interference of unspecified reactions by M. avium on the test results. The results support that the experimental animals started a response of delayed hypersensitivity to the inactivated bacilli, and that both diagnostic tests for bovine tuberculosis were efficient for the identification of animals sensitized with M. bovis and for discrimination of reactions generated by inoculation of cattle with M. avium.

Index Terms: Mycobacterium bovis, Mycobacterium avium, gamma-interferon, tuberculin, immune response.

INTRODUÇÃO

A tuberculose bovina é uma doença infecto-contagiosa de evolução crônica, determinada por Mycobacterium bovis, que provoca lesões granulomatosas e infecta outros animais de exploração zootécnica, animais silvestres e de zoológico e também o homem (Acha & Szyfres 1986, Pritchard 1988, Corrêa & Corrêa 1992).

O agente causal desta infecção é um bacilo intracelular facultativo, que com outras micobactérias causadoras de tuberculose em mamíferos, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium canettii e Mycobacterium microti, constituem o "complexo Mycobacterium tuberculosis" (Shinnick & Good 1994, Wards et al. 1995, Roxo 1996, Miltgen et al. 2002). Dentre as espécies de micobactérias não tuberculosas (Runyon 1959), as mais estudadas são as do complexo M. avium-intracellulare (MAC) e M. kansasii (Inderlied et al. 1993, Evans et al. 1996, Mijs et al. 2002, Biet et al. 2005). M. avium é subdividido em quatro subespécies (ssp.): ssp. avium, ssp. paratuberculosis, ssp. silvaticum e, recentemente, ssp. hominissuis (Mijs et al. 2002, Biet et al. 2005). M. avium é o agente da tuberculose em várias espécies de aves, e o complexo M. avium-intracellulare está associado aos quadros de linfadenites granulomatosas em suínos. As bactérias desse complexo não são patogênicas para os bovinos e bubalinos, com exceção de M. avium ssp. paratuberculosis, causador da doença de Johne (Biet et al. 2005), raramente encontrada no Brasil (Riet-Correa 1998, Driemeier et. al. 1999). Entretanto, provocam reações inespecíficas à tuberculinização, dificultando o diagnóstico da tuberculose nessas espécies (Brasil 2003).

O diagnóstico presuntivo da tuberculose bovina é realizado por meio de testes tuberculínicos. Tais testes foram desenhados para determinar a infecção espécie-específica por M. bovis. Por essa razão, a inoculação intradérmica de pequenas quantidades de antígenos micobacterianos gera em 24-72h uma reação inflamatória local naqueles animais que responderam imunologica-mente à infecção prévia por M. bovis. A resposta é mediada por linfócitos T (Th1) que migram ao sítio de injeção do antígeno e reconhecem os peptídeos apresentados em conjunção com o complexo de histocompatibilidade principal (MHC) de Classe II na superfície celular de macrófagos. Os linfócitos Th1 liberam citocinas, tais como interleucina-2 (IL-2) e interferon-gama (IFN-g), que agem sobre o endotélio vascular recrutando células do sistema imune para o sítio de deposição do antígeno (Janeway & Travers 1997). O recrutamento de linfócitos Th1, fagócitos, fluidos e proteínas produz uma lesão visível (Janeway & Travers 1997, Tizard 2002, Wedlock et al. 2002).

No local da inoculação ocorre edema endurecido, que resulta do processo inflamatório, da deposição de fibrina e da trombose local, o qual atinge sua maior intensidade por volta de 72h (Monaghan et al. 1994). Esse edema pode persistir por semanas ou desaparecer gradualmente. Nas reações muito severas, podem ocorrer destruição e necrose tecidual no local da injeção (Monaghan et al. 1994, Tizard 2002). No exame histológico, a reação revela infiltrado de células mononucleares, principalmente macrófagos e linfócitos, e de poucos neutrófilos (Macruz & Bueno 1963, Monaghan et al. 1994, Roxo et al. 1998, Tizard 2002).

As tuberculinas disponíveis para o diagnóstico indireto in vivo da tuberculose bovina são extratos antigênicos de proteínas purificadas, conhecidas como PPD (purified protein derivative), de isolados AN5 de M. bovis (PPD bovino) e D4 de M. avium (PPD aviário). Embora as tuberculinas sejam descritas como puras, elas são formadas por uma mistura complexa de proteínas, lipídeos, açúcares e ácidos nucléicos, o que inclui uma grande variedade de antígenos, alguns comuns a várias espécies de micobactérias (Monaghan et al. 1994), sendo este um fator que contribui para as reações inespecíficas.

Os testes tuberculínicos podem ser simples ou comparativos. O teste tuberculínico simples utiliza apenas a tuberculina bovina (teste da prega caudal - TPC ou o teste cervical simples - TCS), enquanto o teste cervical comparativo (TCC) utiliza as tuberculinas bovina e aviária de forma simultânea. O TCC é mais específico que os testes simples, pois permite distinguir infecção por M. bovis do "complexo MAC" e micobactérias ambientais (OIE 1992, Brasil 2003, Waters et al. 2003).

Recentemente, vários testes in vivo e in vitro para o diagnóstico da infecção por M. bovis foram desenvolvidos, tais como a hipersensibilidade com ESAT-6 (Pollock et al. 2003), linhagens de macrófagos (Ritelli et al 2003), aglutinação em látex (Koo et al. 2004), testes de imunoadsorção enzimática - ELISA (Dunn et al. 2005) e a reação da polimerase em cadeia - PCR (Zumarraga et al. 2005). Entretanto, o que vem sendo mais avaliado é a detecção de IFN-g bovino. O ensaio é realizado in vitro e é baseado na detecção de IFN-g liberado por linfócitos sensibilizados durante incubação com material antigênico que contém antígenos espécie-específicos (Walravens et al. 2002). Os animais infectados com M. bovis têm linfócitos Th1 sensibilizados aos antígenos desta micobactéria e liberam IFN-g que será detectado no plasma por ELISA de captura com anticorpo monoclonal (Wood et al. 1990, 1992, Wood & Rothel 1994, Scacchia et al. 2000, Wood & Jones 2001, Walravens et al. 2002, Waters et al. 2003).

Os testes indiretos para o diagnóstico da tuberculose bovina são influenciados por fatores biológicos, como a cinética da resposta imune natural induzida pela infecção e reações cruzadas com outros microorganismos que interferem com a especificidade e a mensuração da resposta (Walravens et al. 2002, Cagiola et al. 2004, Gormley et al. 2004).

Os objetivos deste trabalho foram acompanhar a resposta celular aos testes indiretos (IFN-g e TCC) e identificar a interferência de reações inespecíficas por M. avium nos resultados desses testes após sensibilização experimental de bovinos por M. bovis e M. avium inativados.

MATERIAL E MÉTODOS

Animais experimentais e inóculo

Utilizaram-se 26 bovinos mestiços (cruzamento industrial e pardo suíço), machos de 16-20 meses de idade, em bom estado geral e negativos no TCC. Apenas um dos animais (Bov.17) foi reagente para Mycobacterium avium. Os animais ficaram em regime extensivo no hospital veterinário da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS).

Dos 26 bovinos utilizados no experimento, 16 foram sensibilizados com 10mg de inóculo inativado da amostra AN5 de M. bovis e três com 10mg da amostra D4 de M. avium, cedidos pelo Laboratório Regional de Apoio Animal - Lara/MG. A inoculação foi realizada na região da barbela por via subcutânea. Os sete animais restantes integraram o grupo-controle negativo para os testes de imunoadsorção enzimática para detecção de interferon-gama (IFN-g) bovino e do TCC.

Detecção de interferon-gama bovino

Em todos os animais, o sangue foi coletado a partir do dia da inoculação (antes da sensibilização) e a cada 15 dias até o 60º dia pós-inóculo. A coleta foi feita em tubos heparinizados, mantidos em temperatura ambiente e processados em até 3 h. Volumes de 1,5ml de cada amostra de sangue total foram distribuídos em placas de poliestireno com 24 orifícios para cultura de células. Para cada amostra adicionou-se no orifício 1, 100ml de tampão salino fosfatado (PBS); no orifício 2, 100ml de PPD aviário; e no orifício 3, 100ml de PPD bovino. As amostras foram homogeneizadas e incubadas por 20 h a 37ºC, com 5% de CO₂, e o plasma foi removido e congelado a -80ºC.

O teste de imunoadsorção enzimática para detecção de IFN-g foi realizado com o kit Bovine Gamma Interferon Test (Bovigam-CSL Veterinary Limited). A execução foi de acordo com as recomendações do fabricante.

Teste cervical comparativo

As inoculações das tuberculinas (PPD aviária e bovina - Laboratório Tecpar) foram realizadas 60 dias após a sensibilização, por via intradérmica, na dosagem de 0,1ml, na região cervical, em locais previamente demarcados por tricotomia. Antes da inoculação da tuberculina foi realizada a primeira mensuração da espessura da dobra da pele com o auxílio de um cutímetro. Após 72 h da inoculação, realizou-se nova medida da dobra da pele no local de inoculação das tuberculinas PPD aviária e bovina. A execução e interpretação dos resultados foram de acordo com o regulamento técnico do Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose Animal (PNCEBT) do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abasteci-mento (Brasil 2001).

Os resultados negativos e inconclusivos foram agrupados na categoria negativos, para efeito de cálculo de concordância entre os métodos de diagnóstico utilizados (Mathias et al. 1995). Utilizou-se a prova binomial para comparar os dois testes diagnósticos (Siegel 1975). Considerou-se nas análises a = 0,05.

Histopatologia

Realizou-se biópsia de pele no local da reação ao TCC, após 72h da tuberculinização. Os fragmentos obtidos foram fixados em formol a 10% por um período mínimo de 48 h. As amostras já fixadas foram processadas, e as lâminas histológicas coradas em hematoxilina-eosina (HE) foram examinadas ao microscópio fotômico.

RESULTADOS

O Quadro 1 apresenta o resultado do ensaio para a detecção de IFN-g nos bovinos sensibilizados e nos bovinos-controle, antes e após a sensibilização experimental com inóculos inativados AN5 de Mycobacterium bovis e D4 de M. avium. O Quadro 2 apresenta a interpretação do TCC nos bovinos sensibilizados e nos bovinos-controle, após 60 dias da inoculação experimental.

Todos os animais inoculados com M. bovis apresentaram no TCC sinais de reação inflamatória localizada, de consistência firme, sensível e com aumento de temperatura. Essa constatação foi a mesma tanto nos animais positivos (DB-DA > 4mm) como nos inconclusivos (DB-DA entre 2 e 3,9mm) (Quadro 2).

Os testes de detecção de IFN-g e o TCC apresentaram concordância de 75%. A prova binomial para um intervalo de confiança de 5% resultou em p=0,06, não havendo diferença significativa entre os resultados dos dois testes.

O exame histológico das biópsias das reações positivas e inconclusivas ao TCC revelou edema, raros polimorfonucleares, reação inflamatória com predominância de células mononu-cleares em processo de diferenciação para macrófagos, com alguns deles alongados com características de células epitelióides. Algumas reações evidenciaram células gigantes do tipo Lang-hans, restos celulares e discreta vasculite com áreas de necrose não delimitadas (Fig.1).

DISCUSSÃO

O ensaio de detecção de IFN-g identificou como positivos todos os animais sensibilizados com Mycobacterium bovis, em diferentes momentos (Quadro 1), o que possibilitou a determinação precoce da resposta imune dos animais aos antígenos micobacterianos, entre 15 e 30 dias após a sensibilização. Esse resultado está de acordo com Walravens et al. (2002), que, ao avaliarem animais infectados experimentalmente com M. bovis, detectaram resposta ao teste de IFN-g 2 a 4 semanas após inoculação. Em condições de campo, o uso estratégico desse teste pode fornecer meios para identificação precoce de bovinos infectados com M. bovis, assegurando assim sua remoção do rebanho (Ryan et al 2000, Gormeley et al. 2004).

A identificação de um animal reagente (Bov.17) para M. avium no teste do interferon-gama (Quadro 1), antes da inoculação experimental, sugere tratar-se de infecção por micobactérias ambientais ou do complexo MAC, responsáveis por reações inespecíficas (OIE 1992, Inderlied et al. 1993, Roxo et al. 1998, Brasil 2003, Waters et al. 2003).

O TCC identificou como positivos 75% dos bovinos sensibilizados com M. bovis, e 25% revelaram reação inconclusiva (Quadro 2). Se esses casos decorressem de infecção natural, os animais seriam, conforme o regulamento técnico do PNCEBT, considerados positivos e sacrificados ou submetidos a um segundo TCC com intervalo mínimo de 60 dias (Brasil 2001). Os Bovinos 2, 12, 13 e 14, embora com diganóstico inconclusivo, revelaram, ao exame histológico da reação cutânea, características iguais às dos animais que apresentaram DB>DA>4. Ressalta-se que os animais inconclusivos foram positivos no ensaio para detecção de IFN-g após 15 dias da inoculação nos Bovinos 2 e 12 e após 30 dias nos Bovinos 13 e 14.

Cabe destacar que o TCC só foi realizado 60 dias após a sensibilização, o que não permitiu avaliar se esse teste também identificaria a infecção já a partir de 15 dias como ocorreu com a detecção do IFN-g. Para esclarecer essa questão seria necessário realizar o TCC em diferentes momentos e grupos experimentais, já que o teste cutâneo não deve ser repetido no mesmo animal em intervalo menor que 60 dias devido à possibilidade de dessensibilização (Langrange & Hurtrel 1988, Monaghan et al. 1994, Thom et al. 2004).

Os resultados obtidos nos exames histológicos das reações estão de acordo com Macruz & Bueno (1963), os quais mostram que as reações cutâneas à tuberculinização correspondem histologicamente a processo inflamatório indicativo de alergia. Da mesma forma, Roxo et al. (1998), ao estudarem tais reações em bovinos e bubalinos, encontraram intenso infiltrado celular, com predomínio de mononucleares e, em alguns casos, edema e necrose.

Tendo em vista que os testes indiretos para o diagnóstico da tuberculose bovina são baseados na análise da resposta imunológica celular (IFN-g e DTH) perante os antígenos micobacterianos PPDs bovino e aviário, pode-se afirmar que a detecção de IFN-g e a reação tuberculínica indicam de forma fidedigna a sensibilização de bovinos com inóculos AN5 de M. bovis e D4 de M. avium, e que ambos os testes são efetivos para discriminar as reações inespecíficas geradas por M. avium.

Recebido em 11 de outubro de 2005.

Aceito para publicação em 12 de abril de 2006.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  05 Jun 2007
• Data do Fascículo
  Dez 2006

Histórico

• Aceito
  12 Abr 2006
• Recebido
  11 Out 2005