Aborto ovino associado com infecção por Sarcocystis sp

Ovine abortion associated with Sarcocystis sp. infection

Aborto ovino associado com infecção por Sarcocystis sp

Ovine abortion associated with Sarcocystis sp. infection

Caroline A. Pescador^I; Luís G. Corbellini^II; Eduardo C. de Oliveira^I; Paulo M. Bandarra^I; Juliano S. Leal^I; Pedro M.O. Pedroso^I; David Driemeier^I,*

^IDepartamento de Patologia Clínica Veterinária, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Av. Bento Gonçalves 9090, Porto Alegre, RS 91540-000, Brasil

^IIDepartamento de Medicina Veterinária Preventiva, Faculdade de Veterinária, UFRGS. E-mail: [e-mail]

RESUMO

Infecções por protozoários têm distribuição mundial e podem causar aborto, nascimentos prematuros e ou morte fetal em diversas espécies animais. Em julho de 2004, oito ovinos Corriedale apresentaram problemas reprodutivos caracterizados por aborto e natimortalidade no terço final da gestação. Dessas oito perdas, um natimorto macho foi enviado ao Setor de Patologia Veterinária para necropsia. Alterações macroscópicas não foram observadas durante a necropsia. Lesões histológicas foram observadas principalmente no cérebro e coração e se caracterizaram por encefalite não-supurativa multifocal acentuada associada à presença de protozoários no interior de células endoteliais e vasos sanguíneos e miocardite não-supurativa focal leve. Alguns desses organismos apresentaram formato de roseta. O teste de imunoistoquímica anti-Toxoplasma gondii foi negativo, mas houve reação cruzada com anticorpo anti-Neospora caninum. O exame de imunofluorescência direta para Leptospira sp. foi negativo. A bacteriologia aeróbica e micro-aeróbica não revelou crescimento significativo. Esses achados foram compatíveis com o diagnóstico de Sarcocystis sp.

Termos de indexação:Sarcocystis sp., aborto, natimortalidade, ovinos.

ABSTRACT

Protozoal infection has worldwide distribution and may cause abortion, premature parturition or fetal death in almost all domestic animals. In July 2004, eight Corriedale sheep showed abortion and stillbirth in the third trimester of gestation. Of these reproductive losses, one stillborn male was submitted to the Laboratory of Veterinary Pathology for necropsy investigation. The direct immunofluorescence test for Leptospira sp. was negative. No significant bacteria was isolated from lung and liver by aerobic and microaerobic cultures. Macroscopic lesions were not found in any fetal tissue. The histological lesions were observed mainly in the brain and heart and consisted primarily of severe multifocal nonsupurative encephalitis and nonsuppurative myocarditis. Schizonts of a protozoan parasite consistent with Sarcocystis sp. were found in the endothelial cells and vascular endothelium in several organs. Many schizonts with merozoites arranged in a rosette-like pattern were observed in brain and kidney tissues. In sections stained with periodic acid-Schiff (PAS), the limiting membrane of some schizonts appeared to be weakly PAS-positive. Merozoites and nuclei were PAS-negative. Protozoa did not react immunohistochemically to the antibody anti-Toxoplasma gondii; however, cross-reactivity was observed with Neospora caninum antibody. These findings were consistent with the diagnosis of Sarcocystis sp.

Index terms:Sarcocystis sp., abortion, stillbirth, sheep.

INTRODUÇÃO

Protozoários do filo Apicomplexa classificados na família Sarcocystidae são coccídeos obrigatórios e ou facultativos que se caracterizam por apresentar uma fase de desenvolvimento sexual no intestino do hospedeiro definitivo e formação de cistos em vários tecidos do hospedeiro intermediário (Tender et al. 1997). O filo Apicomplexa é composto por pelo menos seis gêneros de coccídeos formadores de cistos em tecidos (Rommel 1989, Tender et al. 1997). Os gêneros Toxoplasma, Hammondia, Besnoitia e Neospora são classificados dentro da subfamília Toxoplasmatinae. Sarcocystis e Frenkelia pertencem à subfamília Sarcocystinae (Mugridge et al. 1999). Apesar de grande parte das descrições genéricas dessas subfamílias estarem baseadas somente em características fenotíficas tais como hospedeiro, ciclo de vida, transmissão, tipo de célula infectada, morfologia e localização dos cistos, uma análise filogenética molecular foi implementada para melhorar o sistema de classificação (Mugridge et al. 1999). Protozoários do gênero Toxoplasma, Sarcocystis e Neospora são importantes agentes patogênicos (Jones et al. 2000) causadores de abortos em animais de produção e perdas econômicas significativas (Tender 1995, Dubey 2003). O objetivo desse trabalho foi descrever os achados clínicos e sorológicos observados em uma criação de ovinos com histórico de abortos e os achados histopatológicos e ultra-estruturais de um feto ovino com lesões generalizadas associadas com Sarcocystis sp. no Rio Grande do Sul.

MATERIAL E MÉTODOS

Em julho de 2004, um ovino natimorto, macho, da raça Corriedale foi encaminhado ao Setor de Patologia Veterinária. Na necropsia, fragmentos de diversos órgãos foram coletados e fixados em formalina tamponada a 10% e processados por métodos convencionais para exames histológicos e corados por hematoxilina-eosina (HE) e Ácido Periódico de Schiff (PAS). Foram realizadas impressões de secções de rim para o teste de imunofluorescência direta para Leptospira sp., utilizando-se anticorpo comercial multivalente na diluição de 1:20 (Miller et al. 1989). Amostras de fígado, pulmão e conteúdo do abomaso foram encaminhadas para exames bacteriológicos (aeróbio e microaerófilo para Brucella sp.). O cultivo aeróbio das amostras foi realizado em agar-sangue ovino (5%). Para isolamento de Brucella sp. foi usado meio base de agar sangue (Alton et al. 1988, Timoney et al. 1988) acrescido com 5% de sangue ovino e antibióticos. Fragmentos de cérebro incluídos em parafina foram submetidos ao teste imunohistoquímico com anticorpo policlonal anti-Toxoplasma gondii e anti-Neospora caninum,ambos na diluição de 1:1000 (Corbellini et al. 2000). Controles positivos foram incluídos nesse exame. Como cromógeno foi utilizado o DAB. Amostras de rim e cérebro fixadas em formalina tamponada a 10% foram encaminhadas à Universidade Federal de Pelotas para microscopia eletrônica de transmissão. Soro sangüíneo das ovelhas com histórico de aborto e natimortalidade foram testadas para T. gondii por hemaglutinação indireta e para Brucella sp. pela técnica de aglutinação em placa com antígeno acidificado (Card-Test). Adicionalmente, dados epidemiológicos foram obtidos em visita à propriedade com o proprietário.

RESULTADOS

O proprietário relatou problemas reprodutivos caracterizados por aborto (geralmente no terço final da gestação) e natimortalidade em oito ovelhas da raça Corriedale. O rebanho total incluía 60 ovinos de diferentes idades. Os animais eram vacinados contra carbúnculo sintomático, enterotoxemia e leptospirose. Além dos ovinos, também havia caninos, felinos, aves e eqüinos. Todos esses animais tinham acesso aos mesmos ambientes. Das oito perdas fetais ocorridas, um ovino natimorto foi examinado.

Durante a necropsia, observou-se a presença de mecônio distribuído difusamente sobre a pele. Lesões macroscópicas não foram observadas. Na microscopia, as alterações mais significativas foram observadas no cérebro e coração e se caracterizavam por encefalite não-supurativa multifocal acentuada (Fig.1) associada com áreas de gliose e vasculite linfo-histiocitária multifocal moderada. Numerosos merontes contendo merozoítos foram encontrados em capilares (Fig.2), inclusive os glomerulares (Fig.3), células endoteliais de vasos cerebrais e em alvéolos pulmonares. Alguns merontes apresentavam formato de roseta (Fig.4).

Os exames bacteriológicos não revelaram crescimento significativo. O teste de imunofluorescência direta para Leptospira sp. foi negativo. A análise imunoistoquímica foi negativa para Toxoplasma gondii. Entretanto, discreta reação positiva com intensidade menor que os controles positivos foi observada com o anticorpo anti-Neospora caninum. A microscopia eletrônica de transmissão em fragmentos de rim revelou a presença de inúmeros merozoítos no glomérulo renal e ausência de vacúolo parasitóforo e róptrias (Fig.5). Os testes sorológicos de hemaglutinação indireta contra Toxoplasma gondii e de aglutinação em placa com antígeno acidificado (Card-Test) contra Brucella sp. foram negativos em todas amostras testadas.

DISCUSSÃO

Infecção por protozoários do filo Apicomplexa tem sido relatada como causa de encefalite em ovinos (Stubbings et al. 1985). Toxoplasma gondii e Neospora caninum são protozoários capazes de desenvolver lesões inflamatórias não supurativas no cérebro de fetos ovinos abortados (Buxton et al. 1998, Jolley et al. 1999, Hassig et al. 2003). Embora a infecção por esses protozoários cause lesões microscópicas muito similares, ambos apresentam características ultra-estruturais e antigênicas distintas que permitem sua diferenciação (Mugridge et al. 1999). Adicionalmente, Sarcocystis sp. já foi associado com problemas reprodutivos em ruminantes (Dubey et al. 1982), inclusive com lesões semelhantes às descritas em casos de Neospora e Toxoplasma em ovinos. Munday & Black (1976) relataram um caso suspeito de infecção por Sarcocystis sp. no cérebro de dois fetos bovinos abortados (Munday et al. 1976). Os organismos descritos por eles foram similares aos observados nesse caso. Casos de infecção natural por Sarcocystis spp. em ovinos foram descritos em diversos países (Dubey 1989, O'Toole et al. 1993, Buxton 1998, Caldon et al. 2000). Entretanto, informações sobre essa infecção como possível causa de aborto não tem sido relatada no Brasil. Aborto e morte fetal são os sinais clínicos mais frequentemente observados quando os animais são infectados com espécies patogênicas de Sarcocystis spp. durante a gestação (Fayer et al. 1988).

O mecanismo pelo qual Sarcocystis sp. induz o aborto ainda é desconhecido (Mackie et al. 1992) e a presença do protozoário e de lesões histológicas raramente é observada nos tecidos fetais (Corner et al. 1963, Fayer et al. 1976, Stalheim et al. 1976, Barnett et al. 1977, Leek & Fayer 1978). Além do aborto, outros sinais clínicos como febre, anemia, anorexia, perda de peso, problemas de coagulação sanguínea e fraqueza são também descritos em animais infectados (Fayer et al. 1976). No hospedeiro intermediário (herbívoros), Sarcocystis sp. possui uma fase vascular e muscular (Dubey 1976). Durante a fase vascular, esporozoítos liberados dos esporocistos se multiplicam em células endoteliais dos vasos sanguíneos em vários órgãos, gerando dois ciclos de multiplicação (geração). Na primeira geração, merontes se desenvolvem em artérias e arteríolas. Exceto pela febre, a primeira geração composta de formação de merogonias aparentemente não é patogênica para bovinos e ovinos, visto que a inoculação de Sarcocystis sp. nessas espécies não tem sido associada com doença ou morte durante essa fase de infecção (Johnson et al.1975, Leek et al.1977). A presença de sinais clínicos e lesões histológicas está correlacionada com o desenvolvimento de merontes maduros de segunda geração no endotélio vascular do cérebro e rins dos animais infectados (Dubey et al. 1981). Os merontes maduros são formados pela liberação de merozoítos presentes no interior dos merontes de primeira geração (Gardiner et al. 1998).

Dificuldades no diagnóstico de aborto ovino por Sarcocystis spp. têm sido associadas com a ausência de ambos, protozoários no tecido fetal e lesões histológicas patognomônicas da infecção (Leek et al. 1977). O feto examinado nesse caso apresentava lesões multifocais não supurativas acentuadas no cérebro e coração associadas com a presença de grupos de merontes contendo merozoítos no endotélio vascular e em células endoteliais, especialmente em fragmentos de cérebro e rim. Os protozoários observados nesse caso não foram corados pelo ácido periódico de Schiff (PAS), fortalecendo as suspeitas de infecção por Sarcocystis spp., pois a parede dos cistos e merontes desse protozoário são PAS-negativos (Morgan et al. 1984). A presença de merontes com formato de roseta (endopoligenia) em células endoteliais e no endotélio de vasos sanguíneos assegura que os protozoários observados nesse natimorto pertencem ao gênero Sarcocystis (Mackie et al. 1992). A observação de merozoitos livres em vasos sanguíneos cerebrais associados com reação inflamatória sugere que a parasitemia foi o maior mecanismo de indução de lesão tecidual pelo protozoário. A parasitemia foi provavelmente também responsável pela infiltração de células mononucleares em outros órgãos.

Outros protozoários pertencentes ao filo Apicomplexa devem ser considerados no diagnóstico diferencial de infecção por Sarcocystis sp. Infecção por T. gondii é associada com abortos, mumificação fetal, morte perinatal e infecção congênita em fetos ovinos e de outros animais (Frenkel et al. 1973; Nurse & Lenghaus 1986). As lesões induzidas por T. gondii no sistema nervoso central em fetos ovinos são similares às observadas nesse caso. Entretanto, o tropismo dos esquizontes por endotélio vascular e células endoteliais não são característicos de toxoplasmose. Além disso, a imunoistoquímica com anticorpo policlonal anti-T.gondii em amostra de cérebro e a hemaglutinação indireta em amostras de soro sangüíneo das mães foram negativos. A imunoistoquímica para N. caninum revelou fraca reação positiva, quando comparada aos controles positivos. Essa reação foi considerada cruzada. Antígenos de Sarcocystis sp. apresentam reação cruzada com outros protozoários formadores de cistos (Rose 1982). Reações cruzadas com protozoários pertecentes ao mesmo filo Apicomplexa podem ser observadas ocasionalmente com o uso de anticorpos policlonais anti-N. caninum provavelmente devido à grande variação na fonte de animais utilizados para a produção de anticorpos, no tipo de antígeno e estágio dos parasitas utilizados na imunização dos animais, bem como a variações observadas nos procedimentos imunoistoquímicos em diferentes laboratórios (Dubey & Lindsay 1996, Van Maanen et al. 2004). A análise de fragmentos de rim pela microscopia eletrônica de transmissão confirmou o diagnóstico de infecção por Sarcocystis sp. pela ausência de róptrias e vacúolo parasitóforo, característica marcante desse gênero (Markus et al. 2004). Tal fato excluiu a possibilidade de infecção por T. gondii e N. caninum, uma vez que ambas as organelas estão presentes nesses dois gêneros de protozoários (Speer et al. 1999).

O diagnóstico de infecção por Sarcocystis sp. no presente estudo baseou-se nos achados microscópicos encontrados aliados às características morfológicas dos merontes no interior de vasos e de células endoteliais dos tecidos fetais, o que foi confirmado pela técnica de microscopia eletrônica de transmissão.

Agradecimentos.- Ao professor Severo Sales de Barros, da Universidade Federal do Pelotas pelo exame de microscopia eletrônica. Este estudo foi financiando pela CAPES e CNPq.

Recebido em 16 de novembro de 2006.

Aceito para publicação em 25 de setembro de 2007.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  04 Dez 2007
• Data do Fascículo
  Out 2007

Histórico

• Aceito
  25 Set 2007
• Recebido
  16 Nov 2006