Perfil eletroforético e concentração de imunoglobulinas G (IgG) do soro sanguíneo de cabras Saanen com mastite experimental induzida por Staphylococcus aureus suplementadas com vitamina E

Electrophoretic profile and concentration of immunoglobulins G (IgG) in blood serum of Saanen goats with experimental mastitis induced by Staphylococcus aureus suplemented with vitamin E

Perfil eletroforético e concentração de imunoglobulinas G (IgG) do soro sanguíneo de cabras Saanen com mastite experimental induzida por Staphylococcus aureus suplementadas com vitamina E

Electrophoretic profile and concentration of immunoglobulins G (IgG) in blood serum of Saanen goats with experimental mastitis induced by Staphylococcus aureus suplemented with vitamin E

Joandes H. Fonteque^I,*; Aguemi Kohayagawa^II; Cláudio R.S. Mattoso^II; Sônia T.A. Lopes^III; Paulo R.O. Paes^IV; Maria Luiza Cassetari^V; Hélio Langoni^VI

^IDepartamento de Medicina Veterinária, Centro de Ciências Agroveterinárias, Universidade do Estado de Santa Catarina (UDESC), Av. Luiz de Camões 2090, Lages, SC 88520-000, Brasil

^IIDepartamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ), Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (Unesp), Rubião Júnior s/n, Cx. Postal 560, Botucatu, SP 18618-000, Brasil

^IIIDepartamento de Clínica de Pequenos Animais, Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Av. Roraima 1000, Cidade Universitária, Bairro Camobi, Santa Maria, RS 97105-900, Brasil

^IVDepartamento de Clínica e Cirurgia Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), Av. Antônio Carlos 6627, Cx. Postal 567, Belo Horizonte, MG 30123-970, Brasil

^VDepartamento de Nutrição, Instituto de Biociências (IB), Unesp, Botucatu, SP

^VIDepartamento de Higiene Sanitária e Saúde Pública, FMVZ, Unesp, Botucatu, SP

RESUMO

O objetivo do trabalho foi avaliar o perfil eletroforético das proteínas e a concentração sérica de imunoglobulina G (IgG) em cabras da raça Saanen com mastite induzida experimentalmente por Staphylococcus aureus e suplementadas com vitamina E (acetato de dl-α-tocoferol). Utilizaram-se 14 cabras adultas, gestantes, primíparas, com sorologia negativa para Artrite Encefalite Caprina (CAEV), clinicamente sadias, divididas em dois grupos experimentais de sete animais. Grupo não suplementado (G1) e grupo suplementado com 2.000 U.I. de acetato de dl-α-tocoferol (G2 Vit E) via intramuscular no dia do parto e sete dias após o parto. Ao nono dia do pós-parto foram inoculados 300 UFCs da cepa de S. aureus ATCC 225923, na metade esquerda da glândula mamária de cada animal. A mastite foi determinada pela colheita das amostras de leite para a comprovação da infecção, por meio de exames bacteriológicos, contagem de células somáticas (CCS) e California Mastitis Test (CMT), a partir deste momento foram efetuadas colheitas às 12, 24, 48 e 72 horas, sendo posteriormente instituído o tratamento intramamário com antimicrobiano e nova avaliação 48 horas após o tratamento. O perfil eletroforético em gel de agarose das proteínas séricas das cabras, apresentaram cinco frações, sendo: albumina e globulinas (α, β1, β2 e γ). Houve aumento na produção de γ-globulina e menor produção da fração β2-globulina 12 horas após a infecção, com os valores reduzindo mais rapidamente no grupo suplementado, evidenciando a influência da vitamina E na diminuição da produção das proteínas de fase aguda. Não houve influência da vitamina E na concentração sérica de imunoglobulina G (IgG) nos animais suplementados. A suplementação com vitamina E aumentou a concentração de imunoglobulinas e diminuiu a produção de proteínas de fase aguda, provavelmente pelo efeito antioxidante minimizando a lesão tecidual durante o processo inflamatório localizado na glândula mamária.

Termos de indexação: Cabras, Saanen, mastite, vitamina E, eletroforese, imunoglobulina.

ABSTRACT

The objective was to evaluate the electrophoretic profile of proteins and serum concentration of immunoglobulin G (IgG) in Saanen goats with mastitis experimentally induced by Staphylococcus aureus (dl-α-tocopherol acetated). 14 adult goats, (supplemented with vitamin E DL-α-tocopherol) primiparous pregnant, seronegative for caprine arthritis encephalitis (CAEV), clinically healthy, were divided into two groups of seven animals: Not supplemented group (G1) and group supplemented with 2.000 UI of DL-α-tocopherol (G2 Vit E), by intramuscular injection on the day of the parturition and seven days later. At the 9th day after delivery 300 UFCs of the S. aureus ATCC 225923 strain were inoculated into the left half of the mammary gland of each animal. The mastitis was determined through collection of milk samples for evidence of infection by means of bacteriological examination, somatic cell count (SCC) and California Mastitis Test (CMT). Then samples were collected after 12, 24, 48 and 72 hours, antimicrobial intra-mammary gland treatment was initiated, with new evaluation 48 hours after treatment. The electrophoretic profile of serum protein of the goats, showed five fractions, as follows: albumin and globulin (α, β1, β2 e γ-globulin). There was an increase in the production of γ-globulin and lower production of β2-globulin fraction 12 hours after infection, and faster decrease in the supplemented group, showing the influence of vitamin E in the production of acute phase proteins. There was no influence of vitamin E in the serum concentration of immunoglobulin G (IgG) in supplemented animals. The supplementation with vitamin E increased the concentration of immunoglobulin and decreased the production of acute phase proteins, probably the antioxidant effect minimizing the tissue injury during the inflammatory process in the mammary gland.

Index terms: Goats, Saanen, mastitis, vitamin E, electrophoresis, immunoglobulin.

INTRODUÇÃO

A mastite constituiu-se um dos maiores problemas da exploração leiteira por alterar a qualidade do leite e de seus derivados (Silva 1991), diminuir a produção e aumentar os custos, sendo de grande interesse econômico na criação de cabras especializadas. A vitamina E tem mostrado no período do periparto em vacas leiteiras, efeito protetor contra a ação de radicais livres produzidos na glândula mamária durante o processo inflamatório. Além da sua ação na melhora da função dos neutrófilos, controlando a produção de radicais livres durante o processo de "explosão respiratória" e consequentemente diminuindo a lesão tecidual adjacente, a vitamina E interfere também na produção de prostaglandinas, leucotrienos e tromboxane (Reddy & Frey 1990, Weiss et al. 1994, Mcdowell et al. 1996). Weiss et al. (1990), Smith et al. (1984) e Smith et al. (1985) observaram que bovinos leiteiros suplementados com vitamina E apresentaram diminuição na severidade e na incidência de mastite clínica. Devido à escassez de trabalhos científicos enfatizando os efeitos da suplementação de vitamina E no período periparturiente em cabras com mastite, este trabalho teve como objetivo evidenciar as alterações no perfil eletroforético das proteínas séricas e na concentração de imunoglobulinas G (IgG) em cabras Saanen com mastite experimental induzida por Staphylococcus aureus suplementadas com vitamina E.

MATERIAL E MÉTODOS

O trabalho foi realizado no Laboratório Clínico Veterinário "Aguemi Kohayagawa" do Departamento de Clínica Veterinária e no Laboratório de Microbiologia do Núcleo de Pesquisas em Mastite (Nupemas) do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ), Unesp, Campus de Botucatu, SP. Foram utilizadas 14 cabras da raça Saanen, de 8-12 meses de idade, pesando entre 28 e 35kg, gestantes, primíparas, criadas em regime intensivo no Hospital Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Unesp, Campus de Botucatu, SP. Os animais foram mantidos em baias, recebendo ração concentrada, feno de "coastcross" (Cynodon dactylon), sal mineral e água à vontade. As cabras foram consideradas clinicamente sadias a partir de exames clínicos e laboratoriais e apresentaram sorologia negativa para Artrite Encefalite Caprina (CAEV) por meio do Teste de Imunodifusão Radial¹. Os grupos experimentais constituíram-se de sete animais, sendo: grupo não suplementado com vitamina E (G1) e grupo suplementado com 2.000 U.I. de vitamina E (G2 Vit. E) (acetato de dl-α-tocoferol)², via intramuscular, no dia do parto e sete dias após o parto. Ao oitavo dia pós-parto foram realizadas colheitas de sangue para a determinação das proteínas séricas totais e para a realização do fracionamento eletroforético das proteínas séricas, concentração sérica de vitamina E, e amostras de leite para realização da contagem de células somáticas (CCS), Califormia Mastits Test (CMT) e exames bacteriológicos que serviram como controle (M1). Ao nono dia pós-parto foram inoculadas na metade esquerda da glândula mamária via orifício do teto, 300 unidades formadoras de colônia (UFCs) de Staphylococcus aureus, cepa ATCC 25923, em cada animal. A partir deste momento, os animais foram acompanhados diariamente por meio de exames clínicos e laboratoriais. Quando a secreção da glândula mamária determinou alterações nos exames bacteriológicos, contagem de células somáticas (CCS) e California Mastitis Test (CMT) foram iniciadas as colheitas de sangue para a obtenção do soro, sendo denominado de momento dois (M2). A partir de M2 novas colheitas foram efetuadas às 12 (M3), 24 (M4), 48 (M5) e 72 horas (M6) e instituído o tratamento intramamário com antimicrobiano e nova avaliação 48 horas após o tratamento (M7). O California Mastits Test (CMT) foi realizado conforme descrito por Schalm & Noordlander (1957). A contagem de células somáticas (CCS) foi realizada de acordo com a técnica descrita por Preescot & Bredd (1910) e a coloração pelo método de Broadhurst & Paley (1939) modificado (Santos & Virela 1983). Os esfregaços foram realizados e examinados em duplicata de acordo com Lima Júnior (1991). O exame bacteriológico constituiu-se de identificação quanto à morfologia e disposição das células, características tintoriais ao Gram e a prova da catalase. O cultivo e a identificação dos microrganismos foram seguidos de acordo com as técnicas utilizadas no Laboratório de Microbiologia do Nupemas, Unesp, Campus de Botucatu, SP, preconizados por Carter & Cole Júnior (1990). Foram colhidos 10mL de sangue total, mediante venipunção jugular, utilizandose tubos sem anticoagulante a vácuo³ para a obtenção do soro e as amostras estocadas a -20ºC, até o momento da determinação das concentrações das proteínas séricas, imunoglobulinas G (IgG) e vitamina E. A proteína total sérica foi determinada pelo método de Biureto, utilizando-se kits comerciais⁴. A separação das frações protéicas séricas foi determinada pela técnica de eletroforese em gel de agarose⁵ em tampão Veronal/EDTA 0,05M e pH 8,6, corado em Negro de amido a 0,2% em ácido acético a 5% e a leitura efetuada por densitometria em 520 nanômetros⁶. A concentração de imunoglobulina G (IgG) foi determinada por meio da imunodifusão radial⁷. A determinação da vitamina E sérica foi realizada por meio da Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC)⁸, seguindo as recomendações de Arnaud (1991). As análises estatísticas foram realizadas pelo teste de análise de variância de medidas repetidas (ANOVA) (Morrison 1990). Para comparar resultado de cada variável nos momentos dentro de cada grupo foi utilizado o Teste de Friedman. Para comparar resultados de cada variável entre os grupos, dentro de cada momento foi utilizado o Teste de Kruskal-Wallis. Todos os testes foram realizados ao nível de 5% de variância (P<0,05) (Curi 1997).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As análises pelo California Mastitis Test (CMT), contagem de células somáticas (CCS) e unidades formadoras de colônias (UFC/mL) das amostras de leite dos animais suplementados com vitamina E demonstraram valores significativamente (P<0,05) menores quando comparados aos não suplementados (Quadros 1, 2 e 3). Segundo Poutrel & Lerondelle (1983) e Contreras et al. (1996) o diagnóstico da mastite caprina pelo leite baseia-se principalmente no isolamento microbiológico, porém várias técnicas têm sido usadas para detectar a inflamação da glândula mamária, sendo as mais aceitas o California Mastitis Test (CMT), pela sua facilidade de utilização a campo e a contagem de células somáticas (CCS), em razão de sua sensibilidade e especificidade. Kalogridou-Vassiliadou et al. (1992), Deinhofer & Pernthaner (1995) e Boscos et al. (1996) observaram que a CCS é útil na detecção da mastite caprina, desde que se considere o estágio da lactação e o número de partos. Apesar de às 48h após o tratamento (M7) não haver diferença significativa na concentração de bactérias (UFC) entre os grupos, a CCS e o CMT apresentaram diferenças significativas com os menores valores no grupo suplementado. Os valores mais baixos de CCS e CMT para a glândula mamária das cabras tratadas com vitamina E comprovam o efeito da suplementação, que diminui a severidade da mastite também observado em vacas por Smith et al. (1984), Politis et al. (1995) e Smith et al. (1997). Porém, Zanetti et al. (1998) e Ferreira et al. (2007) não encontraram diminuição da mastite subclínica diagnosticada por meio do teste CMT em vacas recebendo vitamina E. O grupo suplementado apresentou valores mais baixos de UFC sugerindo o efeito da vitamina E na proteção contra infecções intramamárias (Smith et al. 1997, Weiss et al. 1997). Outro benefício da utilização da CCS é que segundo Sears et al. (1990) a eliminação do S. aureus é cíclica gerando resultados falso-negativos, por isso sugere-se realizar um segundo exame microbiológico naqueles animais com alta CCS e com resultados microbiológicos negativos. Os resultados de menor presença de bactérias e menor CCS nos animais suplementados com vitamina E neste experimento podem ser justificados pelo aumento na fagocitose dos neutrófilos (Ndiweni & Finch 1996) e maior capacidade de eliminação de bactérias (Gyang et al. 1984). A concentração de vitamina E sérica (Quadro 4) não diferiu significativamente (P<0,05) nos grupos não suplementado (G1) e suplementado (G2 Vit E) exceto no momento M4, porém no grupo suplementado (G2 Vit E) a concentração foi sempre superior ao do grupo não suplementado (G1). O soro das cabras analisadas apresentou cinco frações protéicas: albumina e α1, β1, β2 e γ-globulinas (Fig.1) concordando com os achados de Castro et al. (1977), Santa Rosa et al. (2005) e Kaneko (2008), mas diferindo dos relatados por Ferri et al. (1970) e Birgel & Ferri (1971), que observaram quatro frações eletroforéticas (albumina e globulinas α, β e γ) e Chen et al. (1999) (albumina e α1, α2 e γ-globulinas), de Machado (1979) com sete frações eletroforéticas, (albumina e globulinas α1, α2, α3, β1, β2 e γ) e de Ciarlini et al. (1994) com cinco frações eletroforéticas (albumina e globulinas α₁, α₂, β e γ). Segundo Jain (1986) os resultados obtidos no fracionamento eletroforético em diferentes técnicas podem diferir significativamente, dificultando a sua comparação. A concentração de proteína total sérica para os grupos, não suplementado e suplementado, apresentou diferenças significativas (P<0,05) em todos os momentos, porém o comportamento dessas proteínas durante o desenvolvimento e processo de resolução da mastite foi muito semelhante (Quadro 5).

Para a variável albumina houve diferença significativa (P<0,05) apenas nos momentos M1 e M5, e acompanham o raciocínio com relação às proteínas totais séricas, pois a albumina constituiu-se na maior fração presente no soro, com cerca de 40%. Porém, houve tendência em ambos os grupos, não suplementado e suplementado, à diminuição da albumina no momento do desenvolvimento da mastite (M2), que pode ser explicado pela mobilização de fluídos e proteínas para a glândula mamária, devido ao processo inflamatório induzido pela inoculação de Staphylococcus aureus. A albumina é considerada uma proteína de fase aguda negativa, diminuindo durante o processo inflamatório (Kaneko 2008).

Segundo Kaneko (2008) a fração α-globulina é constituída de α2-macroglobulina, haptoglobina, ceruloplasmina, soro amiloide A, antitripisina e antiquimiotripsina, importantes proteínas de fase aguda que se elevam em processos inflamatórios. Porém, não foi observada elevação significativa (P<0,05) desta fração durante a indução da mastite.

Os valores médios da fração β1-globulina não sofreram variações significativas (P<0,05), permanecendo dentro da média do grupo controle, concordando com os achados de Smith & Sherman (1994).

Os resultados não demonstraram diferenças significativas (P<0,05) da fração β2-globulina entre os momentos para ambos os grupos, não suplementado e suplementado, porém quando se comparou entre grupos, houve diferença entre alguns momentos (Quadro 5). No grupo não suplementado, houve tendência ao aumento gradativo da fração β2-globulina até o momento M5, sendo que no grupo suplementado o aumento foi gradativo somente até o momento M3. Segundo Kaneko (2008) a fração β2-globulina é constituída de algumas proteínas de fase aguda, dentre elas a proteína C reativa e as frações C3 e C4 do complemento. Estas proteínas de fase aguda funcionam como indicadores de doenças nos estágios iniciais da inflamação. Essa resposta inflamatória para o tecido lesado é um mecanismo fundamental, no qual o organismo monta uma defesa contra a lesão e inicia uma série de eventos químicos para desencadear o processo de cura. Estes eventos químicos são mediados pela liberação de citocinas pelos leucócitos que migram para o local da lesão. A interleucina 1 (IL-1), interleucina 6 (IL-6) e o fator de necrose tumoral alfa (TNF-a) são importantes citocinas liberadas na circulação que alcançam o fígado e induzem a síntese e liberação das proteínas de fase aguda. Ciarlini et al. (1994) estudando caprinos infectados por Corynebacterium pseudotuberculosis observaram aumento da fração β-globulina.

Em relação às concentrações séricas de vitamina E observou-se diferença significativa (P<0,05) entre grupos no momento M4, com maiores concentrações de vitamina E para os animais do grupo suplementado (Quadro 4). A vitamina E é o mais potente antioxidante biológico, importante na defesa de células e tecidos (Paschoal et al. 2003) e a suplementação em doses elevadas pode aumentar a resposta humoral e celular (Meydany & Hayek 1997) prevenir enfermidades como mastite (Weiss et al. 1997, Valle 2000) e reduzir distúrbios reprodutivos (Weiss et al. 1990). Diversos autores relataram redução na ocorrência de mastites em vacas suplementadas com tocoferol (Batra et al. 1992, Jukola et al. 1996, Zanetti et al. 1998, Valle 2000, Paschoal et al. 2003), entretanto, em outros estudos, não foi observado efeito benéfico sobre a imunidade da glândula mamária (Ndiweni et al. 1991, Costa et al. 1997, Erskine et al. 1997). A vitamina E é um excelente antioxidante capaz de capturar radicais livres impedindo a lipoperoxidação da membrana da célula durante o processo inflamatório e consequentemente mantendo a sua integridade (Reddy & Frey 1990, Mcdowell et al. 1996, Chan 1996). A diminuição da extensão da lesão na glândula mamária nos animais suplementados pode explicar a menor produção das proteínas de fase aguda, pela diminuição na produção das interleucinas, liberadas durante a lesão tecidual (Reddy & Frey 1990, McDowell et al. 1996). A suplementação com vitamina E diminui a geração de superóxidos produzidos pelos polimorfonucleares e diminui a liberação de espécies reativas de oxigênio (EROS), peroxidação lipídica e IL-1 pelos monócitos. A diminuição da liberação de EROS e da oxidação lipídica ocorre pela inibição da atividade da proteína C quinase (proteína de fase aguda localizada na fração β-globulina) pelo α-tocoferol (Azzi & Stocker 2000, Kaneko 2008). A função imunoregulatória da vitamina E pode também estar relacionada ao seu papel na alteração do metabolismo do ácido araquidônico e conseqüentemente na biosíntese de prostaglandinas, tromboxane e leucotrienos diminuindo o efeito inflamatório (Reddy & Frey 1990, McDowell et al. 1996).

Os resultados observados com relação à fração γ-globulina, demostraram não haver diferença significativa (P<0,05) entre momentos para ambos os grupos, não suplementados e suplementados. Porém, comparandose entre grupos houve diferença significativa (P<0,05) para o momento M6. O grupo não suplementado apresentou tendência à diminuição das imunoglobulinas iniciando-se no momento M2 até o momento M5, elevando-se até o momento M7. Esses dados podem estar relacionados com a produção e a utilização de imunoglobulinas. Sabe-se que as imunoglobulinas inespecíficas (IgM) são produzidas inicialmente em relação às específicas (IgG). O grupo suplementado com vitamina E apresentou maiores valores de imunoglobulinas praticamente em todos os momentos, o que torna evidente sua ação na produção destas proteínas. Segundo Reddy et al. (1986) a suplementação com vitamina E em bezerros aumentou a concentração de IgM, sugerindo sua capacidade para aumentar a resposta imune primária. Os valores elevaram-se rapidamente após o momento (M2) da instalação da mastite, o que evidencia a maior produção celular de imunoglobulinas, provavelmente inespecífica (IgM), decrescendo gradativamente até o momento M5 e aumentando posteriormente, provavelmente devido a produção de imunoglobulinas específicas (IgG).

Não foram observados neste estudo diferenças significativas (P<0,05) entre momentos do grupo não suplementado e entre grupos para a variável IgG. Porém, houve diferença entre alguns momentos (Quadro 5) quando comparados os grupos suplementado com vitamina E. Esses dados demonstram que não houve estímulo efetivo na produção de IgG pela vitamina E, ressaltando que a elevação encontrada na fração γ-globulina determinada pelo perfil eletroforético, provavelmente deva-se ao aumento na produção de outras imunoglobulinas. Segundo Cipriano et al. (1982), Reddy et al. (1986), Mudron et al. (1992), Hidiroglou et al. (1995) e Costa (2000) houve aumento não significativo na concentração de IgG para animais suplementados com vitamina E.

CONCLUSÃO

A suplementação com 2.000 UI de vitamina E no dia do parto e 7 dias após o parto em cabras foi efetiva para aumentar a produção de imunogloblinas e diminuir a produção de proteínas de fase aguda, evidenciando seu efeito protetor na glândula mamária durante o processo de mastite induzida experimentalmente por Staphylococcus aureus. Porém, mais estudos devem ser realizados para verificar os mecanismos de proteção da vitamina E na glândula mamária em animais de produção.

Agradecimentos.- À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro e ao Laboratório de Nutrição da Faculdade de Medicina da Unesp, Campus de Botucatu.

Recebido em 2 de junho de 2009

Aceito para publicação em 14 de setembro de 2009

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1

Caprine Arthritis-Encephalitis Antibody Test Kit

^®, Veterinary Diagnostic Technology,

4890 van Gordon St Wheat Ridge CO 80033, Colorado, USA).

2

Monovin E

^®, Laboratório Bravet LTDA, Visconde de Santa Cruz 276, Engenho Novo, Rio de Janeiro, RJ.

3

BD Vacutainer

^®, Becton, Dickinson and Company, Danby Building, Edmund Halley Road, Oxford Science Park, Oxford, Oxfordshire OX4 4DQ, Inglaterra.

4

Proteína total

^®, Gold Analisa Diagnóstica Ltda, Av. Nossa Senhora de Fátima 2363, Carlos Prates, Belo Horizonte, MG.

5

Celmgel

^®, Companhia Equipadora de Laboratórios Modernos (CELM), Alameda Amazonas 764, Alphaville, Barueri, SP.

6

Densitômetro SB-210

^®, Companhia Equipadora de Laboratórios Modernos (CELM), Alameda Amazonas 764, Alphaville, Barueri, SP

7

Goat IgG Antibody

^®, Bethyl Laboratories, Inc, P.O. Box 850, Montgomery TX 77356, Texas, USA.

8

Cromatógrafo Líquido de Alto Desempenho (HPLC)

^®, Shimadzu do Brasil, Marquês de São Vicente 1771, Barra Funda, São Paulo, SP.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  01 Mar 2010
• Data do Fascículo
  Jan 2010

Histórico

• Recebido
  02 Jun 2009
• Aceito
  14 Set 2009