Perfil microbiológico, celular e fatores de risco associados à mastite subclínica em cabras no semiárido da Paraíba

Cellular and microbiological profiles and risk factors for subclinical mastitis in goats in the semi-arid region of Paraíba

Perfil microbiológico, celular e fatores de risco associados à mastite subclínica em cabras no semiárido da Paraíba

Cellular and microbiological profiles and risk factors for subclinical mastitis in goats in the semi-arid region of Paraíba

Patrícia B. Neves^I; Elizabeth S. Medeiros^II; Valezka V. Sá^I; Expedito K.A. Camboim^I; Felício Garino Jr^I; Rinaldo A. Mota^II; Sérgio S. AzevedoI,^*

^IUnidade Acadêmica de Medicina Veterinária (UAMV), Centro de Saúde e Tecnologia Rural (CSTR), Universidade Federal de Campina Grande (UFCG), Avenida Universitária s/n, Bairro Santa Cecília, Patos, PB 58700-970, Brasil

^IILaboratório de Bacterioses da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Rua Dom Manoel de Medeiros s/n, Dois Irmãos, Recife, PE 52171-900, Brasil

RESUMO

Foi realizado um estudo da mastite subclínica em nove rebanhos de cabras leiteiras no semiárido paraibano com o objetivo de determinar a ocorrência da infecção, avaliar o perfil microbiológico e celular do leite, testar a sensibilidade dos microorganismos isolados frente a antimicrobianos além de identificar os fatores de risco. Foram utilizadas 131 cabras leiteiras das quais foram colhidas 261 amostras de leite para exame microbiológico e 131 para contagem de células somáticas (CCS). Na ocasião das colheitas foi realizado o California Mastitis Test (CMT) e aplicado um questionário epidemiológico por propriedade. Houve crescimento bacteriano em 30 amostras (11,49%) com 25 (83,33%) dos isolados identificados como Staphylococcus coagulase negativa e cinco (16,66%) Staphylococcus aureus. A média de CCS foi de 1,39x10⁶ células/ml. O CMT apresentou baixa sensibilidade (46,7%) e baixa especificidade (60,6%) quando comparado ao exame microbiológico. A gentamicina e a associação da neomicina, bacitracina e tetraciclina foram os antimicrobianos contra os quais os microrganismos isolados apresentaram 100% de sensibilidade. Penicilina e ampicilina foram os de maiores índices de resistência (66,67% e 63,89%, respectivamente). A caprinocultura não ser a atividade principal da propriedade e o não isolamento de animais doentes, foram identificados como fatores de risco para a mastite subclínica caprina nas propriedades estudadas. Programas de controle e profilaxia da mastite devem ser implementados enfocando as medidas de higiene na ordenha e correção dos fatores de risco identificados nesse estudo.

Termos de indexação: Cabras, lactocultura, leite, bactérias, inflamação, glândula mamária.

ABSTRACT

A subclinical mastitis study was conducted in nine dairy goat herds in the semi-arid region of Paraíba state, Northeastern Brazil, to determine the occurrence of infection, to evaluate microbiological and cellular profiles of the milk, to test the sensitivity of isolated microorganisms to antimicrobials, and to identify risk factors. One hundred thirty-one dairy goats were used, 261 samples were collected for microbiological culture and 131 samples for somatic cells count (SCC). During collection, the California Mastitis Test (CMT) was conducted and an epidemiological questionnaire was applied for each herd. There was bacterial growth in 30 samples (11.49%), with 25 (83.33%) coagulase-negative Staphylococcus and five (16.66%) Staphylococcus aureus isolated. The SCC mean was 1.39x10⁶ cells/ml. CMT presented low sensitivity (46.7%) and low specificity (60.6%) compared with microbiological culture. Gentamicin and the association of neomycin, bacitracin and tetracyclin were the antimicrobials against which the microorganisms isolated showed 100% sensitivity. Penicillin and ampicillin had the greatest resistance rates (66.67% and 63.89%, respectively). Goat breeding is not the main activity on the farms and do not isolate diseased animals were identified as risk factors for caprine subclinical mastitis. Program for the control and prophylaxis of mastitis must be implemented focusing primarily on hygiene cares at milking and correction of the risk factors identified in this study.

Index terms: Goats, milk culture, milk, bacteria, inflammation, mammary gland.

INTRODUÇÃO

Mastite é a denominação do processo inflamatório da glândula mamária, classificada quanto à forma de apresentação em clínica e subclínica e quanto à forma de transmissão em primária (contagiosa) e secundária (ambiental) (Mendonça et al. 1999). Embora a mastite clínica seja responsável por perdas expressivas, a mastite subclínica tem elevada importância econômica em decorrência dos prejuízos na produção e é de maior ocorrência (Gross et al. 1987, Marco Melero 1994). Estima-se que as perdas na produção de leite de cabras portadoras de mastite subclínica possam variar de 55 a 132 kg de leite/ano e uma redução de 3g de gordura/kg leite por animal (Baudry et al. 1997).

A mastite clínica caprina é causada, principalmente, por Staphylococcus coagulase positivos (Staphylococcus aureus) e a mastite subclínica, sobretudo, por Staphylococcus coagulase negativos (SCN). Os principais SCN são S. epidermidis, S. chromogenes e S. simulans, S. caprae e S. agalactiae (Contreras et al. 2003).

O diagnóstico da mastite subclínica em cabras é controverso e dessa forma várias técnicas têm sido estudadas, sendo as mais aceitas o California Mastitis Test (CMT), pela facilidade de uso a campo e a contagem de células somáticas (CCS), em razão de sua sensibilidade e especificidade (Contreras et al. 1996).

Em relação ao tratamento existe a crescente preocupação com a resistência bacteriana aos antimicrobianos convencionais, o que alerta para a necessidade da adoção de protocolos terapêuticos na mastite caprina, de preferência, respaldados em testes de sensibilidade antimicrobiana in vitro (Silva et al. 2004).

Estudos demonstraram que fatores de risco relacionados ao animal, ao ambiente e aos procedimentos de manejo estão associados à saúde da glândula mamária em rebanhos leiteiros (Omore et al. 1996, Peeler et al. 2000). O conhecimento das diversas condições que contribuem para maior ocorrência da mastite subclínica é de grande importância para a escolha de estratégias adequadas de prevenção e controle.

Tendo em vista a importância da caprinocultura para a região Nordeste do Brasil, as perdas econômicas ocasionadas pela mastite e a escassez de informações sobre essa doença em caprinos, objetivou-se com este trabalho estudar a ocorrência da mastite subclínica, avaliar o perfil microbiológico, celular do leite e de resistência antimicrobiana in vitro, além de identificar os fatores de risco associados à infecção em cabras leiteiras no semiárido da Paraíba.

MATERIAL E MÉTODOS

O trabalho foi realizado em nove rebanhos localizados no semiárido da Paraíba no período de maio/junho de 2008. As propriedades A e B estão localizadas no município de Santa Terezinha, propriedade C no município de Amparo, propriedade D no município de Catingueira, propriedade E no município de São Mamede, propriedades F e G no município de São José do Sabugi, propriedade H no município de Passagem e propriedade I no município de Monteiro. Não foram aplicados critérios probabilísticos para a escolha das propriedades estudadas, sendo a inclusão das mesmas feitas com base no relacionamento prévio dos proprietários com a unidade de pesquisa.

Foram utilizadas 131 cabras em diferentes estágios de lactação das quais foram colhidas 261 amostras de leite para exame microbiológico, considerando-se as duas metades do úbere. Para a CCS foram utilizadas 131 amostras. Na ocasião da visita às propriedades foram aplicados questionários epidemiológicos com o objetivo de coletar dados para a análise de possíveis fatores de risco associados à mastite caprina.

Antes da ordenha e com os três primeiros jatos de leite realizou-se o CMT que foi interpretado como nenhuma reação (N); traços (T); 1+; 2+ e 3+ (Schalm et al. 1971).

Para a colheita do leite para CCS foram utilizados frascos e conservantes apropriados (Bronopol)¹, colhendo-se no mesmo frasco porções equivalentes dos dois tetos. Para o exame microbiológico do leite foram colhidos 10ml de leite de cada teto em tubos de ensaio estéreis, acondicionados em caixas isotérmicas com gelo e transportados ao laboratório.

As análises de CCS foram realizadas na Universidade Federal Rural de Pernambuco pelo Programa de Gerenciamento de Rebanhos Leiteiros do Nordeste (PROGENE). Foi utilizado o equipamento eletrônico SomaCount 300², pelo método de citometria de fluxo, de acordo com as recomendações técnicas do equipamento.

Para o cultivo e identificação de bactérias foram realizadas técnicas convencionais no Laboratório de Microbiologia do Centro de Saúde e Tecnologia Rural (CSTR) da Universidade Federal de Campina Grande (UFCG), Campus de Patos. As amostras de leite foram semeadas em ágar sangue enriquecido com 5% de sangue de ovino e as placas foram incubadas a 37ºC, realizando-se leituras após 24 e 48 horas. Posteriormente observaram-se as características de crescimento como tamanho e coloração das colônias, produção de hemólise, além das características morfotintoriais por meio da técnica de coloração de Gram. Para a identificação bacteriana foram realizadas as seguintes provas bioquímicas: catalase, coagulase, produção de acetoína, DNase e metabolismo de carboidratos (Glicose e Manitol).

Para o estudo do perfil de resistência aos antimicrobianos in vitro, os isolados foram submetidos à técnica de difusão de discos em placas contendo meio ágar Mueller-Hinton (Bauer et al. 1966). Foram utilizados os seguintes antimicrobianos: ampicilina³ 30mcg, tetraciclina³ 30mcg, oxacilina³ 1mcg, amicacina³ 30mcg, penicilina³ 10 UI, norfloxacina³ 10mcg, cefalotina³ 30mcg, cefoxitina³ 30mcg, cefalexina³ 30mcg, amoxicilina³ 10mcg, cefquinona³ 30mcg, gentamicina³ 10mcg, cefalonion³ 30mcg, NBT³ (neomicina 30mcg, bacitracina 10mcg e tetraciclina 30mcg), enrofloxacina³ 5mcg e florfenicol³ 30mcg. A interpretação dos resultados foi realizada de acordo com a NCCLS (2009).

A comparação das médias da CCS entre as amostras positivas e negativas no CMT e no isolamento bacteriano foi realizada com o teste U de Mann-Whitney, com nível de significância de 5% (Zar 1999). Na avaliação do desempenho do CMT frente ao isolamento bacteriano foram determinadas a sensibilidade (Sen), especificidade (Esp) e indicador de concordância Kappa (Pereira 1995, Thrusfield 1995). O teste de hipóteses foi conduzido pelo teste de McNemar com nível de significância de 5% (Siegel & Castellan Jr 2006). Para os cálculos foi utilizado o programa Dag Stat (Diagnostic and Agreement Statistics) (Mackinnon 2000).

Para a análise dos fatores de risco associados à mastite subclínica foram utilizados os dados obtidos com os questionários epidemiológicos aplicados nas propriedades. A análise foi efetuada em duas etapas: análise univariada e análise multivariada. Na análise univariada cada variável independente foi cruzada com a variável dependente (condição sanitária do animal). Um animal foi considerado positivo quando foi positivo no exame microbiológico. As que apresentaram um valor de P<0,2 pelo teste de qui-quadrado (Zar 1999), foram selecionadas e oferecidas para a análise multivariada, utilizando-se a regressão logística múltipla (Hosmer & Lemeshow 2000). O nível de significância adotado na análise múltipla foi de 5%. O ajuste do modelo final foi verificado com o teste de Hosmer & Lemeshow (2000), no qual um P>0,05 indica que o modelo está ajustado. A colinearidade entre as variáveis preditoras foi verificada através de análise de correlação, e para aquelas que apresentaram forte colinearidade (coeficiente de correlação >0,9), uma das duas foi excluída da análise múltipla de acordo com a plausibilidade biológica (Dohoo et al. 1996). As análises foram realizadas com o programa SPSS for Windows versão 13.0.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Não foram identificados casos de mastite clínica nos animais por meio do exame físico da glândula mamária. De um modo geral, as mastites clínicas em caprinos são pouco freqüentes (Contreras et al. 1999), contudo em situações de campo pode-se observar casos de mastite gangrenosa em cabras causadas principalmente por Staphylococcus aureus. Pesquisas em rebanhos de caprinos leiteiros indicam que a freqüência aceitável de mastite varia de 13 a 20% (Pugh 2002). Nesse estudo, o índice de masite subclínica identificada por meio do exame microbiológico do leite foi de 11,49% do total das 261 amostras estudadas, indicando que a infecção encontra-se dentro dos limites aceitáveis. Ao analisar as propriedades isoladamente, observou-se que a H apresentou freqüência (30%) acima do índice esperado para a espécie (Quadro 1).

Das 261 amostras de leite, 30 (11,49%) apresentaram crescimento bacteriano, sendo a maioria SCN, em 25 (83,33%) das amostras positivas em apenas 5 (16,66%) amostras positivas foram identificados Staphylococcus aureus (Quadro 1).

Na propriedade H obteve-se o maior número de isolados; de 30 amostras analisadas, nove (30%) apresentaram crescimento bacteriano e todos os isolados foram classificados como Staphylococcus coagulase negativo (SCN). Ainda foram identificados S. aureus nas propriedades C e F, com um isolamento em cada; a propriedade E apresentou três isolados de S. aureus, totalizando as cinco amostras com crescimento desse agente; as outras amostras com crescimento positivo foram SCN. Nas demais propriedades (A, B, D, G e I) todos os isolados foram de SCN.

Nesse estudo, SCN foram as bactérias mais freqüentes, concordando com os resultados obtidos anteriormente em outros trabalhos que afirmam que os SCN são os principais agentes isolados na mastite subclínica em caprinos (Mota et al. 2000, Muricy 2003). Essas bactérias apresentam importância epidemiológica, pois podem causar mastite subclínica durante toda a lactação ou mesmo no período seco (Poutrel et al. 1997), tornando os animais infectados fontes de infecção em potencial no rebanho. Some-se a isso a importância econômica desses agentes, que causam prejuízos aos produtores principalmente devido à redução na produção de leite (Leitner et al. 2004).

Esses achados alertam para a importância da realização do pré e pós dipping e a realização da ordem das cabras ("prática da linha") na ordenha. A mastite pode ser transmitida de um animal infectado para outro sadio, principalmente, durante a ordenha (Costa 1998, Prestes et al. 2003). Em pequenos ruminantes, a desinfecção do teto pós-ordenha tem sido utilizado principalmente em grandes rebanhos infectados (Paape et al. 2001, Bergonier & Berthelot 2003, Contreras et al. 2003), sendo revelado um método muito eficaz para prevenir novas infecções intramamárias. Nickerson et al. (1995) verificaram que mastite causada por SCN ocorre com maior freqüência em cabras do que em vacas ou ovelhas. Sobre esse aspecto as propriedades estudadas não empregavam esse manejo de desinfecção dos tetos e provavelmente a ausência dessa prática elevou os índices de mastite subclínica nos rebanhos.

No presente trabalho, das 261 amostras de leite analisadas, 105 (40,22%) foram positivas no CMT e apenas 30 (11,49%) foram positivas no exame microbiológico (Quadro 2). Ainda do total de amostras, 14 (5,36%) foram positivas no CMT e na lactocultura; 140 (53,63%) foram negativas em ambos os testes; 91 (34,86%) foram positivas ao CMT e negativas ao exame microbiológico e 16 (6,13%) não apresentaram reação no CMT, mas se observou crescimento bacteriano. Considerando-se o exame bacteriológico como "padrão-ouro", o CMT apresentou baixa sensibilidade (46,7%) e baixa especificidade (60,6%), bem como a concordância entre os testes foi fraca (Kappa = 0,003). Com base nesses resultados, constata-se que o CMT não é um método confiável para o diagnóstico da mastite subclínica em cabras, apresentando elevado número de falsos positivos, o que concorda com os achados de Winter & Baumgartner (1999) e Silva et al. (2001).

A média da CCS em amostras positivas no exame microbiológico foi de 1,49x10⁶ células/ml e nas amostras negativas foi de 1,35x10⁶ células/ ml. Verificou-se que não houve diferença significativa (P>0,05) na CCS entre amostras positivas e negativas no cultivo bacteriano. Já nas amostras positivas no CMT (considerando positivo acima de 1+), a média foi de 1,98x10⁶ células/ml e as amostras negativas no CMT apresentaram 0,75x10⁶ células/ ml, onde foi constatada diferença significativa (P<0,05). Dos métodos que avaliam o conteúdo celular no leite, o CMT e a CCS são os mais utilizados, sendo que uma relação direta entre estes dois testes foi encontrada por vários autores (Gallina et al. 1996, Perrin et al. 1997, Schuppel & Schwope 1998).

Os testes que quantificam a celularidade no leite caprino não são viáveis para monitorar a saúde do úbere (Silva et al. 1999, Paape 2000), pois a quantidade dos diferentes tipos de células somáticas é afetada de forma significativa por fatores fisiológicos como: processo de secreção do tipo apócrina e aumento da CCS no final da lactação (Manlongat et al. 1998). Devido a essas diferenças na glândula mamária em cabras é comum encontrar um grande percentual de amostras de leite negativas ao exame bacteriológico com contagens de células somáticas superiores a 1.000x10³ céls/ml e reação positiva ao CMT (Lima Júnior et al. 1994, Wilson et al. 1995).

No presente estudo a média de CCS foi de 1,39 x 10⁶ células/ ml, que ultrapassa o valor máximo de 1.000 x 10³ células/ml estabelecido como limite entre o fisiológico e o patológico por Kalogridou-Vassiliadou et al. (1992). Entretanto, está abaixo de 2.000 x 10³ células/ml proposto por Rota et al. (1994) como o valor máximo de células admissíveis fisiologicamente no leite caprino.

No Quadro 3 estão apresentados os resultados do perfil de sensibilidade e resistência in vitro dos SCN frente aos antimicrobianos. A gentamicina e a associação da neomicina, bacitracina e tetraciclina foram os antimicrobianos contra os quais os microrganismos isolados apresentaram 100% de sensibilidade. Em estudos realizados em isolados de Staphylococcus spp. de mastite subclínica caprina foi também observada alta sensibilidade frente à gentamicina (Guha et al. 1989, Lima Júnior et al. 1993, Langoni et al. 2006). A cefoxitina, cefquinona, cefalônio, enrofloxacina e florfenicol apresentaram eficácia acima de 90%. Os antimicrobianos oxacilina, amicacina, norfloxacina, cefalotina e cefalexina também apresentaram boa sensibilidade, variando entre 80% e 90%.

Os antimicrobianos contra os quais se verificaram os maiores índices de resistência das amostras isoladas de Staphylococcus spp. foram penicilina e ampicilina (66,67% e 63,89%, respectivamente). Resultados similares foram obtidos por Langoni et al. (2006). Moroni et al. (2005) demonstraram a resistência dos isolados de SCN a amoxacilina, contudo a sensibilidade aos demais beta-lactâmicos (ampicilina e penicilina G) foi variada. Os mesmos autores demonstraram baixa sensibilidade destes agentes à tetraciclina, semelhante ao observado no presente estudo.

Na análise de fatores de risco para a mastite subclínica caprina, as variáveis associadas com a ocorrência da infecção na análise univariada foram a caprinocultura não ser a principal atividade da propriedade, tipo de criação extensivo, tipo de exploração leiteira, realização de tratamento quando é observada alteração no teto, não realização de tratamento quando é observada alteração no leite, não limpar os tetos, não higienizar a sala e os equipamentos de ordenha, não isolar animais doentes, não vermifugar animais recém chegados, não esterilizar o material de aplicação de medicamentos e não limpar as instalações (Quadro 4).

Foram identificados como fatores de risco associados à mastite subclínica caprina no modelo final da regressão logística (Quadro 5), a caprinocultura não ser a atividade principal da propriedade e o não isolamento de animais doentes. Pelo teste de Hosmer e Lemeshow (2000) o modelo final apresentou um bom ajuste (χ²=1,036; p=0,904). O elevado valor das odds ratios dos fatores de risco pode não refletir o risco real e pode ser justificado pelo número de animais utilizados. No entanto, ambas as variáveis apresentaram significância estatística (p<0,05; IC 95% da odds ratio sem o valor 1).

A caprinocultura leiteira não ser a principal atividade da propriedade como um fator de risco pode ser justificada pela associação à utilização de instalações, técnicas e manejo não adequados para produção de leite caprino nessas propriedades, bem como assistência técnica deficiente, baixo nível de organização, falta de controle sanitário efetivo e falta da mão de obra especializada. O não isolamento de animais doentes, também apontado como fator de risco, resulta na transmissão horizontal, podendo haver infecção de outros animais por equipamentos ou pelas mãos do ordenhador.

Neste estudo, outros fatores embora não identificados como de risco para a mastite subclínica merecem ser destacados. A não higienização da sala e equipamentos de ordenha e não esterilizar o material de aplicação de medicamentos foram associados à ocorrência da mastite na análise univariada. A manutenção dos animais em ambientes higiênicos, secos e confortáveis visa em primeiro plano minimizar os problemas relativos às mastites ambientais e indiretamente tem reflexo nos índices de mastite contagiosa. Animais com úberes sujos exigem maiores cuidados na ordenha. A limpeza do equipamento e utensílios é tão importante quanto o manejo e higiene da ordenha, sendo fundamental para o controle não só da mastite como de outras infecções (Mota 2007).

Dados quanto à etiologia e susceptibilidade in vitro dos microrganismos frente aos antimicrobianos testados neste trabalho, bem como quanto à análise de fatores de risco, demonstram a necessidade da implantação de programa de controle e profilaxia da mastite caprina enfocando as medidas de higiene na ordenha e correção dos fatores de risco identificados nesse estudo.

Recebido em 21 de maio de 2009.

Aceito para publicação em 16 de dezembro de 2009.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  29 Jul 2010
• Data do Fascículo
  Maio 2010

Histórico

• Recebido
  21 Maio 2009
• Aceito
  16 Dez 2009