Uso de PCR e sequenciamento do rDNA 16S para identificação de bactérias do gênero Staphylococcus isoladas de mastite bovina

Lange, Carla C.; Brito, Maria A.V.P.; Brito, José R.F.; Arcuri, Edna F.; Souza, Guilherme N.; Machado, Marco A.; Domingues, Robert; Salimena, Alessandra P.S.

doi:10.1590/S0100-736X2011000100006

Resumos

O objetivo deste trabalho foi identificar espécies de Staphylococcus (n=100) isoladas de mastite em rebanhos bovinos do Estado de Minas Gerais. Para esta finalidade foram utilizadas reações de PCR empregando oligonucleotídeos iniciadores descritos anteriormente para amplificar genes específicos de S. aureus (femA), S. intermedius (rDNA 16S) e S. hyicus (rDNA 16S-23S) e o sequenciamento do rDNA 16S. De acordo com as reações de PCR, 83 isolados foram identificados como S. aureus, 13 isolados como S. intermedius, dois como S. hyicus e dois isolados não foram identificados. Foram submetidos ao sequenciamento do rDNA 16S seis isolados identificados como S. aureus e os 17 restantes. Os seis isolados identificados como S. aureus confirmaram essa identificação. Dos outros 17 isolados, 13 foram identificados como S. chromogenes e quatro como S. hyicus, com similaridade igual ou superior a 99%. Baseando-se nos resultados da reação de PCR do gene femA e do sequenciamento do rDNA 16S, foram identificados 83 S. aureus, 13 S. chromogenes e quatro S. hyicus. Neste estudo os oligonucleotídeos iniciadores empregados na reação de PCR para S. intermedius não foram específicos, pois amplificaram também S. chromogenes; e os empregados na reação de PCR para S. hyicus não foram sensíveis, pois falharam na identificação de dois isolados de S. hyicus. A identificação definitiva das duas últimas espécies somente foi possível pelo sequenciamento do rDNA 16S.

Estafilococos coagulase positivos; estafilococos coagulase negativos; infecção intramamária; Staphylococcus aureus; S. chromogenes; S. hyicus

The objective of this study was to identify the species of 100 isolates of Staphylococcus from mastitis in dairy cows from herds located in the state of Minas Gerais, Brazil. PCR reactions were carried out using specific primers described previously for S. aureus (femA gene), S. intermedius (16S rDNA) and S. hyicus (16S-23S rDNA spacer region). In addition, products of amplification of variable regions of the 16S rDNA gene of the strains were sequenced. According to the results of the PCR, 83 strains were identified as S. aureus, 13 as S. intermedius, two as S. hyicus and two isolates were not identified. The sequencing of 16S rDNA was applied to 23 strains identified by PCR amplifications: six S. aureus and the strains identified as S. intermedius (n=13), S. hyicus (n=2) or not identified (n=2). The sequencing of 16S rDNA confirmed the six strains as S. aureus. The others 17 strains were identified as S. chromogenes (13 isolates) and S. hyicus (four isolates). Each sample was related to a specie according to the smallest E-value and highest similarity (> 99%). The identification of S. hyicus and S. chromogenes was accomplished only by 16S rDNA sequencing.

Coagulase-positive staphylococci (CPS); coagulase-negative staphylococci (CNS); intramammary infection; Staphylococcus aureus; S. chromogenes; S. hyicus

ANIMAIS DE PRODUÇÃO

Carla C. Lange^{I, *}; Maria A.V.P. Brito^I; José R.F. Brito^II; Edna F. Arcuri^I; Guilherme N. Souza^I; Marco A. Machado^I; Robert Domingues^III; Alessandra P.S. Salimena^IV

^IEmbrapa Gado de Leite, Rua Eugênio do Nascimento 610, Juiz de Fora, MG 36038-330, Brasil. E-mail: clange@cnpgl.embrapa.br

^IIPólo de Excelência do Leite/SECTES (Secretaria Estadual de Ciência, Tecnologia e Ensino Superior), Rua Eugênio do Nascimento 610, Juiz de Fora, MG

^IIIBiólogo, Bolsista de Apoio Técnico da Fapemig, Rua Raul Pompéia 101, Belo Horizonte, MG 30330-080, Brasil

^IVEstudante do Curso de Biologia, Centro de Ensino Superior de Juiz de Fora (CES/JF), Av. Luz Interior 345, Bairro Estrela Sul, Juiz de Fora, MG 36030-776

ABSTRACT

The objective of this study was to identify the species of 100 isolates of Staphylococcus from mastitis in dairy cows from herds located in the state of Minas Gerais, Brazil. PCR reactions were carried out using specific primers described previously for S. aureus (femA gene), S. intermedius (16S rDNA) and S. hyicus (16S-23S rDNA spacer region). In addition, products of amplification of variable regions of the 16S rDNA gene of the strains were sequenced. According to the results of the PCR, 83 strains were identified as S. aureus, 13 as S. intermedius, two as S. hyicus and two isolates were not identified. The sequencing of 16S rDNA was applied to 23 strains identified by PCR amplifications: six S. aureus and the strains identified as S. intermedius (n=13), S. hyicus (n=2) or not identified (n=2). The sequencing of 16S rDNA confirmed the six strains as S. aureus. The others 17 strains were identified as S. chromogenes (13 isolates) and S. hyicus (four isolates). Each sample was related to a specie according to the smallest E-value and highest similarity (> 99%). The identification of S. hyicus and S. chromogenes was accomplished only by 16S rDNA sequencing.

Index terms: Coagulase-positive staphylococci (CPS), coagulase-negative staphylococci (CNS), intramammary infection, Staphylococcus aureus, S. chromogenes, S. hyicus.

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi identificar espécies de Staphylococcus (n=100) isoladas de mastite em rebanhos bovinos do Estado de Minas Gerais. Para esta finalidade foram utilizadas reações de PCR empregando oligonucleotídeos iniciadores descritos anteriormente para amplificar genes específicos de S. aureus (femA), S. intermedius (rDNA 16S) e S. hyicus (rDNA 16S-23S) e o sequenciamento do rDNA 16S. De acordo com as reações de PCR, 83 isolados foram identificados como S. aureus, 13 isolados como S. intermedius, dois como S. hyicus e dois isolados não foram identificados. Foram submetidos ao sequenciamento do rDNA 16S seis isolados identificados como S. aureus e os 17 restantes. Os seis isolados identificados como S. aureus confirmaram essa identificação. Dos outros 17 isolados, 13 foram identificados como S. chromogenes e quatro como S. hyicus, com similaridade igual ou superior a 99%. Baseando-se nos resultados da reação de PCR do gene femA e do sequenciamento do rDNA 16S, foram identificados 83 S. aureus, 13 S. chromogenes e quatro S. hyicus. Neste estudo os oligonucleotídeos iniciadores empregados na reação de PCR para S. intermedius não foram específicos, pois amplificaram também S. chromogenes; e os empregados na reação de PCR para S. hyicus não foram sensíveis, pois falharam na identificação de dois isolados de S. hyicus. A identificação definitiva das duas últimas espécies somente foi possível pelo sequenciamento do rDNA 16S.

Termos de indexação: Estafilococos coagulase positivos, estafilococos coagulase negativos, infecção intramamária, Staphylococcus aureus, S. chromogenes, S. hyicus.

INTRODUÇÃO

Bactérias do gênero Staphylococcus estão entre os principais agentes etiológicos da mastite bovina. Entre as espécies mais frequentemente isoladas, S. aureus é um patógeno primário, responsável por infecções clínicas e subclínicas e altas contagens de células somáticas (CCS) no leite (National Mastitis Council 2004). Duas outras espécies coagulase positivas, S. hyicus e S. intermedius têm sido relatadas como causas de mastite, mas são encontradas menos frequentemente nos rebanhos leiteiros (Hodges et al. 1984, Roberson et al. 1996, Capurro et al. 1999, Gianneechini et al. 2002). As demais espécies de Staphylococcus, classificadas como coagulase negativas, são consideradas patógenos secundários. O grupo dos Staphylococcus coagulase negativos compreende cerca de 40 espécies e subespécies (Bannerman 2003), cuja identificação completa depende de muitos testes fenotípicos ou de testes moleculares, nem sempre disponíveis na rotina do diagnóstico microbiológico. A presença de estafilococos coagulase negativos na glândula mamária está, geralmente, associada a quadros moderados de inflamação. Entretanto, em rebanhos com baixa CCS essas bactérias contribuem para o aumento da CCS do leite total do rebanho (Schukken et al. 2009).

A taxonomia do gênero Staphylococcus foi melhor esclarecida nos últimos anos graças ao emprego de técnicas de biologia molecular que permitiram relacionar ou comparar os resultados dos testes fenotípicos e genotípicos. Novas espécies foram descritas (Foster et al. 1997, Devriese et al. 2005) e reclassificações ocorreram (Sasaki et al. 2007). Entre esses métodos, a análise comparativa da sequência de determinados genes de macromoléculas conservadas tem sido empregada para a classificação de microrganismos. Um exemplo dessas macromoléculas é o RNA ribossomal, essencial para a sobrevivência dos organismos, e altamente conservado entre as bactérias. O sequenciamento do gene do RNA ribossomal 16S tem sido extensivamente usado com finalidade taxonômica e filogenética (Becker et al. 2004) e é considerado o método de referência para a identificação bacteriana (Nolte & Caliendo 2003). As sequências encontradas são comparadas com aquelas depositadas em bancos de dados, como o National Center for Biotechnology Information (NCBI) e Ribosomal Differentiation of Microrganisms (RIDOM) (Becker et al. 2004).

O objetivo deste trabalho foi identificar espécies de Staphylococcus isoladas de mastite bovina no Estado de Minas Gerais, presuntivamente identificadas como Staphylococcus coagulase positivos. Para esta finalidade foram utilizadas reações de PCR para amplificar genes específicos das espécies S. aureus, S. intermedius e S. hyicus e o sequenciamento do rDNA 16S.

MATERIAL E MÉTODOS

Isolados bacterianos

O trabalho experimental foi realizado no Laboratório de Microbiologia do Leite, Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora/MG. Foram analisados 100 isolados de Staphylococcus spp. oriundos de vacas bovinas com mastite clínica ou subclínica, presuntivamente identificados como coagulase positivos. Os isolados se originaram de um estudo anterior, realizado em propriedades leiteiras de diferentes municípios do Estado de Minas Gerais, nos anos de 2002 e 2003 (Souza et al. 2009). As bactérias foram classificadas no gênero Staphylococcus de acordo com as características das colônias em ágar-sangue, morfologia e coloração de Gram, teste de catalase, Voges-Proskauer (produção de acetoína) e coagulase (NMC 2004). As bactérias permaneceram estocadas a -20ºC e a -80ºC em meio contendo leite em pó desnatado e glicerol até o momento dos testes moleculares.

Reações de PCR

Todos os isolados foram submetidos a três diferentes reações de PCR, visando à identificação de três espécies coagulase positivas, S. aureus, S. hyicus e S. intermedius. Para identificação de S. aureus foram usados oligonucleotídeos descritos por Mehrotra et al. (2000), que amplificam um fragmento do gene femA, de 132 pares de bases (pb). Para a identificação de S. intermedius foram usados oligonucleotídeos descritos por Wakita et al. (2002), que amplificam um fragmento do rDNA 16S, de 901 pb. E para a identificação de S. hyicus foram usados oligonucleotídeos descritos por Forsman et al. (1997), que amplificam um fragmento do rDNA 16S-23S, de 250 pb.

A extração de DNA das culturas foi realizada de acordo com Hesselbarth & Schwarz (1995). O DNA foi quantificado em espectrofotômetro (GeneQuantpro, Amersham Biosciences) e as quantidades ajustadas para a reação de PCR (50-100 μg/μl).

Para a amplificação do gene femA, as reações foram incubadas a 94ºC por 4 min., submetidas a 5 ciclos de 94ºC por 45 seg., 56ºC por 45 seg. e 72ºC por 45 seg.; 20 ciclos de 72ºC por 45 seg., 94ºC por 45 seg. e 72ºC por 45 seg.; e uma extensão final de 72ºC por 5 min. Para amplificação dos genes rDNA 16S e rDNA 16S-23S, as reações foram incubadas a 94ºC por 5 min., submetidas a 25 ciclos de 94ºC por 1 min., 53ºC por 1 min. e 72ºC por 1 min. e 30 seg., com uma extensão final de 72ºC por 10 minutos. A reações foram realizadas em termociclador (GeneAmp® PCR System 9700, Applied Biosystems) e os fragmentos de DNA amplificados foram visualizados após eletroforese em gel de agarose (1,5%, p/v), corados com solução de brometo de etídio (0,005%, p/v). O registro das imagens foi feito em fotodocumentador (Eagle Eye II, Stratagene).

As cepas-padrão S. aureus ATCC 51651, S. hyicus ATCC 11249, S. intermedius ATCC 29663, S. capitis ATCC 35661, S. epidermidis ATCC 12228, S. gallinarum 700401, S. haemolyticus ATCC 29970, S. lentus ATCC 700403, S. lugdunensis ATCC 49576, S. saprophyticus ATCC 15305, S. sciuri ATCC 29061, S. simulans ATCC 27851, S. warneri ATCC 49454 e S. xylosus ATCC 29971 foram usadas como controles das reações.

Sequenciamento do rDNA 16S

Foram submetidos ao sequenciamento do rDNA 16S seis isolados identificados como S. aureus (pelo PCR do gene femA) e todos os isolados não identificados como S. aureus. As cepas-padrão citadas acima foram usadas como controles.

O DNA bacteriano foi extraído como citado anteriormente. O DNA foi amplificado por PCR com os oligonucleotídeos 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' e 5'-GTATTACCGCGGCTG CTG-3', que amplificam um produto de 536 pb. O programa de PCR iniciou-se com uma etapa de desnaturação de 5 min., seguida de 35 ciclos de 95°C por 30 seg., 55ºC por 30 seg. e 74ºC por 2 min., com uma extensão final de 74ºC por 5 min. Os produtos obtidos foram purificados com um kit de purificação (illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK), de acordo com as especificações do fabricante. Uma alíquota de 200ng do DNA purificado foi usada como matriz para as reações de sequenciamento, nas quais foi utilizado o kit de sequenciamento DYEnamic ET Dye Termi-nator Cycle Sequencing Kit (GE Healthcare, NYSE, Germany) e 0,5μM do mesmo oligonucleotídeo utilizado para a reação de PCR. As reações de sequenciamento foram precipitadas com etanol, inseridas no equipamento MegaBACE 1000 DNA sequencer (GE Healthcare, NYSE, Germany) e submetidas a 6 kV por 160 min. As reações foram preparadas separadamente com os dois oligonucleotídeos iniciadores de modo a se obter duas sequências para cada amostra analisada.

Os pares de sequências foram editados e reunidos utilizando-se o software SeqMan (LaserGene package, DNASTAR). As sequências resultantes foram comparadas com sequências bacterianas depositadas na base de dados do NCBI.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As reações de PCR para amplificação dos genes femA (Staphylococcus aureus), rDNA 16S (S. intermedius) e rDNA 16S-23S (S. hyicus) foram inicialmente estabelecidas com as cepas-padrão citadas no Material e Métodos. Apresentaram produtos de amplificação específicos para os genes citados acima S. aureus ATCC 51651, S. intermedius ATCC 29663 e S. hyicus ATCC 11249, respectivamente.

Dos 100 isolados, 83 apresentaram um produto de amplificação (132 pb) na reação de PCR para S. aureus, enquanto que 17 isolados não apresentaram nenhum produto de amplificação nesta reação. Treze isolados apresentaram um produto de amplificação de 901 pb na reação de PCR para identificar S. intermedius (87 isolados foram negativos). Dois isolados apresentaram um produto de amplificação específico de 250 pb na reação de PCR para identificar S. hyicus, além de um fragmento inespecífico de cerca de 400 pb, cuja ocorrência também foi relatada por Forsman et al. (1997). Os demais isolados (n=98) foram negativos nesta reação. Resumindo, pelas reações de PCR, 83 isolados foram identificados como S. aureus, 13 isolados como S. intermedius, dois como S. hyicus e dois isolados não foram identificados (Quadro 1).

Dos 83 isolados identificados como S. aureus pela reação de PCR do femA, todos apresentaram resultado positivo na prova da coagulase em tubo e 77 deles (93%) apresentaram resultado positivo no teste de Voges-Proskauer. Nenhum isolado de S. chromogenes e S. hyicus foi positivo no teste de Voges-Proskauer, confirmando a importância deste teste na identificação fenotípica de S. aureus.

Em virtude da coincidência dos resultados dos testes fenotípicos e do PCR do femA, seis isolados foram submetidos ao sequenciamento do rDNA 16S para a confirmação da identidade. Os 17 isolados restantes, não identificados como S. aureus, foram também submetidos ao sequenciamento do rDNA 16S, além das 14 cepas-padrão citadas anteriormente. O sequenciamento confirmou a identificação dos seis isolados de S. aureus. Treze isolados foram identificados como S. chromogenes e quatro isolados como S. hyicus.

A identidade das quatorze cepas-padrão incluídas neste estudo também foi confirmada pelo sequenciamento. Cada isolado foi relacionado a uma espécie de acordo com o menor valor E (E-value) e a maior similaridade. Todos os isolados apresentaram similaridade maior ou igual a 99%. Apenas um isolado apresentou o valor E diferente de zero (a cepa-padrão S. intermedius ATCC 29663).

No fragmento de 536 pb sequenciado, o número de pares de bases diferentes entre as espécies avaliadas variou de 6 a 28. Entre S. aureus e S. hyicus houve diferença em 22 pares de bases, entre S. aureus e S. intermedius (cepa-padrão) foram encontradas diferenças em 28 pares de bases e entre S. aureus e S. chromogenes, em 23 pares de bases. Entre S. hyicus e S. intermedius (cepa-padrão) foram encontradas diferenças em seis pares de bases, entre S. hyicus e S. chromogenes, em nove pares de bases e entre S. intermedius (cepa-padrão) e S. chromogenes, também uma diferença em nove pares de bases. Concluindo, entre S. aureus e as outras três espécies (S. hyicus, S. chromogenes e S. intermedius) o número de pares de bases não coincidentes foi maior do que 20, enquanto que entre as espécies S. hyicus, S. chromogenes e S. intermedius o número de pares de bases não coincidentes foram de seis a nove. Portanto, neste fragmento de 536 pb, houve uma grande similaridade entre S. hyicus, S. intermedius e S. chromogenes.

Com a identificação da espécie S. chromogenes pelo sequenciamento do rDNA 16S, a prova da coagulase em tubo foi refeita para estes isolados, confirmando a positividade em alguns deles. Nestes últimos isolados deverá ser pesquisada a atividade de coagulação, que pode também ser causada por interferência de proteases, conforme estudos realizados por Wegrzynowicz et al. (1979), Chomarat & Flandrois (1984) e Vandenesch et al. (1994).

Comparando os resultados do sequenciamento com os das reações de PCR, a reação de PCR para S. intermedius identificou corretamente a cepa-padrão S. intermedius ATCC 29663 e não identificou as outras cepas-padrão, entretanto produtos de amplificação de 901 pb foram obtidos de todos os isolados identificados como S. chromogenes pelo sequenciamento. A reação de PCR para S. hyicus amplificou a cepa-padrão S. hyicus ATCC 11249 e não amplificou as outras cepas-padrão. Produtos de amplificação de 250 pb foram obtidos com dois isolados identificados como S. hyicus pelo sequenciamento. Entretanto, falhou em identificar outros dois isolados identificados como S. hyicus pelo sequenciamento. Portanto neste estudo os oligonucleotídeos iniciadores descritos por Wakita et al. (2002) para S. intermedius não foram específicos, pois amplificaram também S. chomogenes; e os empregados para S. hyicus (Forsman et al. 1997) não foram sensíveis, pois falharam na identificação de dois isolados de S. hyicus.

O isolamento de S. chromogenes está de acordo com resultados encontrados por Birgersson et al. (1992), Aarestrup & Jensen (1997), Taponen et al. (2006, 2008), Gillespie et al. (2009) e Sampimon et al. (2009), que mostraram a disseminação deste agente em rebanhos bovinos. De acordo com Pyörälä & Taponen (2009) S. chromogenes e S. simulans são atualmente os estafilococos coagulase negativos mais frequentemente isolados de mastite bovina.

O isolamento de S. hyicus também foi descrito por Aarestrup & Jensen (1997), Capurro et al. (2002), Gianneechini et al. (2002), Taponen et al. (2006) e Sampimon et al. (2009), todos em rebanhos bovinos. Em estudos mais antigos (anos 80) S. hyicus era isolado com maior frequência, que pode ter sido em decorrência de uma identificação errônea por causa dos sistemas propostos na época (Bes et al. 2000), ou pelo fato de S. chomogenes ser caracterizado na época como S. hyicus (S. hyicus subsp. chromogenes) (Sampimon et al. 2009).

CONCLUSÕES

Foram identificadas as espécies Staphylococcus aureus, S. hyicus e S. chromogenes dos 100 isolados de Staphylococcus spp. analisados.

S. aureus foi identificado por PCR do gene femA e a identificação foi confirmada pelo sequenciamento do rDNA 16S.

As reações de PCR para identificar S. intermedius e S. hyicus, utilizando oligonucleotídeos descritos na literatura, não foram eficientes para identificar estas espécies.

Os isolados não identificados como S. aureus foram identificados como S. chromogenes e S. hyicus pelo sequenciamento do rDNA 16S.

A identificação definitiva das duas últimas espécies somente foi possível pelo sequenciamento do rDNA 16S.

Agradecimentos.- À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (CVZ 1816/06) e à Embrapa (MP 03.07.05.013.00/Agrofuturo) pelo apoio financeiro. José Renaldi Feitosa Brito e Robert Domingues foram bolsistas da Fapemig (Convênio 10132/07 e Pronex 4695/EDT 470/07). Alessandra Pereira Sant'Anna Salimena foi bolsista da Fapemig (CVZ 1816/06).

Recebido em 20 de abril de 2010

Aceito para publicação em 8 de setembro de 2010

Embrapa Gado de Leite, Rua Eugênio do Nascimento 610, Juiz de Fora, MG 36030-330, Brazil. E-mail: clange@cnpgl.embrapa.br

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