Achados patológicos e imuno-histoquímicos em bovinos com doença granulomatosa sistêmica pelo consumo de Vicia villosa (Leg. Papilionoideae) no Rio Grande do Sul

Pathological and immunohistochemical findings in cattle affected by systemic granulomatous disease by consumption Vicia villosa (Leg. Papilionoideae) in Rio Grande do Sul

ANIMAIS DE PRODUÇÃO

Luciana Sonne^I; Djeison L. Raymundo^I; Fabiana M. Boabaid^I; Tatiane T.N. Watanabe^I; Luiz G.S. Oliveira^I; Itabajara S. Vaz Jr^II; David Driemeier^I

^ISetor de Patologia Veterinária, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Av. Bento Gonçalves 9090, Porto Alegre, RS 91540-000, Brasil

^IIFaculdade de Veterinária, UFRGS, Av. Bento Gonçalves, 9500, Prédio 43421, Porto Alegre, RS 91501-970

RESUMO

A doença granulomatosa sistêmica associada ao consumo de Vicia villosa (Leg. Papilionoideae) foi diagnosticada em 5 bovinos no período de 2005 a 2008. Os bovinos apresentavam alopecia, lesões crostosas na pele, prurido, febre, queda da produção leiteira, anorexia e emagrecimento. O curso clínico médio da doença foi de 2 semanas. Dos bovinos analisados três morreram e dois foram eutanasiados. As lesões macroscópicas de alopecia e crostas na pele eram localizadas principalmente na face e pescoço. Observava-se nódulos multifocais a coalescentes branco-acinzentados que infiltravam vários órgãos especialmente em linfonodos, rins e coração. As lesões microscópicas consistiam na infiltração de linfócitos, macrófagos, células epitelioides, células gigantes multinucleadas, eosinófilos e plasmócitos. Linfonodos, rins, adrenal, baço e fígado de todos os bovinos apresentaram infiltrado granulomatoso, porém de intensidade variável. Nos testes imuno-histoquímicos dos órgãos com infiltrado inflamatório, as principais células visualizadas foram os linfócitos T, seguidos de macrófagos/células epitelioides/células gigantes multi-nucleadas e os linfócitos B foram raramente detectados nos locais de inflamação granulomatosa. O número reduzido de células marcadas por Ki-67 nas lesões granulomatosas, tende a indicar que a proliferação celular não foi responsável pela hipercelularidade das lesões e que o recrutamento de macrófagos e linfócitos para o local da inflamação provavelmente tenha sido o responsável pelo acúmulo de células no infiltrado inflamatório.

Termos de indexação: Plantas tóxicas, Vicia villosa, Leg. Papilionoideae, intoxicação por planta, doença granulomatosa sistêmica, bovinos, imuno-histoquímica.

ABSTRACT

The systemic granulomatous disease associated with consumption of Vicia villosa (Leg. Papilionoideae family) has been diagnosed in 5 cattle from 2005 to 2008. Affected cattle showed alopecia, crusted lesions on the skin, had itching, fever, decreased milk yield, anorexia and wasting. Average clinical course was 2 weeks. Three cattle died and two were euthanized in extremis. The main gross changes are alopecic and crusts in the skin, mainly on the face and neck. There also were multifocal to coalescent whitish nodules that infiltrated several organs, but especially lymph nodes, kidneys and hearth. Microscopic changes consisted of infiltration with lymphocytes, macrophages, epithelioid cells, giant multinucleated cells, eosinophils, and plasmocytes. Lymph nodes, kidneys, adrenal gland, spleen and liver from affected cattle showed varying degrees of granulomatous infiltration. Immunohistochemical procedures on samples from affected organs revealed that T-lymphocytes and macrophages/epithelioid cells/giant multinucleated cells were the main components of the inflammatory infiltrates, B-lymphocytes were only rarely seen within. The reduced numbers of cells marked by Ki-67 in the granulomatous lesions would indicate that cell proliferation was not responsible for the hypercellularity in the lesions and that rather the recruitment of macrophages and lymphocytes to the site inflammation probably accounted for the building up of the local cellular inflammatory infiltrate.

Index terms: Poisonous plants, Vicia villosa, Leguminosae Papilionoideae, plant poisoning, systemic granulomatous disease, cattle, immunohistochemistry.

INTRODUÇÃO

Vicia spp. são plantas leguminosas, trepadeiras anuais ou perenes que são amplamente utilizadas como forragem para bovinos devido ao seu alto valor nutricional (Odriozola et al. 1991). O consumo de Vicia villosa Roth (ervilhaca-peluda) pode ocasionar uma doença granulomatosa sistêmica descrita em bovinos e equinos (Panciera et al. 1966, Anderson & Divers 1983, Panciera et al. 1992, Woods et al. 1992). Em bovinos, a intoxicação tem sido associada a três manifestações clínicas. A primeira é associada ao consumo de sementes causando distúrbios nervosos agudos e a morte dos animais (Claughton & Claughton 1954). A segunda síndrome está associada ao consumo da pastagem ocasionando pápulas na cabeça, pescoço e corpo, erupções herpetiformes na mucosa oral, descarga nasal purulenta, tosse, avermelhamento das mucosas nasais, queda de pelo, anorexia e respiração ofegante (Panciera et al. 1992). A terceira síndrome é a mais estudada e caracteriza-se por uma doença granulomatosa sistêmica. Clinicamente, esta síndrome é caracterizada por dermatite, prurido, febre, conjuntivite, diarreia, queda da produção de leite e perda de peso (Peet & Gardner 1986, Barros et al. 2001, Fighera & Barros 2004). A doença tem sido descrita em bovinos da raça Holandês (Rech et al. 2004), Aberdeen Angus (Peet & Gardner, 1986, Odriozola et al. 1991, Johnson et al. 1992), Murray Grey, cruzamento de Hereford com Bradford (Harper et al. 1993) e um único caso em uma novilha Limousin (Johnson et al. 1992).

Os bovinos acometidos pela doença granulomatosa sistêmica apresentam lesões de pele caracterizadas por áreas coalescentes de alopecia, formação de pápulas, exsudato amarelado que pode resultar na formação de crostas (Fighera et al. 2005). As lesões de pele estão presentes principalmente na cabeça, pescoço, tronco, períneo e úbere (Fighera et al. 2005). Nódulos branco-acinzentados, moderadamente firmes, multifocais a coalescentes infiltram múltiplos órgãos como linfonodos, fígado, rins e miocárdio. Infiltrado inflamatório constituído de linfócitos, plasmócitos, histiócitos, eosinófilos, macrófagos epitelioides e ocasionalmente células gigantes multinucleadas são observados na histologia (Barros et al. 2001). O infiltrado é mais prevalente na região do córtex renal, miocárdio, cortical e medular da adrenal, e derme. Órgãos menos frequentemente afetados incluem a tireoide, a parótida, o pâncreas, o baço, os linfonodos e as áreas portais do fígado. Ocasionalmente os infiltrados podem ser observados na traqueia, no pulmão, na vesícula biliar, no intestino, no ovário e no endométrio (Panciera et al. 1992). O tipo de reação inflamatória sugere uma reação de hipersensibilidade tipo IV (Panciera et al. 1992). Este trabalho descreve os achados patológicos observados em bovinos afetados pela doença granulomatosa sistêmica associada com o consumo de Vicia villosa no Rio Grande do Sul.

MATERIAL E MÉTODOS

Para o presente estudo, bovinos com os sinais clínicos da doença foram necropsiados pelo Setor de Patologia Veterinária (SPV) da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Dados como raça, idade, sexo, sinais clínicos e lesões macroscópicas observados durante a necropsia foram registrados. Um dos bovinos (Bovino 2) foi necropsiado pelo veterinário responsável pelo caso e o material foi encaminhado para histopatologia. Fragmentos de órgãos foram coletados em solução de formalina 10%, processados por técnicas rotineiras de histologia e corados pela hematoxilina e eosina (HE) e Ziehl-Neelsen. Para o teste imuno-histoquímico os cortes de tecidos foram preparados em lâminas com solução de Poli-L-lisina⁴ 10% e fixados em estufa a 60ºC por 24 horas. Utilizou-se o método estreptavidina ligada à peroxidase para os anticorpos anti-CD68 (macrófago), anti-Ki-67 (marcador de proliferação celular) e anti-CD79α (linfócitos B). Inicialmente, a peroxidase endógena foi inibida com peróxido de hidrogênio 3% por 15 minutos. Para a recuperação antigênica utilizou-se proteinase K⁵ por 10 minutos (CD68), calor em panela de pressão a 125ºC por 7 minutos em tampão citrato pH 6,0 (Ki-67) e calor em microondas por 2 vezes de 5 minutos em tampão citrato pH 6,0 (CD79α). Os anti-corpos monoclonais anti-CD68⁶, anti-Ki-67⁷ e anti-CD79α⁸ foram diluídos em 1:100, 1:300 e 1:10 respectivamente. As lâminas foram incubadas em câmara úmida overnight a 4ºC e com revelação com DAB⁵. Realizou-se a imuno-histoquímica através da técnica de estreptavidina-biotina ligada à fosfatase alcalina para o marcador de linfócitos T (CD3). Para a recuperação antigênica, neste caso, utilizou-se Protease XIV⁴ por 15 minutos, diluição de 1:200 do anticorpo policlonal anti-CD3⁹ com incubação overnight a 4ºC e como cromógeno utilizou-se o Permament Red⁵ por 15 minutos.

RESULTADOS

Dados gerais

No período de 2005-2008 foram realizadas, no SPV-UFRGS, 278 necropsias de bovinos, 38 das quais foram associadas a intoxicações por plantas. Realizou-se, nesse período, o diagnóstico de 5 surtos de intoxicação por Vicia villosa. Os dados dos bovinos e das propriedades estão descritos no Quadro 1.

Na propriedade do Bovino 1, havia um total de 90 bovinos em lactação. Os animais estavam consumindo ração comercial, silagem de milho e pastagem cultivada com aveia, azevém e V. villosa. Este havia sido o primeiro ano no qual a ervilhaca era introduzida na alimentação dos bovinos. Após 30 dias da ingestão da planta os bovinos começaram a apresentar queda da produção leiteira, febre, anorexia, prurido intenso e lesões de pele localizadas principalmente na cabeça, pescoço, úbere, abdômen e membros posteriores. Os bovinos foram tratados para dermatomicose sem apresentarem melhora no quadro clínico. No decorrer de duas semanas após o início dos sinais clínicos 4 bovinos morreram e em um foi realizada a eutanásia para a realização da necropsia.

Na propriedade do Bovino 2 havia um total de 35 bovinos; desses, três apresentaram sinais clínicos como diminuição da produção leiteira, febre, anorexia e morte. Os três bovinos morreram, sendo que em um foi realizada a necropsia. Os bovinos dessa propriedade eram mantidos em pastagem contendo V. villosa.

Bovino 3 apresentou emagrecimento, diminuição da produção leiteira, diarreia e áreas avermelhadas e alopécicas na pele da face e do úbere com curso clínico de 26 dias. Na mesma propriedade outros dois bovinos haviam apresentado sinais clínicos semelhantes, sendo ambos filhos do Bovino 3. Os bovinos da propriedade eram mantidos em pastagem com aveia, azevém e V. villosa.

Bovino 4 era proveniente de uma propriedade com 13 bovinos e foi o único a apresentar sinais clínicos de anorexia, emagrecimento, alopecia e crostas na pele da face e úbere. Os sinais clínicos iniciaram-se 2 meses após o consumo da pastagem contendo V. sativa e V. Villosa; o curso clínico foi de 15 dias e após esse período realizou-se a eutanásia do bovino.

Bovino 5 era proveniente de uma propriedade com um total de 14 bovinos que consumiam pastagem contendo aveia, azevém e V. villosa por aproximadamente 4 meses. Bovino 5 apresentou anorexia, emagrecimento, queda da produção leiteira e lesões alopécicas e crostosas na face, orelhas e pescoço. O curso clínico da doença foi de 10-12 dias e resultou na morte do bovino.

Achados macroscópicos

Os achados macroscópicos dos bovinos desse estudo foram principalmente caracterizados por lesões de pele (Bovinos 1, 3, 4 e 5). As lesões observadas foram alopecia e crostas localizadas principalmente na face, no pescoço (Fig.1), nas orelhas e no úbere. Nódulos esbranquiçados multifocais ou coalescentes infiltravam diferentes órgãos. Os rins encontravam-se aumentados de volume e com numerosos nódulos de 0,1-0,2cm (Bovinos 1, 2, 3 e 5). Áreas esbranquiçadas no miocárdio e hidropericárdio foram observados no Bovino 3, enquanto que numerosos nódulos de 0,2-0,8cm foram visualizados no epicárdio e miocárdio do Bovino 1. No Bovino 5, observou-se esplenomegalia com hiperplasia da polpa branca. No fígado, visualizaram-se áreas esbranquiçadas no parênquima hepático do Bovino 3, e hepatomegalia e acentuação do padrão lobular foram evidenciados no Bovino 1. Aumento de volume e múltiplos nódulos esbranquiçados evidenciados ao corte e que variavam de 0,2 0,8cm (Bovinos 1, 2, 4 e 5) foram observados (Fig.2). Os principais linfonodos afetados foram os mamários, mesentéricos, mediastínicos, hepáticos e ilíaco interno. Os linfonodos hepáticos se apresentavam hemorrágicos e a vesícula biliar apresentava-se com petéquias no Bovino 2. Evidenciação das placas de Peyer foi observado no Bovino 1. No Bovino 4, a principal alteração macroscópica observada foi o aumento acentuado das adrenais principalmente da adrenal direita. No Bovino 5 observaram-se hemorragias no tecido subcutâneo, rins, bexiga, coração e intestino.

Achados microscópicos

Os achados histológicos observados foram infiltrado inflamatório constituído de linfócitos, histiócitos, células epitelioides, células gigantes multinucleadas, plasmócitos de glândulas sudoríparas, que foram visualizados nos em todos os bovinos no qual a pele foi coletada (Bovino 1, 3, 4 e 5). Em um dos bovinos (Bovino 1) visualizou-se foliculite multifocal moderada. Os órgãos que apresentavam infiltrado granulomatoso, foram principalmente adrenal, baço, fígado, linfonodos e rins.

Resultados imuno-histoquímicos

Nos órgãos que apresentavam infiltrado granulomatoso, realizaram-se testes imuno-histoquímicos através de cortes seriados com marcadores de linfócitos T (CD3), linfócitos B (CD79á) e macrófagos (CD68). O maior número de células marcadas positivamente foi de macrófagos (Fig.4) e linfócitos T (Fig.5), sendo o último a principal célula presente no infiltrado. Na pele a marcação positiva ocorreu na derme superficial principalmente ao redor de vasos. Em órgãos como linfonodos e baço, no qual há normalmente um acentuado número de linfócitos, esses foram melhor evidenciados principalmente com o marcador de linfócitos T, representando um acentuado aumento dessas células nesses órgãos. Macrófagos, células epitelioides e células gigantes multinucleadas foram marcados intensamente com o anticorpo anti-CD68. Inúmeros macrófagos foram observados principalmente nos cortes de baço dos Bovinos 1 e 3. Os linfócitos B e plasmócitos foram identificados pelo anticorpo anti-CD79α, porém com um menor número de células marcadas positivamente no cortes avaliados. Quando se utilizou o anticorpo anti-Ki-67 (Fig. 6) obteve-se um pequeno número de marcação positiva nuclear em células do infiltrado inflamatório.

DISCUSSÃO E CONCLUSÕES

A intoxicação natural por Vicia villosa foi diagnosticada em cinco bovinos de diferentes propriedades no período de 2005 a 2008. Os aspectos epidemiológicos, clínicos e patológicos encontrados foram semelhantes aos previamente descritos (Panciera et al. 1966, Barros et al. 2001). As taxas de morbidade nas propriedades variaram de 5,5% a 20% e a letalidade foi de 33% (Rodeio Bonito, Bov.3) e 100% nas demais propriedades. Fighera & Barros (2004) relataram surtos da doença granulomatosa sistêmica com morbidade variando entre 2,8% a 33,3% e letalidade de 100% em 8 pequenas propriedades do Rio Grande do Sul.

Os bovinos intoxicados naturalmente apresentavam lesões bastante características como alopecia e formação de crostas na pele, principalmente na cabeça, pescoço e mama, como também foram descritas por outros autores (Panciera et al. 1966, Fighera et al. 2005). Múltiplos órgãos foram afetados, e a principal alteração macroscópica encontrada foram nódulos esbranquiçados nos órgãos como rins, linfonodos e coração. O aumento de volume da adrenal foi um achado importante; na histologia dessa glândula observou-se infiltrado granulomatoso em todos os bovinos examinados e essa foi a principal alteração macroscópica no Bovino 4.

As alterações de pele foram analisadas em quatro bovinos, em um deles (Bovino 2) o órgão não foi enviado para a análise histológica. Alterações como crostas na epiderme, dilatação de glândulas sudoríparas e infiltrado inflamatório de linfócitos, histiócitos, células epitelioides, eosinófilos e com raras células gigantes multinucleadas foram encontrado nos quatro bovinos analisados. As lesões se caracterizavam por dermatite perivascular superficial. Linfonodos, rins, baço e fígado foram órgãos que apresentaram na histologia infiltrado inflamatório granulo-matoso nos cinco bovinos estudados.

Os testes imuno-histoquímicos dos bovinos estudados demonstraram que o infiltrado inflamatório era constituído principalmente por macrófagos, células epitelioides, células gigantes multinucleadas e linfócitos. Quando comparados os mesmos cortes, a imunofenotipagem linfocitária revelou que, em todos os locais avaliados, os linfócitos T predominavam, enquanto os do tipo B raramente eram encontrados. Esses achados reforçam o envolvimento da reação de hipersensibilidade tardia na patogênese da doença. O número reduzido de células marcadas por Ki-67 indica que a proliferação celular não foi o principal responsável pela hipercelularidade observada nas lesões granulomatosas por consumo de V. villosa, e que o recrutamento de macrófagos e linfócitos para o local da inflamação deve ter sido o responsável pelo acúmulo inflamatório (Valheim et al. 2004).

Agradecimentos.- Ao CNPq pelo apoio financeiro e ao professor Claudio Estevão Farias da Cruz pela ajuda na revisão deste artigo.

Recebido em 19 de julho de 2010.

Aceito em 17 de novembro de 2010.

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Achados patológicos e imuno-histoquímicos em bovinos com doença granulomatosa sistêmica pelo consumo de Vicia villosa (Leg. Papilionoideae) no Rio Grande do Sul

Pathological and immunohistochemical findings in cattle affected by systemic granulomatous disease by consumption Vicia villosa (Leg. Papilionoideae) in Rio Grande do Sul

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  25 Abr 2011
• Data do Fascículo
  Abr 2011

Histórico

• Recebido
  19 Jul 2010
• Aceito
  17 Nov 2010