Caracterização das proteínas de superfície de membrana externa da sorovariedade Hardjo isolada de bovinos em Minas Gerais

Characterization of outer membrane proteins of serovar Hardjo isolated from cattle in Minas Gerais, Brazil

ANIMAIS DE PRODUÇÃO

Caracterização das proteínas de superfície de membrana externa da sorovariedade Hardjo isolada de bovinos em Minas Gerais

Characterization of outer membrane proteins of serovar Hardjo isolated from cattle in Minas Gerais, Brazil

Rogério O. Rodrigues^{I, II,*}, José A. Silva^I; Telma M. Alves^I; Elaine M.S. Dorneles^I; Sílvia Minharro^{I, III}; Andrey P. Lage^I; Rômulo C. Leite^I; Élvio C. Moreira^I

^IDepartamento de Medicina Veterinária Preventiva, Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), Av. Antônio Carlos 6627, Cx. Postal 567, Belo Horizonte, MG 30123-970, Brasil

^IIUniversidade Vale do Rio Doce (Univale), Campus Antônio Rodrigues Coelho, Rua Israel Pinheiro 2000, Bairro Universitário, Cx. Postal 295, Governador Valadares, MG 35020-220, Brasil

^IIIFaculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal do Tocantins, Rua Paraguai s/n (esquina com Urixamas), Setor Cimba, Araguaína, TO 77838-824, Brasil

RESUMO

Foram identificadas diferenças no perfil protéico das amostras de Sponselee, Norma e Hardjoprajitno, com bandas protéicas entre 175, 47 kDA e 12,10 kDa. A amostra Sponselee foi a que apresentou maior número de bandas (12), seguida da Norma que apresentou 11 bandas e de Hardjoprajitno que apresentou 9 bandas. Todas as bandas observadas na amostra Sponselee possuíam correspondentes nas outras duas amostras. A amostra Norma não apresentou uma banda em torno de 35,77 kDa e a Hardjoprajitno não apresentou bandas em torno de 89,59 kDa, 35,77 kDa e 12,10 kDa. O reconhecimento dessas proteínas por soros hiperimunes contra cada uma das amostras também mostrou diferenças, sendo que o maior número de proteínas reconhecido em todas as amostras por todos os soros se encontrou entre 35,83 kDa e 29,19 kDa. Os soros contra bovino na amostra Norma só reconheceu proteínas de baixa massa molecular nas amostras Norma (6,80 kDa) e Hardjoprajitno (6,80 kDa e 5,30 kDa). Soro bovino contra a amostra Hardjoprajitno reconheceu uma proteína de 44,33 kDa todas às amostras e proteínas de 4,22 kDa nas amostras Sponselee e Norma e de 10,49 kDa e 6,16 kDa na Hardjoprajitno. As diferentes proteínas identificadas poderiam se constituir em alvos específicos para o desenvolvimento de testes diagnósticos e vacinas contra leptospirose bovina.

Termos de indexação: Leptospira sorovar Hardjo, Minas Gerais, perfil protéico, bovino.

ABSTRACT

Differences in the protein profile of Leptospira sp. strains Sponselee, Norma and Hardjoprajitno were observed, with bands ranging from 175.47 kDa to 12.10 kDa. Strain Sponselee presented a 12-band profile, while strain Norma showed 11 and strain Hardjoprajitno showed 9 bands in the profile. All bands observed in Sponselee strain profile could match bands in the other two strains. Strain Norma lacks a band at 35.77 kDa and strain Hardjoprajitno lacks the bands at 89.59 kDa, 35.77 kDa and 12.10 kDa. The recognition profile from hyperimmune sera was also different for the studied serovar Hadjo strains. The majority of recognized proteins was in the range of 35.83 kDa to 29.19 kDa. Cattle sera against strain Norma only recognized low molecular mass proteins in strains Norma (6.80 kDa) and Hardjoprajitno (6.80 kDa and 5.30 kDa). Bovine sera against strain Hardjoprajitno recognized a 44.33 kDa protein in all studied strains and proteins of 4.22 kDa in strains Sponselee and Norma and of 10.49 kDa and 6.16 kDa in strain Hadjoprajitno. The different identified proteins could become specific targets to the development of diagnostic tests and vaccines against bovine leptospirosis.

Index terms:Leptospira serovar Hardjo, Minas Gerais State, Brazil, protein profile, cattle.

INTRODUÇÃO

Leptospirose é uma doença aguda, febril e septicêmica causada por espécies de espiroquetas de leptospiras. Leptospiras patogênicas tem um amplo espectro de hospedeiros e são ubiquitárias, entretanto não são distinguíveis nas bases morfológicas, bioquímicas e em métodos usuais de cultivo, estes organismos tem propriedades antigênicas distintas como demonstrado pela aglutinação e testes de absorção-aglutinação.

Ellis (1984) analisou especificamente a prevalência, patogênese e controle da leptospirose bovina em países tropicais. Desta forma, o autor dividiu a ocorrência de diferentes sorovariedades de Leptospira em dois grandes grupos: o de amostras adaptadas e mantidas pelo gado bovino, como Hardjo que dependem de região e do índice pluviométrico; e as infecções acidentais, determinadas por amostras mantidas por outras espécies domésticas ou silvestres. Nos bovinos, do Brasil, as pesquisas indicam que a sorovariedade Hardjo é mais freqüentemente detectada e a que causa maior impacto econômico na eficiência reprodutiva de rebanhos de bovinos de diversas partes do mundo (Moreira 1994).

Diversas sorovariedades de Leptospira sp. foram isoladas de bovinos no Brasil, entretanto, a sorovariedade Hardjo tem sido encontrada sorologicamente com maior freqüência e causando maior impacto na eficiência reprodutiva de rebanhos bovinos (Vasconcellos et al. 1997).

Vários estudos tem sido conduzidos no Brasil, Leite (2000) encontrou a sorovariedade Hardjo como a mais prevalente e amplamente disseminada em bovinos no Estado da Paraíba, e uma baixa prevalência de muitas outras sorovariedades como Canicola, Grippothyphosa, Hebdomadis, Pyrogenes, Tarassovi e Wolffi, já detectadas em baixas frequências em outros estudos em bovinos no Brasil (Guida et al.1959, Santa Rosa et al. 1961, Moreira et al. 1979, Giorgi et al. 1981) estes resultados confirmam os bovinos como reservatórios usuais da sorovariedade Hardjo e que sua alta prevalência pode interferir com a produção bovina (Prescott et al. 1993, Faine et al. 1999, Leite et al. 2000).

Grandes diferenças nos resultados entre as duas amostras da sorovariedade Hardjo utilizadas no laboratório de zoonoses da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais têm sido observadas e a amostra Norma é a que tem detectado o maior número de animais (Moreira 2010). Estas diferenças entre as estirpes Norma e Hardjoprajitno da sorovariedade Hardjo, já haviam sido observadas antes, com maior ou menor intensidade, em outras populações de bovinos e ovinos em outros estados do Brasil (Moreira 1994, Hermann 2004).

A amostra Norma foi isolada no Estado de Minas Gerais, Brasil da urina de um bovino (Moreira 1994) e foi identificada como L. interrogans sorovariedade Hardjo, tipo Hardjoprajitno (Korver, comunicação pessoal) que utilizou anticorpos monoclonais (Terpstra et al.,1985). Estas diferenças encontradas são provavelmente devido ao baixo número de passagens e origem da amostra Norma, tendo sido isolada em 1991, a amostra Norma tem um menor número de passagens "in-vitro" que a amostra Hardjoprajitno que foi isolada em 1938 (Wolf,1969). Assim sendo, como a amostra Norma foi isolada no Brasil, ela provavelmente apresenta maior similaridade antigênica com L. interrogans sorovariedade Hardjo, que infecta bovinos no Brasil, do que a estirpe Hardjoprajitno isolada de um homem em Sumatra (Wolf 1969). Fontanals et al. (2001) estudando diferentes isolados de L. interrogans sorovariedade Pomona de bovinos encontraram resultados similares, sugerindo que um isolado local da sorovariedade Hardjo pode ser mais sensível na detecção de animais da localidade que estiverem infectados.

As leptospiroses são usualmente controladas por vacinação, recentes estudos têm demonstrado a falta de uma proteção completa com a sorovariedade Hardjo e entre sorovariedades da espécie L. borgpetersenii, devido às vacinas usualmente consistirem de células inteiras quimicamente inativadas, virtualmente pouco se conhece sobre os componentes imunogênicos responsáveis por provocar a resposta imune protetora (Nunes-Edwards 1985).

A natureza das bases moleculares da patogenicidade de leptospiras é pouco elucidada, entretanto anticorpos que se aderem aos LPS da membrana conferem considerável grau de proteção que possuem atividade endotóxica comuns em bactérias Gram-negativas, além de algumas sorovariedades produzirem uma hemolisina com atividade de esfingomielisina sendo outros fatores de virulência ainda não descritos (Haake et al. 1991).

A membrana externa de Leptospiras spp. é uma estrutura label e facilmente danificada por traumas mecânicos ou tratamentos químicos. As técnicas usadas para identificar proteínas da membrana externa em bactérias Gram-negativas não têm sido adequadamente utilizadas devido à fragilidade estrutural das espiroquetas, tal como Treponema pallidum (Cunningham et al. 1988). Diferenças ultra-estruturais e antigênicas na identidade das moléculas de superfície de amostras virulentas e cultivos isogênicos de culturas atenuadas de L. interrogans da sorovariedade Grippotyphosa têm sido demonstradas (Haake et al. 1991).

Existem 239 sorovariedades entre as leptospiras patogênicas, as variações na composição do carboidrato do LPS refletem a diversidade antigênica das leptospiras. Tem sido demonstrado que o LPS é um imunógeno protetor que é geralmente sorovariedade específico (Faine et al. 1999). Ao contrário dos LPS, extratos protéicos preparados de uma leptospira patogênica podem induzir imunidade protetora contra o desafio com a sorovariedade heteróloga em um modelo animal experimental (Sonrier et al. 2000). Estes resultados sugerem que as proteínas de leptospiras podem ser candidatas para uma nova vacina que induza efetiva proteção contra diversas sorovariedades.

Diversas proteínas imunogênicas têm sido testadas como imunógenos anti-leptospiras (Shang et al. 1996, Haake et al. 1998, 2000, Guerreiro et al. 2001, Matsunaga et al. 2002, Palaniappan et al. 2002) e muitas proteínas de leptospiras, tal como OmpL1, LipL41 e Hap1 (também conhecida como LipL32), são encontradas como imunógenos protetores conservados entre as leptospiras patogênicas (Haake et.al. 1999, Branger et.al. 2001), a OmpL1 e a LipL41 induziram imuno-proteção sinérgica em hamster (Haake et.al. 1999). A vacinação mediada por Adenovírus de Hap1 induziu proteção contra o desafio heterólogo em gerbils (Branger et.al. 2001), as proteínas (LigA-m e LigB-m) homólogas e imunogênicas de L. interrogans sorovariedade Manilae são candidatos a vacinógenos para a prevenção da leptospirose (Koizumi & Watanabe 2004).

A identificação de antígenos protéicos comuns espécie específicos possui considerável valor no entendimento dos mecanismos patogênicos, pois melhoram testes rápidos de diagnósticos diretos, bem como, os testes sorológicos e também poderão contribuir para a vacinação pelo aumento de proteção cruzada entre sorovariedades específicas de LPS. Por estas razões um grande número de estudos tem investigado proteínas de membrana de superfície em leptospiras patogênicas (Adler et al. 1980, Nunes-Edwards et. al. 1985, LeFebvre et al. 1987, Haake et al. 1991, 2000, 2004, Pope & Johnson 1991, Nicholson & Prescott. 1993, De La Peña-Moctezuma et al. 1999, Nally et al. 2001, Cullen et al. 2002, 2003, Haake & Matsunaga 2002, Palaniappan et al. 2002, Matsunaga et al. 2003).

MATERIAL E MÉTODOS

Amostras e condições de cultivo

As amostras utilizadas foram Leptospira interrogans sorogrupo Sejroe sorovariedade Hardjo, tipo Hardjoprajitno, estirpe Hardjoprajitno isolada de um humano na Indonésia e L. borgpetersenii sorogrupo Sejroe sorovariedade Hardjo, tipo Hardjobovis, estirpe Sponselee isolada de um bovino na Holanda são provenientes do Royal Tropical Institute de Amsterdã, Holanda, em 1979 e do Instituto Panamericano de Protección de Alimentos y Zoonosis da Organización Panamericana de la salud e Organización Mundial de la Salud, Buenos Aires, Argentina em 1998 respectivamente. L. interrogans, sorogrupo Sejroe, sorovariedade Hardjo, tipo Hardjoprajitno, estirpe Norma foi isolada de um rebanho leiteiro no município de Pitangui, Minas Gerais (Moreira 1994). Todas as amostras foram mantidas na Escola de Veterinária da UFMG, no laboratório de Zoonoses da Escola de Veterinária da UFMG e são mantidas em meio Fletcher semi-sólido (Fletcher 1928) com repiques trimestrais.

Soros

Soro hiperimune de coelhos. Foram utilizados quatro coelhos brancos adultos da raça Nova Zelândia onde foram inoculados cultivos de L.interrogans, sorogrupo Sejroe, sorovariedade Hardjo, tipo Hardjoprajitno, estirpe Hardjoprajitno, L.borgpetersenii sorogrupo Sejroe, sorovariedade Hardjo, tipo Hardjobovis, estirpe Sponselee e L.interrogans, sorogrupo Sejroe, sorovar Hardjo, tipo Hardjoprajitno, estirpe Norma cultivados com 14 dias (2x10⁸ leptospiras/mL) injetados pela via intraperitoneal com um volume de 3mL no dia zero, 6mL no dia 7,9mL no dia 14 e 12mL no dia 21 (Nicholson & Prescott 1993). Sete dias após a última aplicação foi coletado soro e determinado o título usando amostra viva e homologa através do Teste de Soroaglutinção Microscópica (Cole et al. 1973).

Soro de bovinos. Foram utilizados soros de bovinos naturalmente infectados, da coleção do Laboratório de Zoonoses do DMVP, EV-UFMG, que reagiram especificamente com as amostras L.interrogans, sorogrupo Sejroe, sorovariedade Hardjo, tipo Hardjoprajitno, estirpe Hardjoprajitno, L.borgpetersenii sorogrupo Sejroe, sorovariedade Hardjo, tipo Hardjobovis, estirpe Sponselee e L.interrogans, sorogrupo Sejroe, sorovar Hardjo, tipo Hardjoprajitno, estirpe Norma no Teste de Soroaglutinção Microscópica.

Frações ricas em proteínas de membrana externa de Leptospira sp.

Os antígenos utilizados foram preparados a partir de todas as amostras cultivadas em EMJH (Ellinghausen & McCulloug 1965) a 28ºC por 14 dias segundo Barenkamp et al. (1981) e Nicholson & Prescott (1993).

Dosagem de proteína

As dosagens protéicas foram realizadas segundo o método de Lowry et al. (1951), tendo como padrão a soroalbumina bovina.

Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e 'immunoblotting'

Para a eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) foi empregada à técnica descrita por Laemmli (1970). O 'immunoblotting' foi realizado segundo Bjerrum & Heegaard (1988) e Coligan et al. (1996), com as frações ricas em proteínas de membrana externa de Leptospira sp.

Análise do perfil protéico das amostras de Leptospira sp.

A análise e comparação do perfil protéico das amostras de Leptospira sp. isoladas de bovinos em Minas Gerais e de referência foi realizada empregando o "software" BioNumerics 5.1 (Applied Maths, Bélgica).

RESULTADOS

Os resultados da análise do perfil protéico das amostras de Leptospira sp testadas são apresentados na Figura 1. Foram identificadas em géis de poliacrilamida várias bandas comuns às três amostras estudadas com massa molecular variando entre 175, 47 kDA e 12,10 kDa. A amostra Sponselee foi a que apresentou maior número de bandas (12), seguida da amostra Norma que apresentou 11 bandas e da amostra Hardjoprajitno que apresentou 9 bandas. Todas as bandas observadas na amostra Sponselee possuíam correspondentes nas outras duas amostras. A amostra Norma não apresentou uma banda em torno de 35,77 kDa e a amostra Hardjo não apresentou bandas em torno de 89,59, 35,77 e 12,10 kDa.

Os soros hiperimunes produzidos em coelhos contra as amostras de Leptospira sp Sponselee, Norma e Hardjoprajitno, quando utilizados no western blotting, identificaram padrões de bandas diferentes entre as três amostras estudadas (Fig.2). Frente ao mesmo soro hiperimune, todas as amostras apresentaram padrão de bandas reconhecidas semelhante. Todos os soros foram capazes de identificar proteínas com massa molecular entre de 35,83 kDa e 29,19 kDa, sendo que o soro hiperimune contra a amostra Sponselee só detectou uma classe de bandas de 32,50 kDa. Nesta faixa de massa molecular, duas classes de bandas foram identificadas pelo soro hiperimune contra as amostras Norma, 35,83 kDa e 31,49 kDa, e Hardjoprajitno, 31,26 kDa e 29,19 kDa. Bandas de alto peso molecular também foram identificadas pelos soros contra as amostras de Leptospira sp. Norma (102,83 kDa) e Hardjoprajitno (78,28 kDa).

Na coleção de soros de bovinos reagentes a antígenos de Leptospira sp do Laboratório de Zoonoses da Escola de Veterinária da UFMG só foram encontrados soros reagindo especificamente contra as amostra Norma e Hardjoprajitno. Nenhum soro com reação específica somente contra a amostra de Leptospira borgpeterseni tipo Hadjobovis estirpe Sponselee foi encontrado.

Os western blotting realizados com os soros de bovinos específicos contra as amostras Norma e Hardjoprajitno são apresentados na Figura 3. O soro bovinos contra a amostra Norma só reconheceu proteínas de baixo peso molecular nas amostras Norma e Hardjoprajitno. Esse reconhecimento foi diferenciado, pois uma banda de 6, 80 kDa foi reconhecida nas duas amostras, mas na amostra Hardjoprajitno uma banda extra de 5,30 kDa também foi reconhecida. Nenhuma proteína foi reconhecida por esse soro na amostra Sponselee. Já o soro de bovino contra a amostra Hardjoprajitno reconheceu proteínas de médio e baixo peso molecular. Uma proteína de 44,33 kDa foi reconhecida em todas as amostras por esse soro. Proteínas de 10,49 kDa e 6,16 kDa foram reconhecidas por esse soro na amostra Hardjoprajitno e uma proteína de 4,22 kDa foi reconhecida nas amostras Norma e Sponselee.

DISCUSSÃO

Diferenças no diagnóstico sorológico de leptospirose pelo teste de soroaglutinação microscópica em função da amostra utilizada no teste já foram descritas (Fontanals et al. 2001, Herrmann et al. 2004, Lage et al. 2007). No Rio Grande do Sul e na Paraíba, Herrmann et al. (2004) e Lage et al. (2007) descreveram maior número de soros de ovinos e bovinos, respectivamente, que eram positivos à sorovariedade Hardjo de Leptospira interrogans no teste de soroaglutinação microscópica quando se utilizava a amostra Norma que quando se utilizava a amostra de referência Hardjoprajitno. A amostra Norma foi isolada em Minas Gerais em 1991 (Moreira 1994) e, portanto provavelmente representa melhor as amostras que circulam no Estado. Os resultados encontrados no presente trabalho podem ajudar a compreender os resultados sorológicos de ovinos e bovinos observados em Minas Gerais, pois neste estudo foram identificadas diferenças no perfil protéico das amostras de Leptospira sp Sponselee, Norma e Hardjoprajitno e no seu reconhecimento por soro hiperimunes contra estas amostras ou por soro de bovinos naturalmente infectados.

A amostra Norma, que foi identificada como L. interrogans sorovariedade Hardjo (Moreira 1994), portanto da mesma espécie e sorovariedade da amostra de referência da Organização Mundial da Saúde Hardjoprajitno, apresentou maiores similaridades à amostra Sponselee, que mesmo sendo da sorovariedade Hardjo pertence à espécie L. borgpetersenii. Esta diferença da amostra Norma em relação à amostra Hardjoprajitno pode ser explicada pelo maior número de passagens desta amostra, que foi isolada em Sumatra em 1938 (Wolff 1969). Por apresentar grandes semelhanças com as duas amostras de referência, Hardjoprajitno e Sponselee, a amostra Norma se apresenta como uma melhor alternativa a ser utilizada no diagnóstico sorológico da leptospirose em bovinos no Estado de Minas Gerais.

O reconhecimento de proteínas de Leptospira sp. por soros hiperimunes produzidos em coelhos contra as amostras Sponselee, Norma e Hardjoprajitno também mostraram diferenças, sendo que o maior número de proteínas reconhecido em todas as amostras por todos os soros se encontrou entre 35,83 kDa e 29,19 kDa. Apesar de todos os soros hiperimunes terem apresentado títulos altos (dados não apresentados), o soro anti-Sponselee só reconheceu uma proteína (32,50 kDa) em todas as três amostras, o que pode indicar que mesmo apresentado perfis protéicos semelhantes, as proteínas ou a imunogenicidade das proteínas pode ser diferente entre as amostras. Lafetá et al. (2008), trabalhando com géis bidimensionais e L. interrogans sorovariedade Hardjo, mostraram que várias proteínas de mesma massa molecular podem estar presentes membrana externa de L. interrogans e que estas proteínas não podem ser resolvidas em géis monodimensionais como os utilizados no presente estudo. As duas classes de proteínas reconhecidas pelos soros anti- Hardjoprajitno e anti-Norma, na faixa de 35,83 kDa a 29,19 kDa, parecem se equivaler, mas ambos os soros reconhecem proteínas de alta massa molecular diferentes em todas as amostras estudadas (78,28 kDa e 102,83 kDa, respectivamente). Estas proteínas de alta massa molecular indicam ser muito imunogênicas, pois apesar de não terem sido observadas nos géis de poliacrilamida, foram detectadas pelos anticorpos induzidos pela inoculação dessas amostras em coelhos. Em função destes achados, essas proteínas de alta massa molecular devem ser investigadas por outras técnicas imunológicas para se avaliar seu real valor para o diagnóstico e produção de vacinas contra a leptospirose bovina.

Soros de bovinos naturalmente infectados e reconhecendo especificamente a amostra Norma ou a amostra Hardjoprajitno apresentaram padrões de reconhecimento diferente frente às três amostras estudadas. Soro bovino contra a amostra Norma só reconheceu proteínas de baixo peso molecular nas amostras Norma (6,80 kDa) e Hardjoprajitno (6,80 kDa e 5,30 kDa). Estas proteínas também podem constituir proteínas altamente imunogênicas, pois também não foram detectadas nos géis de poliacrilamida. Outra explicação para a ausência dessas proteínas de baixa massa molecular nos géis de poliacrilamida seria que o tempo de corrida pode ter sido muito extenso e as amostras saíram do gel, não podendo ser detectadas. Soro bovino contra a amostra Hardjoprajitno reconheceu um proteína de 44,33 kDa em todas as amostras, o que chama a atenção desta proteína pelo seu potencial diagnóstico ou na produção de vacinas contra leptospirose. As proteínas de baixa massa molecular reconhecidas pelo soro anti-Hardjo nas amostras Sponselee e Norma (4,22 kDa) e na própria amostra Hardjoprajitno (10,49 kDa e 6,16 kDa) também podem ser altamente imunogênicas ou terem saído do gel em função do tempo de corrida do mesmo.

A ausência de reconhecimento da amostra Sponselee pelo soro de bovino naturalmente infectado específico para a amostra Norma, assim como a pouca reatividade do soro anti- Sponselee para as três amostras testadas, pode indicar que a amostra Sponselee seja menos imunogênica que as outras duas amostras da sorovariedade Hardjo estudadas. Esta indicação ainda pode ser corroborada pela ausência de soros com reatividade específica para a amostra Sponselee dentre os milhares de soros do banco de soros do Laboratório de Zoonoses da Escola de Veterinária da UFMG.

Desta forma, o presente estudo permitiu a identificação de proteínas com imunogenicidade diferente entre as amostra Norma, Sponselee e Hardjoprajitno que podem ser utilizadas no desenvolvimento de métodos diagnósticos e vacinas contra a leptospirose bovina.

Agradecimentos.- Este estudo contou com o apoio financeiro da Fapemig e da FEP MVZ Coordenação Preventiva. TMA e SM são bolsistas da Capes. EMSD, APL e ECM são bolsistas do CNPq.

Recebido em 1 de fevereiro de 2011.

Aceito para publicação em 1 de março de 2011.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  28 Set 2011
• Data do Fascículo
  Jul 2011

Histórico

• Recebido
  01 Fev 2011
• Aceito
  01 Mar 2011