Introdução

A ocorrência de anemia interfere na taxa de crescimento dos animais, bem como influencia a ocorrência de enfermidades como pneumonia e diarreia neonatal (^{Ramin et al. 2012}). A principal reserva de ferro no organismo de bezerros encontra-se no tecido hepático, e, em geral, essa reserva é suficiente para evitar a ocorrência de anemia grave se os bezerros receberem volumoso nas primeiras semanas de vida. Dessa forma, a ocorrência de anemia, em especial por deficiência de ferro, acomete com maior frequência bezerros que recebem dietas exclusivas a base de leite por várias semanas, podendo afetar as taxas de crescimento e a conversão alimentar desses animais (^{NRC 2001}). Tal deficiência decorre da baixa concentração desse mineral no leite, crescimento pós-natal rápido dos animais e reserva escassa desse mineral no organismo (^{Moosavian et al. 2010}).

Algumas pesquisas mostraram decréscimo abrupto no teor de ferro do colostro logo nas primeiras horas após o parto, bem como diminuição significativa na concentração sérica de ferro, contagem de hemácias e teor de hemoglobina em bezerros neonatos no decorrer das primeiras semanas de vida, que pode resultar em anemia (^{Fagliari et al. 1998}, ^{Rizzoli et al. 2006}), no entanto, a ocorrência de anemia também pode estar relacionada a outros fatores nutricionais, tais como a falta de acesso dos bezerros a forragem nas primeiras semanas de vida, ou a deficiência de minerais como cobre, selênio, zinco e cobalto (^{Ramin et al. 2012}).

^{Gygax et al. (1993)} avaliaram a suplementação oral de ferro por meio do fornecimento de substituto do leite que continha 10 ou 50 mg/kg de ferro a bezerros, e relataram que a suplementação com 10 mg/kg foi ineficiente, ocasionando anemia, menor teor sérico de ferro, menor ganho de peso e maior incidência de infecções, em especial pneumonia. Também foi constatado que o número de neutrófilos com capacidade fagocítica, teor sérico de IgG e produção de linfócitos B pelos linfonodos foram reduzidos nos bezerros suplementados com essa dose.

^{Heidarpour Bami et al. (2008)} relataram que a administração parenteral de ferro e/ou cobre influenciou parâmetros hematológicos tais como volume globular, bem como o ganho de peso e a incidência de enfermidades em bezerros neonatos com aptidão leiteira, sendo que a suplementação apenas com ferro aumentou o ganho de peso desses animais no decorrer do primeiro mês de vida.

^{Mohri et al. (2004)}, suplementaram 20 bezerros com 150mg/dia de sulfato ferroso por 28 dias a partir do nascimento, obtendo valores significativamente maiores no volume globular e teor sérico de hemoglobina. ^{Moosavian et al. (2010)} conduziram um estudo com suplementação de ferro injetável e vitamina A em 40 bezerros da raça Holandesa e verificaram aumento significativo nos parâmetros eritrocitários, tanto nos animais que receberam apenas ferro suplementar, como também nos que receberam suplementação concomitante de ferro e vitamina A.

O objetivo do presente estudo foi avaliar a influência do tratamento com ferro suplementar sobre o eritrograma, teores séricos de ferro, transferrina e ceruloplasmina, bem como ureia, creatinina e enzimas hepáticas, com o intuito de avaliar protocolos de tratamento livres de nefrotoxicidade e hepatotoxicidade para incremento dos parâmetros eritrocitários de bezerros neonatos da raça Holandesa.

Material e Métodos

O delineamento experimental empregado foi aprovado pelo Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV) da Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho” (Unesp), campus de Jaboticabal sob protocolo número 009795-08.

Foram utilizados 40 bezerros recém-nascidos da raça Holandesa, filhos de vacas pluríparas com duas a quatro gestações, provenientes de uma propriedade de produção leiteira situada no município de Monte Alto - SP, na qual havia 200 vacas em lactação, com produção média de 18 kg de leite/vaca/dia. O peso vivo médio dos bezerros ao nascimento era 32,1±1,82 kg.

Após o nascimento, os bezerros permaneceram com as mães por aproximadamente 12 horas, e depois de receberem um volume mínimo de 4 litros de colostro por mamadeira foram transferidos para baias individuais, onde foram alimentados com um pool de leite de vaca integral proveniente das vacas em lactação, recebendo 2 litros de leite pela manhã e ao final da tarde. A partir dos 30 dias de idade foi adicionada à alimentação, ração especial para bezerros, feno e sal mineral. Aos 90 dias de idade os animais foram transferidos para o pasto, deixando de receber leite.

Os bezerros foram alocados aleatoriamente em cinco grupos experimentais, com oito animais em cada grupo, segundo o seguinte protocolo: administração intramuscular de 5mL de solução fisiológica estéril no 5º dia de idade (controle G1), administração intramuscular de 5mL de ferro dextrano 10% no 5º dia de idade (G2), administração intramuscular de 5mL de ferro dextrano 10% no 5^o e no 20º dias de idade (G3), administração intramuscular de 5mL de ferro dextrano 10% no 5^o e no 30º dias de idade (G4), administração intramuscular de 5mL de ferro dextrano 10% no 5^o, 20^o e 45º dias de idade (G5). A dose de ferro dextrano administrada em cada ocasião correspondeu a, aproximadamente, 15mg/kg, sendo essa a dose recomendada pelo fabricante.

Amostras de sangue foram coletadas mediante venopunção jugular, utilizando-se frascos de 5mL contendo EDTA, para a realização do hemograma e 10mL em frascos sem anticoagulante, para análises bioquímicas em sete momentos: até 8 horas e aos 5, 10, 20, 30, 60 e 90 dias após o nascimento. As amostras de sangue sem anticoagulante foram centrifugadas a 1.000xg e o soro sanguíneo obtido foi armazenado à temperatura de -18^oC, até o momento das análises.

De cada amostra de sangue venoso com EDTA foram aferidos os dados relativos às contagens de hemácias, ao teor de hemoglobina e a contagem de leucócitos totais em contador semiautomático (CELM CC-510, São Caetano do Sul, São Paulo, Brasil), padronizado para a espécie em estudo. O volume globular (VG) foi obtido através da técnica de microhematócrito e os índices hematimétricos (VCM, CHCM e HCM) foram calculados por meio de fórmulas matemáticas (^{Birgel 1982}). A contagem diferencial de leucócitos foi realizada em esfregaço sanguíneo, após coloração de Rosenfeld modificada (^{Thrall 2007}). Foram determinados os teores séricos de ferro (^{Goodwin et al. 1966}), ureia (^{Bergmeyer 1985}), creatinina (^{Burtis et al. 2007}) bilirrubinas total e direta (^{Sims & Horn 1958}), bem como as atividades das enzimas aspartato aminotransferase (^{Henry et al. 1960}), fosfatase alcalina (^{Bowers Junior & McComb 1975}) e gamaglutamiltransferase (^{Schumann et al. 2002}), utilizando-se conjuntos de reagentes de uso comercial (Labtest Diagnóstica, Lagoa Santa, Minas Gerais). As leituras das amostras foram realizadas em espectrofotômetro semiautomático (Labquest, Labtest Diagnóstica, Lagoa Santa, Minas Gerais), com luz de comprimento de onda apropriado para cada teste (560nm, 340nm, 510nm, 525nm, 340nm, 405nm, 405nm, respectivamente). Os teores séricos de ceruloplasmina e transferrina foram obtidos por meio da técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), segundo recomendações de ^{Laemmli (1970)}. Como referência foi utilizada uma solução marcadora com diferentes pesos moleculares, bem como a proteína transferrina purificada (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA).

Os dados foram submetidos à análise estatística utilizando-se o programa AgroEstat 1.0 (^{Barbosa & Maldonado Júnior 2008}). Os valores obtidos, expressos na forma de média e desvio padrão, foram analisados pelo teste de Tukey, após a verificação da homogeneidade das amostras, sendo considerados significativos quando P≤0,05.

Resultados

Notou-se diminuição da contagem de hemácias nos animais do G1 a partir do nascimento, com valores menores verificados aos 60 dias de vida (Quadro 1). O teor de hemoglobina e o volume globular (VG) aos 30 e 60 dias de idade foram significativamente menores no G1, e maiores no G3. Notou-se também diminuição no VG a partir dos cinco dias de idade apenas no grupo controle (G1). Não foi constatada variação significativa no VCM entre grupos, porém, no G4, foi notada discreta variação entre momentos. Nos demais grupos os valores mantiveram-se estáveis com o avançar da idade. Não foi verificada diferença significativa quanto à CHCM entre grupos, porém, houve discreta oscilação dos valores entre momentos, no G2 e G3. Os valores de HCM variaram entre momentos apenas no G1 e não se constatou diferença significativa entre grupos. Não foi verificada diferença significativa entre grupos ou entre momentos quanto à contagem de leucócitos (Quadro 1).

Nos bezerros do G1 e do G2, o teor sérico de ferro não apresentou variação significativa com o avançar da idade. No G3 ocorreu diminuição significativa do teor de ferro aos 5 dias de idade, seguida de aumento no 10º dia, mantendo-se estável até o 60º dia. No G4, o teor sérico de ferro diminuiu aos 5 dias de idade, aumentando aos 10 dias, diminuindo novamente aos 30 dias de idade. Nos grupos 1 a 4, a maior concentração de ferro foi verificada aos 90 dias de idade. No grupo 5 o maior valor foi verificado aos 60 dias de idade. Entre grupos, verificou-se que aos 60 dias de vida, o G5 apresentou teor sérico de ferro significativamente maior que os demais grupos.

Não se constatou diferença significativa nos teores séricos de ureia, bilirrubina total e bilirrubina direta entre grupos e com o avançar da idade. Em todos os grupos, os teores séricos de creatinina foram maiores logo após o nascimento, diminuindo e mantendo-se estáveis nos demais momentos. Quanto à atividade sérica da enzima AST, o maior valor foi constatado logo após o nascimento nos animais do G2. Não foi constatada variação significativa nos demais grupos e momentos (Quadro 2). Com um dia de vida, a atividade sérica da ALP foi maior nos animais do G2, já aos 60 dias de idade a atividade sérica desta enzima foi maior nos animais do G5. Também, notou-se diferença significativa entre os momentos nos grupos 1, 2 e 4, com valor máximo logo após o nascimento. Em todos os grupos, a atividade sérica de gamaglutamiltransferase (GGT) foi significativamente maior logo após a ingestão do colostro, diminuindo gradativamente com o avançar da idade.

Aos 10 e 20 dias de idade, respectivamente foram verificadas diferenças significativas quanto ao teor sérico de ceruloplasmina entre grupos, sendo que os animais do G1 apresentaram menores teores dessa proteína de fase aguda, enquanto os maiores teores foram verificados nos animais do G3 (Quadro 3). Entre momentos, nos grupos 1, 2, 3 e 5, os menores teores de ceruloplasmina foram verificados ao nascimento, e os maiores aos 90 dias (G1 e G2), 20 dias (G3) e 30 dias (G5). No G4 não foi verificada diferença entre momentos quanto aos teores de ceruloplasmina. Com relação aos teores de transferrina, logo após o nascimento, o menor valor foi verificado no G2 e o maior no G5, enquanto aos 10 dias de vida, o menor valor também foi verificado no G2 e o maior no G4. (Quadro 3). Nos grupos 1 e 4, verificaram-se oscilações entre momentos, com maior concentração sérica notada aos 5 dias de idade e menor aos 60 dias e aos 90 dias no G1 e no G4, respectivamente. Nos demais grupos (2, 3 e 5) não foi verificada diferença significativa entre momentos no decorrer do período experimental (Quadro 3).

O efeito dos diferentes protocolos de suplementação com ferro dextrano administrado por via intramuscular foi variável, ou seja, não foi verificado aumento significativo das variáveis eritrocitárias, bem como do teor sérico de ferro, de maneira uniforme nos momentos subsequentes à administração da suplementação (Quadro 1 e Quadro 2). Com relação aos teores séricos de ferro, o único protocolo no qual verificou-se aumento desse parâmetro nos momentos subsequentes à administração foi o de aplicação de ferro dextrano no 5º e no 20º dias de vida (G3).

Discussão

Em todos os grupos foi verificada diminuição na contagem de hemácias a partir do nascimento, que, entre o nascimento e os cinco dias de vida, pode ser explicada pela expansão do volume plasmático induzido pela ingestão de colostro e pela destruição de eritrócitos fetais (^{Rizzoli et al. 2006}). No G1, a falta de suprimento adequado de ferro para a síntese de hemácias pode ser implicada como causa da diminuição na contagem desse tipo celular verificada entre o nascimento e os 60 dias de vida (^{Rizzoli et al. 2006}). Segundo ^{Jain (1993)}, a contagem de hemácias, o teor de hemoglobina e volume globular de bovinos, em geral, são mais elevados ao nascimento, com tendência à diminuição gradativa no decorrer de alguns meses até se estabilizarem. Apesar de não ter sido verificada diferença significativa entre grupos, a diminuição do número de hemácias constatada no G1 foi mais pronunciada do que nos demais grupos, fato considerado biologicamente importante. Isso indica que o ferro suplementar foi utilizado para produção destas células (^{Bunger et al. 1982}). Todavia, as contagens de hemácias verificadas em todos os grupos encontraram-se dentro do intervalo de referência descrito para bezerros nesta faixa etária (^{Fagliari et al. 1998}, ^{Rocha et al. 2010}, ^{Benesi et al. 2012}), não sendo verificada a ocorrência de anemia em nenhum grupo.

^{Fagliari et al. (1998)}, ^{Atyabi et al. (2006)}, ^{Rizzoli et al. (2006)} e ^{Benesi et al. (2012)} relataram diminuição significativa dos teores de hemoglobina em bezerros neonatos, o que não foi constatado no presente estudo, entretanto, existe a possibilidade de que a diminuição verificada nesse parâmetro possa apresentar importância biológica. ^{Ježek et al. (2009)} relataram os menores teores séricos de hemoglobina e de ferro na quinta semana de idade, o que corrobora os achados do presente estudo, no qual os menores teores de hemoglobina foram verificados aos 30 e 60 dias de idade, e os menores teores de ferro aos 60 dias de idade no grupo controle (G1) e aos 5 dias de idade no G3, G4 e G5, uma vez que no G2 não foi verificada diferença significativa entre momentos. Assim, a suplementação com ferro dextrano injetável mostrou-se importante, uma vez que possivelmente evitou uma diminuição significativa dos teores de ferro séricos a partir do 5º dia de vida. Entretanto, no G2 foi verificada diminuição dos teores séricos de ferro após a administração da suplementação com esse elemento aos 5 dias de vida; nesse caso, outros fatores não controlados no experimento, como manejo das vacas e reservas desse mineral no organismo dos bezerros podem ter interferido na resposta à suplementação. Notou-se que os grupos que receberam suplementação com ferro dextrano mantiveram teores maiores de hemoglobina, volume globular e teor sérico de ferro, embora em algumas ocasiões essa diferença não tenha sido significativa entre grupos. Considera-se que a ação biológica da suplementação realizada seja importante, uma vez que, no grupo controle, embora sem o desenvolvimento de anemia, a contagem de hemácias, teor de hemoglobina e volume globular foram menores que nos grupos suplementados. Diante da ocorrência de enfermidades comuns em bezerros jovens, tais como a tristeza parasitária bovina, diarreia e pneumonia, os animais do grupo controle apresentariam anemia mais precocemente que os animais suplementados, o que poderia ter influência significativa no desfecho dessas enfermidades nesses animais.

Os índices hematimétricos mantiveram-se no intervalo de referência para a espécie (^{Radostits et al. 2010}, ^{Jones & Allison 2007}) e não foi notada tendência ao decréscimo do VCM com o avançar da idade, como descrito por ^{Mohri et al. (2007)}, ^{Benesi et al. (2012)} e ^{Rocha et al. (2013)}. Segundo ^{Reece et al. (1984)} o tratamento com ferro suplementar induz aumento do VCM e CHCM, apesar de não ter sido notada diferença significativa entre grupos nestes dois parâmetros, verificou-se aumento discreto nos grupos que receberam suplementação com ferro.

Ademais, é importante ressaltar também que, apesar da introdução de ração e sal mineral na alimentação dos bezerros a partir dos 30 dias de idade, houve ainda um período de decréscimo, ainda que não significativo, nos parâmetros eritrocitários mesmo nos grupos que receberam a suplementação. Posteriormente, aos 90 dias de vida, tendo os bezerros sido desmamados, verificou-se então aumento nesses parâmetros, possivelmente decorrente da introdução de novas fontes de ferro na alimentação, uma vez que o leite não apresenta teores de ferro suficientes para suprir as necessidades dos bezerros na fase de crescimento (^{Atyabi et al. 2006}).

A administração intramuscular de ferro dextrano não ocasionou aumento significativo nos teores séricos de ferro em nenhum dos grupos estudados, no entanto, as alterações verificadas podem apresentar importância biológica, uma vez que a avaliação do teor sérico de ferro reflete apenas o compartimento de transporte desse elemento, podendo os valores obtidos não apresentarem, necessariamente, o reflexo dos demais compartimentos de ferro no organismo (^{Kaneko et al. 2008}). Ademais, constatou-se que a dose de ferro dextrano utilizada não ocasionou sobrecarga por esse elemento. Segundo ^{Knowles et al. (2000)}, a concentração sérica de ferro em bezerros recém-nascidos diminui com a idade e só aumentam após 83 dias de vida. Tal afirmação foi semelhante ao descrito por ^{Atyabi et al. (2006)}, que relataram que o teor sanguíneo de ferro diminui a partir de dois dias após o nascimento até, aproximadamente, dois meses de idade, influenciando a contagem de hemácias. Em estudo realizado por ^{Fagliari et al. (1998)}, a diminuição do teor sérico de ferro, com o avanço da idade foi semelhante ao verificado para o teor de hemoglobina e para o volume globular. No presente estudo verificou-se diminuição mais acentuada da contagem de hemácias, teor de hemoglobina e volume globular aos 30 e 60 dias de idade e do teor sérico de ferro aos 60 dias de idade nos animais não suplementados com ferro (G1). Outros estudos com suplementação de ferro injetável mostraram aumento significativo nos parâmetros eritrocitários e no teor sérico de ferro (^{El-Sangary et al. 2004}, ^{Moosavian et al. 2010}).

Os teores séricos de ureia, creatinina, bilirrubina total e direta encontram-se dentro dos valores de referência relatados para a espécie (^{Fagliari et al. 1998}, ^{Knowles et al. 2000}). Já o fato da atividade sérica da enzima GGT mostrar-se maior ao nascimento do que nos demais momentos em todos os grupos é explicado pela alta atividade dessa enzima no colostro de vacas, sendo essa enzima absorvida pelos bezerros por ocasião da ingestão do colostro para garantia da transferência de imunidade passiva, e a diferença verificada entre os grupos neste momento deve-se às diferentes quantidade e qualidade do colostro ingerido por cada animal. Segundo ^{Zanker et al. (2001)}, a atividade sérica alta de GGT em ruminantes neonatos é indicativa de ingestão adequada de colostro. ^{Knowles et al. (2000)} relatam que a atividade sérica desta enzima só chega ao valor normal de adultos por volta de 40 dias de idade.

Segundo ^{Fagliari et al. (1998)}, a atividade de AST é maior ao nascimento e decresce com a idade; no presente estudo não foi constatada diferença entre grupos. Variações relativamente amplas foram notadas nos teores séricos da enzima ALP, com maiores valores logo após o nascimento, corroborando com os achados de ^{Fagliari et al. (1998)}. Segundo ^{Radostits et al. (2010)}, tais variações são comuns em bovinos normais, o que dificulta a interpretação de resultados da avaliação da atividade dessa enzima. Tais achados permitem afirmar que a aplicação intramuscular de ferro dextrano a 10% em bezerros neonatos não ocasionou nefrotoxicidade nem hepatotoxidade.

Verificou-se que os teores séricos de ceruloplasmina foram significativamente menores ao nascimento, quando comparados aos demais momentos em todos os grupos, exceto o G4, sendo significativamente inferiores nos animais do G1 aos 10 e 20 dias de vida quando comparados aos demais grupos, corroborando o relato de ^{Rocha et al. (2013)}. A ceruloplasmina é uma proteína de fase aguda envolvida no metabolismo de ferro, em especial na oxidação de Fe²⁺ a Fe³⁺, o que permite a incorporação do ferro à transferrina (^{Eckersall 2008}, ^{Tothova et al. 2014}).

Segundo ^{Tothova et al. (2014)}, o teor sérico de transferrina aumenta em bezerros com deficiência de ferro, resultando numa correlação negativa com os teores de hemolglobina, o que difere dos achados do presente estudo, no qual os teores séricos desta proteína de fase aguda tiveram comportamento semelhante aos encontrados para os teores séricos de ferro e para os parâmetros eritrocitários. ^{Rocha et al. (2013)}, em estudo com animais da raça Canchim-Nelore, verificou teores menores dessa proteína ao nascimento, aumentando com o avançar da idade. A transferrina é uma proteína de fase aguda negativa envolvida no transporte de ferro, cujo valor diagnóstico está na avaliação de enfermidades que interferem no metabolismo deste elemento (^{Eckersall 2008}, ^{Tothova et al. 2014}). Os valores obtidos no presente estudo foram semelhantes aos notados por ^{Fagliari et al. (2007)}, em bezerros da raça Holandesa saudáveis, o que mostra que os animais do presente estudo não desenvolveram anemia no período avaliado.

Os teores séricos de creatinina, ureia e bilirrubinas total e direta e as atividades das enzimas AST, ALP e GGT foram normais para bezerros nesta faixa etária, sugerindo que os protocolos de administração de ferro suplementar não ocasionaram nefrotoxicidade ou hepatoxidade aos animais.

Uma vez que nenhum dos protocolos de suplementação com ferro dextrano injetável instituídos ocasionou aumento significativo dos parâmetros eritrocitários avaliados, bem como do teor sérico de ferro, não é possível recomendá-los como forma de suplementação visando evitar o desenvolvimento e anemia ferropriva em bezerros, já que em nenhum dos grupos avaliados, incluindo o grupo controle, foi constatado o desenvolvimento de anemia. Entretanto, foi possível estabelecer que, realizando até três aplicações utilizando a dose recomendada pelo fabricante, não foram constatados sinais de nefrotoxicidade nem de hepatotoxicidade.

Conclusão

A suplementação com ferro dextrano em bezerros que têm acesso a outras fontes de alimento que não apenas o leite não traz benefícios aos parâmetros eritrocitários e que justifiquem sua utilização, embora seja necessário realizar mais estudos para avaliar a influência da suplementação com ferro dextrano por via parenteral sobre a ocorrência e o desfecho de infecções em bezerros jovens, em especial quanto aos custos com o tratamento, tempo necessário para recuperação e impacto sobre a vida produtiva na idade adulta.