Introdução

O protozoário do gênero Sarcocystis spp. é um parasita intracelular obrigatório, sendo importante principalmente em animais de produção, devido o seu ciclo de vida estar diretamente relacionado com o consumo da carne destes animais (^{Dubey & Lindsay 2006}). O Sarcocystis cruzi, Sarcocystis hirsuta e Sarcocystis hominis tem como hospedeiro definitivo cães, gatos e primatas, respectivamente, sendo o hospedeiro intermediário o bovino. No ciclo de vida de Sarcocystis suihominis o homem é o hospedeiro definitivo e os suínos são os hospedeiros intermediários (^{Ruas et al. 2001}). Duas espécies são consideradas zoonóticas para o homem, S. hominis e S. suihominis, onde a infecção ocorre pela ingestão da carne ou produtos cárneos dos hospedeiros intermediários crus ou mal cozidos contendo cistos do protozoário (^{Rommel 1985}). Geralmente a infecção não produz um quadro sintomático grave, sendo os sinais clínicos bastante variáveis de acordo com o grau de infecção (^{Italiano et al. 2014}). Porém as manifestações clínicas costumam ser evidenciadas quando a infecção é causada pelo S. suihominis em pacientes imunocomprometidos (^{Reys 2008}).

Os produtos cárneos consumidos crus ou mal cozidos são considerados alimentos de alto risco epidemiológico na veiculação de agentes patogênicos (^{Germano & Germano 2001}, ^{Dubey & Lindsay 2006}), e dentre estes produtos disponíveis ao consumo humano, podemos citar o filé mignon, a carne moída e o salame colonial. O filé mignon bovino é um corte bastante utilizado para a confecção do Carpaccio, geralmente encontrado em bares e restaurantes, o qual consiste em finas fatias de carne crua (^{Lucquin et al. 2012}). A carne moída bovina é um produto que pode ser utilizado para o preparo de quibe cru (^{Braga & Ferreira 2013}), e o salame colonial, é um derivado cárneo produzido por processos de cura e fermentação, produzidos com carne suína e bovina ou apenas suína (^{Silva et al. 2011}). Sendo assim, por serem consumidos crus estes alimentos podem apresentar riscos à saúde pública podendo veicular diversos parasitas, entre eles o Sarcocystis spp.

Para realização do diagnóstico, o uso de técnicas moleculares é uma ferramenta importante na investigação epidemiológica da sarcoscistose. Diversos estudos utilizam a reação em cadeia da polimerase (PCR) com amplificação do gene 18S rRNA para o diagnóstico de infecções por Sarcocystis spp., com ênfase na identificação das espécies utilizando sequenciamento e/ou a técnica de polimorfismo no comprimento do fragmento de restrição (RFLP) (^{Yang et al. 2002}, ^{Stojecki et al. 2012}). Neste estudo, o objetivo foi detectar a presença do Sarcocystis spp. e realizar a caracterização molecular das espécies encontradas em 375 amostras de produtos cárneos (filé mignon bovino, carne moída bovina e salame colonial).

Material e Métodos

Os produtos cárneos foram adquiridos em 18 estabelecimentos comerciais (10 açougues e 8 mercados) e em 15 feiras livres da cidade de Santa Maria, Rio Grande do Sul. Um total de 375 amostras foram avaliadas (125 amostras de filé mignon bovino, 125 amostras de carne moída bovina e 125 amostras de salame colonial). A carne moída e o filé mignon foram adquiridos em estabelecimentos comerciais, com diferentes níveis de inspeção sanitária (municipal, estadual e federal). As amostras de salame colonial apresentavam origem mista (produzido com carne suína e bovina) sendo adquiridas de feiras livres, que possuíam inspeção sanitária municipal. Durante o transporte, o material coletado foi armazenado em caixas isotérmicas refrigeradas e posteriormente congeladas a -20°C até a realização da extração. A seleção e coleta das amostras ocorreu de forma aleatória, sendo que para o seu número total foi utilizado o cálculo amostral de população infinita (^{Hennekens & Buring 1987}).

As amostras foram submetidas à extração de DNA com o kit comercial (Wizard^® Genomic DNA Purification Kit-Promega), seguindo instruções do fabricante, com modificações na etapa de lise, de acordo com ^{Moré et al. (2011)}. Após a extração, foi estimada a concentração de DNA em cada amostra através da medição com luz ultravioleta (UV) a 260nm de absorbância, com adequação da concentração mínima de 100ng/μl de DNA em cada amostra, sendo estas armazenadas a -20°C até a sua utilização (^{Eslami et al. 2014}). Para detecção do agente Sarcocystis spp. através da amplificação parcial do gene 18S rRNA, utilizou-se as sequências de Sarco F-‘CGCAAATTACCCAATCCTGA’ e Sarco R-‘ATTTCTCATAAGGTGCAGGAG’. A reação de PCR foi realizada em volume final de 25μl, contendo 5μl de tampão, 100ng de cada iniciador, 10mM de deoxinucleotídeo trifosfato (dNTPs), uma unidade de Taq DNA Polimerase GoTaq^® (Hot Start Polymerase, Promega, Madison, WI, USA) e 100ng de DNA total utilizado como molde. Para amplificação do DNA, foram utilizados 35 ciclos com desnaturação inicial 94°C por 5 minutos, desnaturação 94°C por 45 segundos, anelamento 55°C por 45 segundos, extensão 72°C por 45 segundos, seguido por extensão final a 72°C por 5 minutos. Os produtos da PCR foram visualizados por eletroforese em gel de agarose a 1% em transluminador UV. Para controle positivo foi utilizado uma amostra de coração bovino sabidamente positivo para a presença de cistos de Sarcocystis spp. Foram consideradas positivas amostras com fragmentos de 700pb.

Para o desenvolvimento da RFLP foram utilizadas as enzimas de restrição Bcl I ^® (Promega, Madison, WI, USA) e Rsa I ^® (Promega, Madison, WI, USA) para diferenciação das espécies de Sarcocystis cruzi, S. hirsuta e S. hominis positivas pela PCR. Devido à presença de carne das espécies bovina e suína nos salames coloniais, a presença da espécie S. suihominis também foi pesquisada, utilizando a enzima de restrição Alu I ^® (Promega, Madison, WI, USA). Conforme ^{Yang et al. (2002}), fragmentos de S. cruzi são cortados apenas com a enzima Rsa I, S. hirsuta é cortado pelas enzimas Bcl I e Rsa I e S. hominis permanece sem cortes com ambas enzimas. Para a análise de restrição com a enzima Bcl I, uma reação com 20μl de volume final foi preparada, contendo 5μl de produto de PCR, 2U Bsa, 5U de BcI, 2μl de tampão e 12μl de água miliQ, com incubação a 55°C por 60 minutos. Para a enzima Rsa I, foi realizada uma reação com volume final de 20μl, com 5μl de produto de PCR, 2U de Bsa, 5U de Rsa, 2μl de tampão e 12μl de água miliQ, sendo as amostras incubadas a 37°C por 4 horas. Para a enzima de restrição Alu I, uma reação com volume final 27μl, foram adicionados 5μl de produto da PCR, 2μl de tampão, 20μl de Alu e 18μl de água miliQ, sendo incubado a 37°C por 2 horas. Os resultados foram visualizados em gel de agarose 2%.

Todos os dados foram analisados utilizando o programa SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC). Os resultados foram analisados pelo teste de Qui-quadrado, com nível de significância de p≤0,05.

Resultados e Discussão

Do total das 375 amostras de carne bovina, 64 (17%, IC: 13,4 - 21,3) foram positivas para a presença do DNA do Sarcocystis spp. As amostras de filé mignon, carne moída e de salame colonial, apresentaram positividade de 5,6% (7/125, IC: 2,3-11,3), 12,8% (16/125, IC: 7,5-19,9) e 32,8% (41/125, IC: 24,7-41,8) respectivamente (Quadro 1). Quanto à presença de DNA de Sarcocystis spp., houve diferença significativa (p≤0,05), entre a frequência encontrada para as espécies de Sarcocystis hirsuta e S. hominis, sendo 93,7% (60/64, IC: 84,7-98,2) para S. hirsuta e 6,3% (4/64, IC: 1,72-15,23) para S. hominis, do total das amostras positivas encontradas, sendo a diferenciação destas espécies realizada através da técnica de RFLP (Fig.1). Todas as amostras de salame colonial positivas na PCR foram posteriormente analisadas por RFLP com a enzima Alu I apresentando resultado negativo, sugerindo assim que a espécie S. suihominis não esteve presente na amostragem testada. O controle positivo foi caracterizado como S. cruzi, sendo cortado apenas pela enzima Rsa I (Fig.1).

Fig.1. (A e C) Análise de polimorfismo no comprimento do fragmento de restrição (RFLP) com as enzimas Bcl I e (B e D) Rsa I. Marcador de DNA de 100pb (M), controle negativo (C-), Sarcocystis cruzi cortado apenas por Rsa I (C+). Sarcocystis hominis sem cortes em ambas as enzimas (1a e 1b). Sarcocystis hirsuta cortado com as duas enzimas (2a e 2b). * Fragmentos de dois tamanhos diferentes migraram em conjunto. 

A detecção e identificação de patógenos nos alimentos são cruciais para a saúde pública. Nesse sentido, o desenvolvimento da biologia molecular tem contribuído para melhorar os métodos de diagnóstico e a caracterização das espécies de Sarcocystis spp. Comparado com outros métodos de diagnóstico, as técnicas moleculares são métodos mais precisos para identificação dos agentes causadores de diversas doenças (^{Stojecki et al. 2012}). No sul do Brasil, bovinos clinicamente saudáveis apresentam alta prevalência de sarcocistose, sendo o S. cruzi a espécie mais frequente (^{Ruas et al. 2001}). Conforme estudos anteriores, cerca de 90% dos animais adultos são positivos em diversos países, sendo o músculo cardíaco o tecido mais afetado (^{Böttner et al. 1987}, ^{Dubey et al. 1989}, ^{Nourani et al. 2010}, ^{Bucca et al. 2011}, ^{Moré et al. 2011}). Nas amostras de filé mignon bovino a frequência de detecção do DNA do Sarcocystis foi de 5,6% (7/125), porém não existem pesquisas específicas para este corte de carne. Assim, devido sua utilização na produção do Carpaccio, é importante avaliar a ocorrência deste protozoário nessa porção muscular.

Em pesquisas realizadas por ^{Pena et al. (2001)} com quibe cru na cidade de São Paulo, 100% (50/50) das amostras foram positivas para Sarcocystis spp., salientando que o preparo de quibe cru com carne bovina, pode ser uma fonte de transmissão de S. hominis para humanos. No estado do Rio Grande Sul, ^{Ruas et al. (2001)}, determinaram uma elevada ocorrência de Sarcocystis spp. em bovinos clinicamente sadios, detectando através de exame direto, cistos teciduais em diferentes porções musculares analisadas. A mistura de diferentes porções musculares pode favorecer um maior índice de detecção parasitária nas amostras de carne moída (12,8%), quando comparado com os resultados encontrados nas amostras de filé mignon (5,6%), porém esta diferença não apresentou significância estatística (p≥0,05).

A detecção de 32,8% (41/125) em amostras de salame colonial sugere que os animais que deram origem à matéria-prima utilizada na fabricação destes embutidos, eram criados de forma desconhecida, provavelmente permitindo livre acesso de outros animais, entre eles possíveis hospedeiros definitivos às instalações de criação (^{Dubey & Lindsay 2006}). Porém a presença do protozoário não significa necessariamente risco potencial para infecção aos humanos, já que a utilização adequada de sais de cura na fabricação dos embutidos e o processo de defumação podem diminuir a viabilidade de infecção dos cistos (^{Kijlstra & Jongert 2009}). A prevalência mundial de S. suihominis geralmente é baixa (^{Saito et al. 1998}), porém é importante a pesquisa do seu DNA em amostras que contenham carne suína, pois é um parasita que pode circular entre seres humanos e suínos, que apresenta o homem como seu hospedeiro definitivo e que também pode desenvolver sinais clínicos (^{Dubey & Lindsay 2006}). Neste trabalho não foi detectada sua presença nas amostras de salame colonial, que são de origem mista, ou seja, são produzidos com carne de bovinos e suínos.

Das amostras positivas, S. hirsuta foi caracterizado em 93,7% (60/64) e S. hominis em 6,3% (4/64) das amostras, apresentando diferença de detecção significativa entre elas (p≤0,05). Dessa maneira, pode ser sugerido que felinos e humanos que são seus hospedeiros definitivos, possuem contato e livre acesso às instalações dos bovinos, que são os seus hospedeiros intemediários (^{Fayer 2004}). A ocorrência do S. hominis pode ser um fator de risco que contribui para a contaminação humana, uma vez que a infecção do hospedeiro definitivo se dá através da ingestão de carne crua ou mal cozida contendo os sarcocistos (^{Ruas et al. 2001}). Devido ao potencial zoonótico, associado à falta de esclarecimentos na sua patogenicidade, é importante a sua prevenção através do cozimento a 65°C ou pelo congelamento a -4°C dos produtos cárneos a serem empregados na alimentação humana (^{Srivastava et al. 1986}).

O diagnóstico molecular tem sido amplamente utilizado na detecção e caracterização de diversas espécies, incluindo o Sarcocystis spp. (^{Yang et al. 2002}). A PCR é uma alternativa que pode ser empregada em amostras processadas, congeladas ou que tenham sofrido alguma ação capaz de tornar inviável a identificação dos cistos através de microscopia, apesar de geralmente apresentar uma sensibilidade menor quando comparada com o exame microscópico direto (^{Moré et al. 2011}). A técnica baseada em RFLP pode ser aplicada para diferenciar espécies morfologicamente semelhantes de Sarcocystis spp. Apresentando menor custo e maior agilidade na obtenção de resultados quando em comparação ao sequenciamento de DNA (^{Yang et al. 2002}). A identificação das espécies é importante, principalmente, pela relevância desta parasitose na área de saúde pública, pois o homem pode adquirir a doença através da ingestão de carne crua ou mal cozida (^{Fayer 2004}).

Conclusões

Os resultados encontrados revelam a presença dos parasitas Sarcocystis spp. em amostras de filé mignon bovino, carne moída bovina e salame colonial, sendo caracterizados pela RFLP como Sarcocystis hirsuta e S. hominis.

A detecção de S. hominis pode ser um fator de risco para a contaminação humana, através da ingestão de carne crua ou mal cozida que contenham sarcocistos.

Entre os produtos cárneos testados, o salame colonial apresentou maior ocorrência de amostras positivas, sendo S. hirsuta a espécie mais frequentemente detectada. Porém, a presença do DNA deste protozoário não significa necessariamente potencial de infecção aos humanos, pois cuidados nos processos de fabricação podem reduzir a viabilidade dos cistos