Atividade acaricida de diferentes solventes sobre fêmeas ingurgitadas e larvas de Rhipicephalus microplus

Acaricidal activity of different solvents on engorged females and larvae of Rhipicephalus microplus

RESUMO:

Os carrapatos causam perdas econômicas à indústria pecuária no Brasil. Dessa forma, o uso de fitoterápicos como acaricidas mostrou eficácia no controle desses parasitas. Neste estudo, foi avaliada a eficácia in vitro dos seguintes fármacos: dimetil sulfóxido (DMSO), etanol, metanol, propilenoglicol e monolaurato de sorbitan polietilenoglicol em diluições de 100%, 20%, 10%, 5%, 1% e 0,5%. O efeito tóxico destes solventes em fêmeas e larvas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus foi analisado. O teste de biocarrapaticidograma, foi utilizado para definir a eficiência reprodutiva das teleóginas de R. microplus e a eficiência dos produtos testados. Para análise da susceptibilidade das larvas foi utilizado o teste por imersão de larvas em seringa modificado. O uso de propilenoglicol e DMSO em fêmeas ingurgitadas e o uso de DMSO, etanol, metanol e propilenoglicol em larvas, todos à concentração de 0,5%, apresentaram uma menor taxa de mortalidade, podendo ter seu uso indicado em baixas concentrações como solventes de acaricidas utilizados no controle do R. microplus.

TERMOS DE INDEXAÇÃO:
Rhipicephalus microplus; solvente; ixodideo; bovinos; Boophilus; toxicoses

ABSTRACT:

Cattle ticks cause economic losses to the cattle industry in Brazil. The use of phytotherapics as acaricides has shown efficacy of the control of these parasites. In the present study, the in vitro efficacy of the following drugs was evaluated: dimethyl sulfoxide (DMSO), ethanol, methanol, propylene glycol and polyethylene glycol sorbitan monolaurate at dilutions 100%, 20%, 10%, 5%, 1% e 0.5%. The toxic effect of these solvents on engorged female and larvae of Rhipicephalus microplus was analyzed. The immersion test was used to define the reproductive efficiency of engorged R. microplus females and efficiency of the drugs. The immersion test larvae modified syringe was used to analyze of the susceptibility of tick larvae. Propylene glycol and DMSO was used on engorged females and DMSO, ethanol, methanol and propylene glycol, all at concentration of 0.5%, were use on larvae the, showed the lowest mortality rate; this indicate that its use at low concentrations as solvent acaricide in the control of R. microplus could be recommended.

INDEX-TERMS:
Rhipicephalus microplus; solvent; ticks; cattle; Boophilus; toxicoses

Introdução

O Rhipicephalus microplus, tem distribuição cosmopolita, mas ocorre principalmente em áreas tropicais e subtropicais, causando prejuízos econômicos pra bovinocultura (Holdsworth et al. 2006). Devido ao uso indiscriminado de acaricidas comerciais, os carrapatos vêm desenvolvendo mecanismos de resistência aos produtos químicos, relatados em diversos países (Fernández-Salas et al. 2012, Sharma et al. 2012b, Machado et al. 2014, Puerta et al. 2015). Carrapaticidas contendo substâncias vegetais são formas alternativas ao controle químico dos carrapatos, que usualmente são utilizados no controle integrado desta parasitose (Zaman et al. 2012). Diversos solventes vêm sendo empregados nas formulações de carrapaticidas ou em experimentos com extratos vegetais (Gonçalves et al. 2007, Monteiro et al. 2012, Sharma et al. 2012a, Valente et al. 2014). Estes produtos possuem o propósito de solubilizar o princípio ativo, permitindo uma distribuição homogênea por toda a cutícula do artrópode para ampliar sua ação (Chagas et al. 2003).

Os extratos vegetais geralmente apresentam baixa solubilidade em água, sendo assim necessário o uso de solventes orgânicos para extração de seus compostos ativos, que promovem a dissolução de seus constituintes armazenados nos diferentes compartimentos da planta, com sua posterior lixiviação para o meio exterior (Hall et al. 1990). A qualidade final de um extrato depende diretamente da seleção do solvente utilizado para sua obtenção (Raaman 2006), sendo assim importante que estes produtos não apresentem efeitos sobre os carrapatos (Ravindran et al. 2011a). Estudos que tratam dos efeitos acaricidas sobre larvas de R. microplus não são muito comuns e a maioria dos testes in vitro visa à detecção da ação de mortalidade sobre as fêmeas ingurgitadas do carrapato. Desta maneira, o objetivo deste estudo foi avaliar a ação acaricida de cinco solventes em diferentes concentrações, sobre as fases de teleóginas e larvas do R. microplus, para identificar qual a concentração e o solvente mais indicado para a preparação e obtenção de extratos vegetais para o controle do carrapato.

Material e Métodos

Para a realização deste estudo foram utilizados os seguintes solventes: dimetil sulfóxido (DMSO), etanol, metanol, propilenoglicol e monolaurato de sorbitan polietilenoglicol (tween 20^®, Vetec Química Fina Ltda, Duque de Caxias/RJ, Brasil). Para a realização das diluições foi utilizado água ultra-pura, sendo considerada a pureza analítica de cada produto, para obtenção das concentrações de 100%, 20%, 10%, 5%, 1% e 0,5%.

Teste de imersão de teleóginas. Para avaliar a sensibilidade das fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus, foram coletadas aproximadamente 1000 teleóginas de bovinos, em uma única propriedade rural onde os animais não recebiam produtos acaricidas por no mínimo 30 dias, localizada no estado do Rio Grande do Sul. Foi realizado o teste in vitro de imersão de teleóginas (biocarrapaticidograma) conforme Drummond et al. (1973) e Camillo et al. (2009), sendo estes executados em triplicatas. Foram formados 32 diferentes grupos, constituídos pelos seguintes solventes em diferentes diluições: DMSO, etanol, metanol, propilenoglicol e monolaurato de sorbitan polietilenoglicol (diluições de 100%, 20%, 10%, 5%, 1% e 0,5%); controle negativo (água destilada), controle positivo (clorpirifós 30%, cipermetrina 15% e fenthion 15%). Para seleção do produto utilizado como controle positivo, foi realizado anteriormente um teste de eficácia de acaricidas, com este apresentando uma eficiência de 100%. A eficiência dos solventes foi determinada baseado na fórmula sugerida por Drummond et al. (1973):

Eficiência Reprodutiva (ER) = (peso dos ovos X % de eclosão dos ovos X 20000)/peso das teleóginas

Eficiência do Solvente = (ER do grupo controle - ER do grupo tratado X 100)/ER do grupo controle

Teste de imersão de larvas (TIL). Para avaliar a sensibilidade das larvas de R. microplus, 500 teleóginas foram coletadas. Após pesagem, os carrapatos foram selecionados em grupos homogêneos e fixados em placas de Petri, mantidas em estufa de demanda biológica de oxigênio (DBO), com temperatura de 27°C e umidade de 90%, por 14 dias para oviposição. Os ovos das teleóginas foram coletados para a realização do teste de imersão de larvas (TIL) conforme Sindhu et al. (2012). Os ovos foram pesados e colocados em seringas de 3ml, com a extremidade anterior seccionada, coberta com tecido de malha ultrafina e fixada por elástico ortodôntico. Em cada seringa foram colocados 10 mg de ovos (aproximadamente 200 ovos), sendo posteriormente acondicionados em estufa DBO para a incubação e eclosão dos ovos. As seringas que não apresentaram eclosão de 100% dos ovos foram descartadas. Trinta e dois grupos foram constituídos pelos seguintes solventes em diferentes diluições: DMSO, etanol, metanol, propilenoglicol e monolaurato de sorbitan polietilenoglicol (diluições de 100%, 20%, 10%, 5%, 1% e 0,5%); controle negativo (água destilada); controle positivo (clorpirifós 30%, cipermetrina 15% e fenthion 15%). Juntamente às larvas eclodidas em cada seringa, foi adicionado 3ml de cada solução a ser testada por 30 segundos, com posterior remoção do produto. Para avaliação da mortalidade das larvas, cada seringa foi observada em microscópio esterioscópico em 24 horas e 6 dias após os banhos de imersão (Sindhu et al. 2012). Larvas que apresentavam movimentos nas patas ou se deslocavam, foram consideradas vivas. A mortalidade das larvas foi expressa em porcentagens, sendo consideradas as médias de mortalidade encontradas para cada solvente testado nas suas diferentes concentrações. Para o cálculo da mortalidade das larvas foi considerada a seguinte fórmula:

Mortalidade = (larvas mortas X 100)/total de larvas

Análise estatística. Todos os dados para avaliação estatística foram realizados através do programa SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC). A significância das eficácias dos solventes e das diferentes concentrações foram analisadas através do teste de Kruskal-Wallis, com uma confiança de 95%.

Resultados e Discussão

Neste estudo 5 solventes foram testados in vitro, em diferentes concentrações, com o objetivo de avaliar seus efeitos acaricidas sobre fêmeas adultas e larvas do Rhipicephalus microplus. Os resultados das médias de eficácia após o teste de imersão das fêmeas ingurgitadas dos carrapatos, nos solventes testados em diferentes concentrações, estão demonstrados na Quadro 1. Os controles positivos e negativos apresentaram eficácias de 100% e 0% respectivamente (dados não mostrados). O uso de dimetil sulfóxido (DMSO), propilenoglicol e monolaurato de sorbitan polietilenoglicol utilizados na concentração de 100%, inibiram totalmente a postura das fêmeas ingurgitadas, demonstrando uma eficácia de 100%, ou seja, estes solventes nesta concentração apresentaram toxicidade total para as teleóginas (Quadro 1). Somente foram observadas diferenças estatísticas significativas entre os diferentes solventes na concentração de 0,5%, onde apenas o DMSO e o propilenoglicol, apresentaram uma menor toxicidade que os demais (Quadro 1). Para as diferentes concentrações aplicadas dentro de um mesmo solvente, foi verificado que apenas o DMSO nas concentrações de 5%, 1% e 0,5% e o propilenoglicol nas concentrações de 10%, 5%, 1% e 0,5% apresentaram menor toxicidade significativa em comparação com os demais produtos (Quadro 1).

Quadro 1.
Média de eficácia (%) dos solventes, após imersão de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus em dimetil sulfóxido (DMSO), etanol, metanol, propilenoglicol e monolaurato de sorbitan polietilenoglicol, em diferentes concentrações

Solventes	Concentração dos solventes (%)
	100	20	10	5	1	0,5
DMSO	100aA	78,5aAB	72aAB	27aB	29,5aB	18aB
Etanol	98aA	69,5aA	73aA	50aA	50aA	45,5abA
Metanol	97,5aA	79aA	76aA	72,5aA	71aA	65bA
Propilenoglicol	100aA	93,5aA	31aB	26,5aB	20aB	7,5aB
Monolaurato de sorbitan polietilenoglicol	100aA	90,5aA	84aA	61,5aA	49,5aA	57abA

• Letras minúsculas distintas se referem à diferença estatística entre a mesma concentração de diferentes solventes, avaliados de maneira isolada, através do teste de Kruskal-Wallis (p<0,05). Letras maiúsculas distintas se referem à diferença estatística entre as diferentes concentrações de um mesmo solvente, avaliados de maneira isolada, através do teste de Kruskal-Wallis (p<0,05).

Os resultados da avaliação das médias de mortalidade de larvas de R. microplus em 24 horas e 6 dias após imersão nos solventes testados nas diferentes concentrações estão demonstrados na Quadro 2. Os controles positivos e negativos das larvas apresentaram mortalidade de 100% e 0% respectivamente (dados não mostrados). O uso de DMSO, metanol, propilenoglicol e monolaurato de sorbitan polietilenoglicol, na concentração de 100% em 24 horas após imersão e o uso DMSO a 20% em 6 dias após imersão, apresentaram toxicidade máxima com mortalidade total das larvas (Quadro 2). O DMSO é considerado um excelente permeabilizador de membranas, permitindo a penetração de produtos a serem testados de maneira eficiente (Chagas et al. 2003). A ação tóxica que o DMSO apresenta, já havia sido verificada em pesquisa anterior, porém em concentrações mais elevadas (Chagas et al. 2003). Concentrações de até 10% podem ser utilizadas com baixa mortalidade, porém concentrações acima de 20% demonstram altas taxas de letalidade em fêmeas adultas (Gonçalves et al. 2007, Sharma et al. 2012a). Neste estudo, em larvas do carrapato na concentração de 0,5% do DMSO, resultou em uma média de mortalidade de 5,6% e 7,3% no período de 24 horas e 6 dias após imersão, respectivamente, indicando uma baixa toxicidade deste solvente nestas concentrações (Quadro 2). De maneira semelhante, Resende et al. (2012) observaram que o DMSO a 1%, em teste de imersão em larvas de carrapatos dos gêneros Amblyomma cajennense e Dermacentor nitens, mostrou baixa toxicidade com índices de 4% de mortalidade. Desta maneira, o DMSO pode causar altas taxas de mortalidade, em concentrações mais elevadas, tendo seu uso contra indicado como solvente de extratos vegetais que serão utilizados no controle do R. microplus.

Quadro 2.
Média de mortalidade de larvas de Rhipicephalus microplus 24 horas e 6 dias após imersão em dimetil sulfóxido (DMSO), etanol, metanol, propilenoglicol e monolaurato de sorbitan polietilenoglicol, em diferentes concentrações

		Concentração de solventes (%)
		100	20	10	5	1	0,5
24 horas	DMSO	100aA	66,6abAB	33,3aABC	18,3aBCD	13,3aCD	5,6aD
	Etanol	76,6aA	63,3abAB	41,6aABC	23,3aABC	20aBC	5aC
	Metanol	100aA	40aAB	36,6aABC	36,6aABC	23,3aBC	13,3aC
	Propilenoglicol	100aA	41,6aAB	30aABCD	10aCD	8,3aD	5aD
	Monolaurato de sorbitan polietilenoglicol	100aA	93,3abAB	75aABC	40aBC	35aBC	30bC
6 dias	DMSO	100aA	100aA	80aAB	30aABC	18,3aBC	7,3aC
	Etanol	76,6aA	73,3bA	48,3aAB	23,3aAB	23,3aAB	6,6aB
	Metanol	100aA	43,3bAB	40aAB	40aAB	25aB	15aB
	Propilenoglicol	100aA	100aA	90aAB	15aAB	10aB	8,3aB
	Monolaurato de sorbitan polietilenoglicol	100aA	95abAB	80aAB	50aB	45aB	40bB

• Letras minúsculas distintas se referem à diferença estatística entre a mesma concentração de diferentes solventes, avaliados de maneira isolada, através do teste de Kruskal-Wallis (p<0,05). Letras maiúsculas distintas se referem à diferença estatística entre as diferentes concentrações de um mesmo solvente, avaliados de maneira isolada, através do teste de Kruskal-Wallis (p<0,05).

O etanol e o metanol apresentaram um alto índice de mortalidade no seu uso tanto em fêmeas adultas (Quadro 1), quanto em larvas do carrapato (Quadro 2), porém o uso de etanol a 0,5% demonstrou pequena taxa de mortalidade (5% em 24 horas e 6,6% em 6 dias, após imersão). Conforme Gonçalves et al. (2007), empregando o etanol no teste de imersão em fêmeas ingurgitadas de R. microplus, verificaram que este solvente apresentou máxima ação tóxica. Para o metanol, resultados semelhantes também indicam presença de toxicidade em teleóginas, não sendo indicados como solventes adequados para testes acaricidas nesta espécie de carrapato (Chagas et al. 2003, Gonçalves et al. 2007). No entanto Sharma et al. (2012a), consideraram que concentrações de etanol menores de 25% e de metanol menores que 50% como seguras em fêmeas ingurgitadas submetidas à imersão. Nas larvas, estudos anteriores demonstraram baixa toxidez do etanol e do metanol, mesmo em elevadas concentrações (Chagas et al. 2003, Gonçalves et al. 2007). Assim, vale ressaltar que as diferenças de susceptibilidade aos solventes empregados podem ser atribuídas a diversos fatores, que vão desde a composição da cutícula do artrópode, diferentes técnicas de imersão utilizadas e diferenças entre as cepas carrapatos (Resende et al. 2012).

O teste empregando o solvente propilenoglicol, apresentou alto índice de eficácia em teleóginas, nas concentrações de 100% a 1% (Quadro 1). No teste de imersão das larvas, apresentou baixa toxicidade apenas na concentração de 0,5% no período de 24 horas após imersão (Quadro 2). O propilenoglicol é um solvente viscoso, utilizado em uma grande variedade de formulações farmacêuticas, sendo empregado na preparação de extratos vegetais (Anchisi et al. 2001, Jaenson et al. 2006, Pohlit et al. 2011). Os relatos científicos avaliando o propilenoglicol em produtos acaricidas são bastante escassos, portanto este solvente combinado com fungicidas melhorou significativamente a eficiência de produtos testados in vitro sobre o fungo Bipolaris sorokiniana em sementes de cevada (Barba et al. 2003).

O teste utilizando monolaurato de sorbitan polietilenoglicol foi tóxico em todas suas concentrações nos testes realizados (Quadros 1 e 2). Concentrações acima de 8% do monolaurato de sorbitan polietilenoglicol, já apresentaram altas taxas de mortalidade em fêmeas adultas, porém não foram observadas taxas de mortalidade nem impactos negativos na realização de ovipostura, quando este solvente foi utilizado em concentrações menores de 6% (Sharma et al. 2012a). Em estudo anterior utilizando o monolaurato de sorbitan polietilenoglicol a 1%, apresentou baixo efeito tóxico contra carrapatos adultos de Rhipicephalus annulatus, no entanto esta concentração resultou em efeito inibitório sobre a eclosão dos ovos (Ravindran et al. 2011b). Este solvente apresenta característica lipofílica, podendo remover a camada epicuticular dos carrapatos e desta maneira favorecer a absorção de princípios ativos, podendo resultar em mortalidade dos ixodideos (Odhiambo 1982). Neste estudo, foi verificado que em nenhuma das concentrações testadas para as larvas a mortalidade média foi inferior a 30% (Quadro 2), portanto sendo considerado um solvente de alta toxicidade.

Os resultados encontrados demonstraram que as teleóginas apresentaram maiores taxas de mortalidade quando comparado as larvas. Essa diferença pode ser relativa à composição da cutícula entre estas duas fases de desenvolvimento dos carrapatos (Chagas et al. 2003). A camada cuticular externa dos carrapatos adultos é composta principalmente por ceras e proteínas, podendo ser observada uma maior quantidade de lipídeos na cutícula do R. microplus a partir da ecdise da ninfa para a fase adulta (Balashov 1972), portanto as larvas não possuem esta camada de cera o que pode ter permitido uma maior ação dos solventes. Essa composição da cutícula dos artrópodes também pode justificar a ação acaricida observada nos testes com os solventes DMSO, propilenoglicol e monolaurato de sorbitan polietilenoglicol em altas concentrações. Sendo assim, quanto maior a lipossolubilidade do produto, maior será a capacidade dos princípios ativos penetrarem na cutícula do carrapato (Odhiambo 1982).

Conclusões

O propilenoglicol a 0,5% apresentou o menor índice de eficácia em teleóginas.

Na avaliação das larvas, o dimetil sulfóxido (DMSO), etanol e o propilenoglicol, utilizados na concentração de 0,5% foram os solventes que apresentaram menores efeitos tóxicos.

As fêmeas ingurgitadas, quando comparadas às larvas, demonstraram ser mais sensíveis aos solventes utilizados.

Pela ação conjunta, tanto em fêmeas adultas quanto em larvas de Rhipicephalus microplus, o propilenoglicol e DMSO a 0,5% foram os solventes que demonstraram as menores taxas de toxicidade, demonstrando pouco efeito acaricida, podendo ser indicados como possíveis solventes em soluções carrapaticidas.

Agradecimentos

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo importante auxílio através de bolsa.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Jun 2018

Histórico

• Recebido
  05 Maio 2017
• Aceito
  19 Maio 2017