Ocorrência de anticorpos anti-Toxoplasma gondii e anti-Neospora caninum em ovinos com distúrbios reprodutivos e fatores de risco

Occurrence of antibodies anti-Toxoplasma gondii and anti-Neospora caninum in sheep with history of reproductive disorders and risk factors

RESUMO:

Objetivou-se avaliar a ocorrência, sinais clínicos e fatores de risco associados a soropositividade para Toxoplasma gondii e Neospora caninum em ovinos. Foram utilizados 294 animais com histórico de distúrbios reprodutivos de 28 fazendas do estado de São Paulo, Brasil, diagnosticados através da imunofluorescência indireta (1:64 e 1:50). A ocorrência de T. gondii foi de 29,9% (88/294) e de N. caninum 18% (53/294), sendo 3,7% (11/294) dos ovinos soropositivos para ambos. Observou-se com maiores chances à infecção pelo T. gondii: ovinos mestiços (p=0,04), Santa Inês (p=0,006), fornecimento de pastagem (p<0,001) ou associada a concentrado (p<0,001), uso exclusivamente de monta natural (p=0,002, OR=2,28 e IC95%=1,37-3,79) e a presença de aves nas propriedades (p=0,001). Na infecção por N. caninum essa chance aumentou em: fêmeas (p=0,031), propriedades sem aprisco (p<0,001) e sistema de criação semi-intensivo (p<0,001). Em relação ao histórico de problemas reprodutivos, ovelhas infectadas pelo N. caninum e T. gondii apresentaram redução da chance de apresentarem abortamento (p=0,044) e repetição de estro (p=0,025) respectivamente. O T. gondii esteve mais presente sorologicamente que o N. caninum em ovinos com histórico de distúrbios reprodutivos e apesar de suas semelhanças, diferiram epidemiologicamente em aspectos relacionados as características da criação como raça, sexo, sistema de criação, tipo de alimentação e manejo reprodutivo.

TERMOS DE INDEXAÇÃO:
Anticorpos; anti-Toxoplasma gondii; anti-Neospora caninum; fatores de risco; ovinos; distúrbios reprodutivos; aborto; toxoplasmose; neosporose; repetição de cio; parasitoses

ABSTRACT:

The objective was to evaluate the occurrence, clinical signs and risk factors associated with seropositivity to Toxoplasma gondii and Neospora caninum in sheep. We used 294 sheep with history of reproductive disorders from 28 farms located in the state of São Paulo, southeastern Brazil. Producers were interviewed, and blood samples were collected to perform indirect immunofluorescence tests (1:64 and 1:50 respectively). The frequency of T. gondii infection was found to be 29.9% (88/294), the frequency of N. caninum was 18% (53/294), and 3.7% (11/294) of the sheep were seropositive for both. We observed the following risk factors associated with T. gondii infection: crossbred sheep (p=0.04), Santa Inês breed (p=0.006), pasture supply (p<0.001) or associated with concentrate (p<0.001), exclusive use of natural breeding (p=0.002), and presence of birds on farms (p=0.001). For N. caninum the factors were: female sheep (p=0.031), absence of barns (p<0.001), and semi-intensive system (p<0.001). In relation to the history of reproductive problems, N. caninum and T. gondii infected sheep presented a reduction in the risk of having an abortion (p=0.044) and repeated estrus (p=0.025) respectively. T. gondii was more serologically present than N. caninum in sheep with a history of reproductive disorders and, despite their similarities, differed epidemiologically in aspects related to breeding characteristics such as race, sex, breeding system, type of feeding and reproductive management.

INDEX TERMS:
Antibodies; anti-Toxoplasma gondii; anti-Neospora caninum; risk factors; sheep; reproductive disorders; abortion; toxoplasmosis; neosporosis; repeat breading; parasitoses

Introdução

A produtividade das explorações de ovinos depende muito de sua eficiência reprodutiva, e dois agentes que estão intimamente relacionados a essas perdas são Toxoplasma gondii e Neospora caninum que são parasitos protozoários do filo Apicomplexa estreitamente relacionados, embora apresentem diferenças filogenéticas, ultraestruturais, antigênicas e biológicas (Silva et al. 2013a, 2013b).

A toxoplasmose é uma das doenças parasitárias mais importantes da ovinocultura (Silva et al. 2013b). Entre os animais de criação, cabras, ovelhas e porcos são geralmente mais sensíveis à infecção em comparação com bovinos, equinos e aves, que raramente apresentam sintomas (Millar et al. 2008). Perdas devido a toxoplasmose durante a prenhez afeta cerca de 1,4-3,9% dos rebanhos ovinos, o que corresponde a um prejuízo de 1.4-4.700.000 dólares (Freyre et al. 1999), principalmente devido aos abortamentos (Morley et al. 2008, Gabardo et al. 2013). Geralmente as ovelhas não apresentam sintomas no caso de uma infecção natural por T. gondii, exceto em casos raros de retenção de placenta (Dubey & Kirkbride 1989), ou o desenvolvimento de cistos no tecido do sistema nervoso e muscular. Estudos sorológicos realizados em ovinos mostraram que a frequência da infecção por T. gondii varia de 1,8% a 95,7%, dependendo da região do mundo e os testes de diagnóstico aplicados (Silva et al. 2013b).

No caso da neosporose em ovinos, estudos em âmbito nacional apresentaram variação de 1,8 a 64,2% de soropositivos (Silva et al. 2013a). Figliuolo et al. (2004) estimaram uma prevalência de zero a 22,7% em trinta propriedades de São Paulo. É uma doença infecciosa da reprodução responsável por casos de aborto e mortalidade neonatal em ruminantes, principalmente em bovinos (Wilson et al. 2016), no entanto pesquisadores vêm alertando quanto aos distúrbios em ovinos (Moreno et al. 2012, Arranz-Solís et al. 2015), como os relatados no Brasil (Moore 2005, Moreno et al. 2012, Pinto et al. 2012), onde foi isolado e sequenciado pela primeira vez em 2007 (Pena et al. 2007).

Estudos sobre a neosporose demonstraram que algumas raças, o sistema de criação extensivo, pequenos produtores (<30 ha), utilização de pastagens comuns, vários tipos de fontes de água e a presença de mais de um cão resultou em uma maior probabilidade de os animais serem diagnosticados como soropositivos (Al-Majali et al. 2008, Farias et al. 2010, Paiz et al. 2015). Em bovinos leiteiros, cada cão presente na propriedade rural, aumentou em 1,13 vezes a probabilidade de infecção (Corbellini et al. 2006); no entanto, outros estudos com ovinos não observaram associação entre a presença de cães e ovinos sorospositivos sugerindo uma transmissão preferencialmente vertical nestes casos (Figliuolo et al. 2004, Romanelli et al. 2007, Soares et al. 2009, Souza Neto et al. 2009, Moura et al. 2014)

Ovinos são infectados por T. gondii através da ingestão de pastagem e água contaminadas por oocistos liberados nas fezes de gatos, que são o hospedeiro definitivo do parasita (Esteban-Redondo & Innes 1997, Silva et al. 2013b), enquanto no caso da neosporose essa função cabe aos canídeos (Silva et al. 2013a). A soropositividade para essas enfermidades está relacionada com a contaminação ambiental (Frenkel et al. 1975), principalmente em regiões úmidas devido a formação de um microambiente favorável à manutenção de oocistos viáveis no solo (Pita Gondim et al. 1999, Silva et al. 2003), havendo também correlação entre as fontes de água e a infecção oral (Romanelli et al. 2007). Há ainda a possibilidade de transmissão congênita e via sêmen (Lopes et al. 2013, Santos et al. 2016, Azevedo Filho et al. 2017, Consalter et al. 2017) causando transtornos reprodutivos nas fêmeas infectadas, como absorção fetal, morte embrionária e aborto (Syed-Hussain et al. 2015).

A toxoplasmose e neosporose são caracterizadas como doenças responsáveis por grandes perdas econômicas na exploração de ovinos, tornando-se necessária a realização de estudos que ajudem a melhor compreender seus aspectos. Os objetivos do presente estudo foram analisar ocorrência de anticorpos anti-T. gondii e anti-N. caninum e os fatores de risco para ovinos com distúrbios reprodutivos.

Materiais e Métodos

A pesquisa foi desenvolvida na Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (FMVZ-USP) após aprovação do projeto pelo Comitê de Bioética da FMVZ/USP, protocolo nº 1153/2007.

As coletas foram realizadas, em propriedades localizadas no Estado de São Paulo, entre os anos de 2008 e 2009, sendo utilizados soros de ovinos, acima de um ano e com histórico de um ou mais transtornos reprodutivos, totalizando 294 amostras (257 ovelhas e 37 carneiros). Entre as ovelhas, os distúrbios reprodutivos observados incluíram aborto, endometrite, malformação fetal, nascimento de cordeiros fracos, natimorto, distocia, parto prematuro, presença de secreções uterinas, prolapso uterino, repetição de cio, infertilidade e/ou retenção de placenta. Os distúrbios nos carneiros incluíram infertilidade, degeneração, hiperplasia e hipoplasia testicular, orquite, epididimite e/ou baixo libido. Estes dados foram inseridos em registros clínicos, juntamente com os obtidos a partir do exame ginecológico (hiperemia da mucosa, mucosa pálida, presença de nódulos, petéquias, pústulas, telangiectasia e vesículas), andrológico (orquite, epididimite e infertilidade) e das características das fazendas (raça, sistema de produção, instalações, manejo alimentar, manejo reprodutivo, presença de outras espécies de animais na propriedade). Os ovinos eram oriundos de 28 propriedades rurais localizadas em dezenove cidades do Estado de São Paulo (Atibaia (3), Campinas (1), Cunha (1), Indaiatuba (1), Itapevi (1), Itatinga (1), Itu (2), Itupeva (1), Jundiaí (3), Morungaba (2), Pedra Bela (3), Piedade (1), Piracaia (1), Pirassununga (1), Santa Rita do Passa Quatro (1), Santo Anastácio (1), São Paulo (1), Valinhos (1) e Vargem (2). Os animais foram submetidos individualmente a exame clínico geral e do trato genital de acordo com os critérios recomendados por Antón & Mayayo (2007).

As amostras de sangue foram coletadas por punção venosa, da veia jugular em tubo a vácuo, sem anticoagulante, centrifugadas a 1600 RPM por 10 minutos, e os soros foram acondicionados em microtubos e congelados a -20^oC até o momento da análise. A presença de anticorpos anti-Toxoplasma gondii e anti-Neospora caninum, foi investigada através da reação de imunofluorescência indireta (RIFI) de acordo com Camargo (1964), através de lâminas sensibilizados com taquizoítos de T. gondii ou N. caninum (Imunodot, Imunoteste^® T. gondii e N. caninum), examinadas sob microscopia de luz, com objetiva de quarenta e ocular de dez vezes. Foi utilizado um conjugado com FITC comercial (KPL; anticorpo de coelho anti IGG de ovelha). O diagnóstico sorológico da infecção pelo T. gondii e N. caninum foi estabelecido por meio de RIFI, utilizando ponto de corte para a triagem 1:64 e 1:50 respectivamente. O soro foi considerado positivo quando a fluorescência ocorreu em toda a superfície dos taquizoítos de N. caninum ou T. gondii e negativa quando a fluorescência era apical ou ausente (Paré et al. 1995). As lâminas foram analisadas em microscópio de fluorescência com lente objetiva de 40x.

A reação em cadeia da polimerase (PCR) para a detecção de T. gondii ou N. caninum foi realizada em cinco fetos abortados por quatro fêmeas. Para a identificação de T. gondii, foi extraído o DNA genômico em seguida empregado o método de amplificação do mesmo descrito por Homan et al. (2000), no qual foram utilizados oligonucleotídeos iniciadores específicos para o gênero Toxoplasma (Tox4 e Tox5), com obtenção de fragmentos de 529 pb (Garcia et al. 2006). A detecção de N. caninum foi realizada de acordo com o procedimento descrito por Hughes et al. (2006) e Barratt et al. (2008), cujas reações foram baseadas na amplificação das sequências do gene Nc5 do DNA genômico e ITS1 do DNA ribossomal respectivamente, que posteriormente foram submetidos a eletroforese onde os fragmentos de DNA foram comparados com padrão de peso molecular de 100 pb.

A determinação das frequências absolutas e relativas foi obtida através da análise estatística descritiva. Para o estudo dos fatores de risco associados à infecção por T. gondii e N. caninum, foi realizada a análise univariada das variáveis de interesse pelo teste qui-quadrado de Pearson, ou Exato de Fisher, quando necessário. Posteriormente, foi realizada a análise de regressão logística considerando como variável dependente para a infecção por T. gondii ou N. caninum o resultado da RIFI (positivo ou negativo). As variáveis independentes ou explanatórias consideradas no modelo foram aquelas que apresentaram significância estatística <0,05. Essa probabilidade foi estipulada para que possíveis fatores de risco do evento não fossem excluídos da análise (Hosmer & Lemeshow 1989). A análise estatística foi realizada utilizando R.2.7.1 (www.r-project.org), Minitab 14 e software SPSS versão 15.

Resultados

A frequência de ovinos soropositivos a Toxoplasma gondii foi de 29,9% (88/294), sendo numericamente maior entre ovelhas (30,7%) quando comparado com carneiros (24,3%), p=0,430. Já a de Neospora caninum foi de 18% (53/294), sendo 20,2% (52/254) entre as fêmeas e 2,7% (1/37) entre os machos, com ovelhas apresentando mais possibilidade de infecção em relação aos carneiros (p=0,031, OR=9,13 e IC 95%=1,22-68,16). A ocorrência de propriedades, com ao menos um ovino soropositivo para um dos agentes do estudo, foi de 75% (21/29).

Os efeitos de sexo, raça, sistema de produção, instalações, manejo alimentar e reprodutivo, presença de outras espécies animais na propriedade sobre o risco de ovelhas serem soropositivas para T. gondii ou N. caninum são descritos no Quadro 1.

Quadro 1.
Análise de significância pelo teste de Qui-Quadrado entre ovinos soropositivos a Toxoplasma gondii e Neospora caninum em relação ao sexo, raça, tipo de instalação, alimentação, sistema de criação, presença de outras espécies animais e tipo de monta. São Paulo 2008-2009

Variável	Categoria	Total de ovinos	T. gondii				N. caninum
			Positivos	Negativos	Valor p	Odds ratio (IC95%)	Positivos	Negativos	Valor p	Odds ratio (IC95%)
Sexo	Fêmea	257	79 (30,7%)	178 (69,3%)	0,43	1,39 (0,62-3,01)	52 (20,2%)	202 (79,8,%)	0,031	9,13 (1,22-68,16)
	Macho	37	9 (24,3%)	28 (75,7%)	Ref.	-	1 (2,7%)	36 (97,3,%)	Ref.	-
Raça	Dorper	29	9 (31%)	20 (69%)	0,15	2,03 (0,78 - 5,26)	0 (0%)	29 (100%)	< 0,001	-
	Lanadas	88	16 (18,2%)	72 (%)	Ref.	-	24 (27,3%)	64 (72,7%)	0,085	1,73 (0,93-3,22)
	Mestiços	20	8 (40%)	12 (60%)	0,04	3,00 (1,05 - 8,54)	1 (5%)	19 (95%)	0,18	0,24 (0,03-1,89)
	Santa Inês	157	55 (35%)	102 (65%)	0,006	2,43 (1,29 - 4,57)	28 (17,8%)	129 (82,2%)	Ref.	-
Instalações	Com aprisco	249	79 (31,7%)	170 (68,3%)	0,087	2,03 (0,90 - 4,58)	29 (11,6%)	230 (88,4%)	Ref.	-
	Sem aprisco	45	8 (18,3%)	37 (81,7%)	Ref.	-	24 (55,8%)	21 (44,2%)	< 0,001	9,58 (4,19-19,60)
Alimentação	Pastagem	51	22 (43,1%)	29 (56,9%)	< 0,001	4,27 (1,98 - 9,20)	6 (11,8%)	45 (88,2%)	Ref.	-
	Pastagem + concentrado	90	37 (41,1%)	53 (58,8%)	< 0,001	3,93 (1,99 - 7,73)	23 (25,6%)	67 (74,4%)	0,057	2,58 (0,97- 6,82)
	Pastagem + concentrado + silagem	116	16 (15,1%)	100 (84,9%)	Ref.	-	22 (20,8%)	94 (79,2%)	0,17	1,96 (0,74 - 5,20)
	Concentrado + silagem	47	13 (27,7%)	34 (72,3%)	0,071	2,15 (0,94 - 4,94)	2 (4,3%)	45 (95,7%)	0,19	0,333 (0,06-1,74)
Sistema de criação	Intensivo	80	20 (25%)	60 (75%)	0,26	0,72 (0,4-1,28)	3 (3,8%)	77 (96,2%)	Ref.	-
	Semi-intensivo	214	68 (31,8%)	146 (68,2%)	Ref.	-	50 (23,4%)	164 (76,6%)	0,001	7,83 (2,37-25,88)
Espécie	Bovino	59	19 (32,2%)	40 (67,8%)	0,67	1,14 (0,62-2,11)	8 (13,6%)	51 (86,4%)	0,32	0,66 (0,294-1,493)
	Canino	183	58 (31,7%)	125 (68,3%)	0,40	1,23 (0,74-2,11)	37 (20,2%)	146 (79,8,%)	0,21	1,51 (0,79-2,86)
	Felino	192	51 (26,7%)	141 (73,3%)	0,087	0,64 (0,38 - 1,06)	32 (16,7%)	160 (83,3%)	0,41	0,77 (0,42-1,42)
	Aves	141	55 (39,7%)	86 (60,3%)	0,001	2,49 (1,49 - 4,17)	22 (15,6%)	119 (84,4%)	0,30	0,73 (0,4-1,33)
Manejo Reprodutivo	Natural	132	52 (39,4%)	80 (60,6%)	0,002	2,28 (1,37 - 3,79)	22 (16,7%)	110 (83,3%)	0,58	1,18 (0,65-2,16)
	Misto	162	36 (22,2%)	126 (77,8%)	Ref.	-	31 (19,5%)	131 (80,5%)	Ref.	-
TOTAL		294	88 (29,9%)	206 (70,1%)	-	-	53 (18%)	241 (82%)	-	-

• Ref. = Parâmetro de referência na análise de significância; Valores de p<0,05 são estatisticamente significantes.

A toxoplasmose esteve presente independente do sistema de produção, com taxas de soropositivos de 25% e 31% (p=0,26), respectivamente, para os sistemas intensivo e semi-intensivo. Ovinos de raças lanadas apresentaram-se menos susceptíveis a infecção por T. gondii que os das raças Santa Inês (p=0,006, OR=2,43 e IC 95%=1,29-4,57) e mestiços (p=0,04, OR=3,00 e IC 95%=1,05-8,54).

Em relação a neosporose os animais criados sob o sistema semi-intensivo apresentaram 7,86 mais possibilidades de serem soropositivos (p<0,001, IC 95%=2,37-25,88), quando comparado com animais criados no sistema intensivo, com taxas de 23% e 3,8% de soropositivos, respectivamente. Além disso, rebanhos que não possuíam aprisco foram 9,58 (p<0,001, IC 95%=4,19-19,60) mais propensos a apresentarem ovinos soropositivos para N. caninum.

Em relação ao manejo alimentar, no que se diz respeito à toxoplasmose, quando avaliamos o tipo de alimento fornecido observou-se maior risco de infecção quando o rebanho recebe exclusivamente pastagem (p<0,001, OR=4,27 e IC 95%=1,98-9,20), seguida pelo fornecimento de pastagem e alimento concentrado (p<0,001, OR=3,93 e IC 95%=1,99-7,73). Não foi observada relação entre a presença de animais soropositivos ao N. caninum e o tipo de alimento fornecido (p≥0,05).

Rebanhos que utilizavam exclusivamente a monta natural, como manejo reprodutivo, apresentaram-se 2,28 (p=0,002 e IC 95%=1,37-3,79) vezes mais propensos a apresentar ovelhas infectadas do que rebanhos submetidos ao manejo reprodutivo misto, utilizando a monta natural bem como as biotecnologias.

Quanto à criação consorciada de outras espécies, a presença de aves nas propriedades aumentou o risco de contaminação por T. gondii, por 2,49 vezes (p=0,001, IC 95%=1,49-4,17), enquanto a presença de felinos, bovinos e caninos não afetaram de forma significativa o risco de infecção aos protozoários (p≥0,05).

Nenhuma correlação significativa foi observada entre a infecção por T. gondii e/ou N. caninum e os sinais clínicos observados durante o exame ginecológico (Quadro 2) e andrológico (Quadro 3), realizados no momento da coleta do material biológico.

Quadro 2.
Análise de significância pelo teste de Qui-Quadrado entre ovelhas soropositivas a Toxoplasma gondii e Neospora caninum em relação à presença ou não de sinais clínicos no momento do exame ginecológico. São Paulo 2008-2009

Variáveis	Categoria	Total de ovinos	T. gondii		N. caninum
			Positivos	Valor p	Positivos	Valor p
Mucosa hipercorada	Sim	46	11 (23,9%)	0,27	5 (10,9%)	0,09
	Não	211	68 (32,2%)		47 (22,3%)
Mucosa hipocorada	Sim	13	4 (30,8%)	0,99	4 (30,8%)	0,34
	Não	244	75 (30,7%)		48 (19,7%)
Nódulos	Presente	15	6 (40%)	0,43	2 (13,3%)	0,98
	Ausente	242	73 (30,2%)		51 (20,2%)
Petéquias	Presente	5	3 (60%)	0,18	1 (20%)	0,99
	Ausente	252	76 (30,2%)		52 (20,4%)
Pústulas	Presente	2	0 (0%)	-	0 (0%)	-
	Ausente	255	79 (31%)		51 (23,3%)
Secreções	Presente	38	12 (31,6%)	0,90	1 (2,6%)	0,018
	Ausente	219	67 (30,6%)		51 (23,3%)
Telangectasia	Presente	28	9 (32,1%)	0,87	7 (25%)	0,51
	Ausente	229	70 (30,6%)		45 (19,7%)
Vesículas	Presente	1	1 (100%)	-	0 (0%)	-
	Ausente	256	78 (30,5%)		52 (20,3%)

• Ref. = Parâmetro de referência na análise de significância; Valores de p<0,05 são estatisticamente significantes.

Quadro 3.
Ocorrência de carneiros soropositivos a Toxoplasma gondii e Neospora caninum e a presença ou não de sinais clínicos no momento do exame andrológico. São Paulo 2008-2009

Distúrbio Reprodutivo	Total de ovinos	T. gondii	N. caninum
		Positivos
Baixa fertilidade	5	1 (20%)	0 (0%)
Controle	23	4 (17,4%)	0 (0%)
Degeneração testicular	2	1 (50%)	0 (0%)
Falta de libido	4	2 (50%)	0 (0%)
Hiperplasia de epidídimo	1	0 (0%)	1 (100%)
Hiperplasia testicular unilateral	2	1 (50%)	0 (0%)
Total de carneiros	37	9 (24,3%)	1 (2,7%)

Em relação ao histórico de problemas reprodutivos relatados, foi observado valores significantes apenas quanto a ocorrência de abortamento e repetição de estro (Quadro 4), onde ovelhas infectadas por N. caninum e T. gondii apresentaram redução do risco de abortamento (p=0,044, OR=0,53, IC 95%=0,29-0,98) e repetição de estro (p=0,025, OR=0,49, IC 95%=0,26-0,92) respectivamente (Quadro 5).

Quadro 4.
Análise de significância pelo teste de Qui-Quadrado entre ovinos soropositivos a Toxoplasma gondii e Neospora caninum em relação à presença ou não de distúrbios reprodutivos no histórico de fêmeas ovinas. São Paulo, 2008-2009

Variáveis	Categoria	Total de ovinos	T. gondii		N. caninum
			Positivos	Valor p	Positivos	Valor p
Aborto	Sim	136	48 (35,3%)	0,094	21 (15,4%)	0,044
	Não	121	31 (25,6%)		31 (25,6%)
Endometrite	Sim	6	1 (16,7%)	0,46	0 (0,0%)	-
	Não	251	78 (31,1%)		52 (20,3%)
Malformação fetal	Sim	3	1 (33,3%)	0,92	0 (0,0%)	-
	Não	254	78 (30,7%)		52 (20,5%)
Morte neonatal	Sim	34	11 (32,4%)	0,83	9 (26,5%)	0,33
	Não	223	68 (30,5%)		43 (19,3%)
Nascimento cordeiro fraco	Sim	30	7 (23,3%)	0,35	7 (23,3%)	0,65
	Não	227	72 (31,7%)		45 (19,8%)
Natimortalidade	Sim	7	2 (28,6%)	0,90	0 (0,0%)	-
	Não	250	77 (30,8%)		52 (20,8%)
Parto distócico	Sim	6	2 (33,3%)	0,89	0 (0,0%)	-
	Não	251	77 (30,7%)		52 (20,7%)
Parto prematuro	Sim	3	2 (66,6%)	0,22	0 (0,0%)	-
	Não	254	77 (30,3%)		52 (20,5%)
Prolapso uterino	Sim	2	0 (0,0%)	-	0 (0,0%)	-
	Não	255	79 (31,0%)		52 (20,4%)
Repetição de cio	Sim	77	16 (20,8%)	0,025	21 (27,3%)	0,068
	Não	180	63 (35,0%)		31 (17,2%)
Retenção de placenta	Sim	3	0 (0,0%)	-	0 (0,0%)	-
	Não	254	79 (31,1%)		52 (20,5%)

• Ref. = Parâmetro de referência na análise de significância; Valores de p<0,05 são estatisticamente significantes.

Quadro 5.
Análise de regressão logística dos fatores de risco da presença de distúrbios reprodutivos em ovinos infectados por Toxoplasma gondii e Neospora caninum. São Paulo, 2008-2009

Variável	T. gondii		N. caninum
	Valor p	Odds ratio (IC 95%)	Valor p	Odds ratio (IC 95%)
Aborto	0,094	1,58 (0,92 - 2,71)	0,044	0,53 (0,29 - 0,98)
Repetição de cio	0,025	0,49 (0,26 - 0,92)	0,068	1,80 (0,96 - 3,40)

• Valores de p<0,05 são estatisticamente significantes.

A taxa de animais que foram concomitantemente soropositivas para ambos os protozoários foi de 3,74% (11/294). Não foi detectado o DNA genômico dos parasitas, pesquisados através da PCR, em nenhum dos cinco fetos ovinos abortados.

Discussão

A soroprevalência de Toxoplasma gondii apresenta grande variação de acordo com a área pesquisada. No presente estudo, 29,9% dos animais foram soropositivos, similar ao que foi observado por outros autores no estado de São Paulo (Meireles et al. 2003, Figliuolo et al. 2004, Felicio et al. 2008), mas inferior a ocorrência relatada na microrregião de Jaboticabal de 52% (Lopes et al. 2010). Trabalho realizado no Estado de Pernambuco, utilizando rebanhos com histórico de problemas reprodutivos, apresentaram valores inferiores (16,9%) de soropositivos (Pereira et al. 2012). A ocorrência de propriedades com ovinos soropositivos foi de 75% (21/28), diferente, de outros relatos que observaram pelo menos um animal soropositivo em cada uma das fazendas investigadas (Ogawa et al. 2003, Figliuolo et al. 2004, Romanelli et al. 2007, Pinheiro Junior et al. 2009, Souza Neto et al. 2009, Thomaz-Soccol et al. 2009, Ueno et al. 2009, Lopes et al. 2010). No entanto no presente trabalho, o número de animais coletados por propriedade variou de um a 44, devido ao caráter do estudo de pesquisar apenas animais que apresentaram histórico de distúrbios reprodutivos, sendo assim justifica-se que propriedades onde foram coletadas poucas amostras não apresentarem animais soropositivos.

Na ovinocultura a neosporose é relatada há 26 anos (Dubey & Lindsay 1990), e no Brasil, os levantamentos realizados desde 2004 apontam frequências entre 1,8% e 64,2% (Silva et al. 2013a). Neste estudo, com uma população de animais com histórico de falhas reprodutivas a frequência de animais soropositivos foi acima a de outros realizados em São Paulo que variou de 3% a 12,4% (Figliuolo et al. 2004, Cardoso et al. 2008, Langoni et al. 2011, Machado et al. 2011), com exceção do de Paiz et al. (2015) que utilizando ovinos de abatedouro obteve 52,6% (90/170) de positivos. Desses levantamentos, somente de Figliuolo et al. (2004) utilizaram ponto de corte de 50, assim como esse estudo, nos demais o ponto foi de 25, aumentando a possibilidade de animais sorologicamente positivos.

A frequência de ovinos soropositivos a T. gondii não foi influenciado pelo sexo, como relatado por outros autores (Ogawa et al. 2003, Souza Neto et al. 2009, Lopes et al. 2010, Guimarães et al. 2015), enquanto para a neosporose, ovelhas apresentaram 9,13 vezes mais chances de estarem infectadas que carneiros, achado esse que não foi relatado em outros estudos (Figliuolo et al. 2004, Romanelli et al. 2007, Ueno et al. 2009). As ovelhas, em geral, são mais expostas as pastagens que podem estar contaminadas com oocistos, enquanto reprodutores, características dos machos do estudo, eram criados em baias individuais ou com baixa lotação, semelhante ao sistema intensivo de criação. Sistema esse, que apresentou redução do risco de infecção ao N. caninum, nas propriedades que o adotavam.

Em relação à raça de ovinos, animais Santa Inês e mestiços foram mais propensos a serem soropositivo para T. gondii. Observou-se que as propriedades que possuíam esses ovinos visavam a produção cárnea, sendo os mesmos mantidos por mais tempo nas pastagens além de demonstrarem um controle sanitário menos rigoroso.

A presença de aprisco diminuiu o risco de animais soropositivos para N. caninum, sendo assim, podemos supor que o pasto seja mais acessível à invasão e eliminação de oocistos por cães em relação ao aprisco que possui portas e em alguns casos, como os de chão ripados, são suspensos, dificultando o acesso, corroborando com o resultado obtido em relação ao sistema de criação onde o intensivo se mostrou menos susceptível.

Quanto ao tipo de alimento fornecido, a predisposição a infecção ocorreu em relação ao T. gondii, onde ovinos que receberam exclusivamente pastagem ou associado a alimentos concentrados apresentaram maior risco quando comparado aos que se alimentavam de silagem e concentrado, que pode ocorrer devido a maior exposição aos oocistos no ambiente e no local de armazenamento (Zedda et al. 2010), corroborando com Moura et al. (2015) que avaliou ovinos exclusivamente a pasto e suplementados e Lopes et al. (2010) com dieta a pasto, concentrado e feno. O fornecimento de alimento concentrado em cocho comum para animais jovens e adultos também pode influenciar uma maior disseminação no rebanho (Pinheiro Júnior et al. 2009). Deve-se ter atenção quanto ao fornecimento de sal mineral onde os rebanhos que não recebem tal suplemento obtiveram uma maior ocorrência de ovinos soropositivos (Romanelli et al. 2007, Lopes et al. 2010) variável que não foi pesquisada nesse estudo.

O presente estudo, assim como Guimarães et al. (2015) e Moura et al. (2015), não detectou correlação entre a presença de gatos nas propriedades e o aumentado do risco de infecção por T. gondii, como foi relatado por outros autores (Ogawa et al. 2003, Souza Neto et al. 2009, Brandão et al. 2009, Soares et al. 2009, Lopes et al. 2010). Cenci-Goga et al. (2013) relataram que os gatos residentes na fazenda não estariam correlacionados com ovinos soropositivos para T. gondii, e sim a presença de gatos errantes nas nascentes de água com o aumento do risco de infecção em 1,54 vezes. A presença de aves aumentou o risco de infecção por T. gondii em 2,49 vezes, onde a criação desses animais possa ser um atrativo para que gatos errantes adentrem as propriedades em busca de alimento contaminando, assim, as instalações. Fernandes et al. (2016) encontraram alta ocorrência de aves soropositivas (40,6%) em criadouros da região metropolitana de Recife, onde nesses havia a presença de gatos, possíveis responsáveis pela contaminação do ambiente. A não observação da relação da presença de caninos e a infecção por Neospora caninum pode se dar devido a importância da transmissão vertical tanto em fêmeas infectadas antes e/ou durante a gestação (Syed-Hussain et al. 2015).

Propriedades que adotam exclusivamente a monta natural com manejo reprodutivo apresentaram um risco de infecção a T. gondii que foi 2,8 vezes maior em comparação com aqueles que também empregam alguma biotecnologia; sendo isso reflexo de um controle sanitário mais rígido nessas propriedades que são mais tecnificadas. No entanto, deve-se ater a presença do parasita em amostras de sêmen (Moraes et al. 2010) uma vez que se mantêm viável mesmo após o processo de envase e congelamento, servindo de via de infecção a fêmeas (Consalter et al. 2017).

Com relação aos sinais clínicos registados no exame ginecológico, nenhum deles foi correlacionada com a infecção por T. gondii ou N. caninum. Dubey & Kirkbride (1989), relataram que, no caso de infecção natural, ovelhas geralmente não apresentam sintomas clínicos, exceto na ocorrência rara de retenção de placenta. Esta correlação não foi observada no presente estudo, pois os três animais que apresentaram retenção de placenta eram soronegativos para toxoplasma assim como para neospora.

Não foi observado, nesse estudo, a associação de ovinos soropositivos para T. gondii com quadros de abortamento, assim como relatado por Pereira et al. (2012) em relação a distúrbios reprodutivos em rebanhos da Zona da Mata e Agreste Pernambucano. Os abortamentos, no caso da toxoplasmose, estão mais relacionados a ovelhas onde a primo-infecção ocorre durante a gestação, sendo que sua consequência irá depender do período gestacional. A instalação do parasita no seu início poderá levar a morte e absorção fetal, no terço médio, ao aborto, principalmente até o septuagésimo dia de gestação e no terço final, geralmente resulta no nascimento de cordeiros viáveis e saudáveis, infectados ou não, devido a capacidade do organismo responder imunologicamente ao parasita (Miller et al. 1982, Buxton & Henderson 1999). No entanto em rebanho de ovinos da raça Charolês foi observado quadros de transmissão congênita e sucessivos abortos em ovelhas soropositivas demonstrando a necessidade de maiores estudos quanto as cepas infectantes, sensibilidade de raças e imunidade relacionado a infecção por T. gondii (Morley et al. 2008).

A toxoplasmose destaca-se em estudos de distúrbios reprodutivos em ovinos, como na Itália, onde o seu agente foi o mais detectado pela PCR entre 292 amostras fetais e 76 de placentas (Masala et al. 2007) e na Espanha onde foi detectado em 23,1% (40/176) das amostras de fetos abortados (Pereira-Bueno et al. 2004). Em rebanhos nacionais, T. gondii foi responsável por surto de abortamento e natimortalidae em rebanho de Minas Gerais (Gabardo et al. 2013) e diagnosticado através da imunoistoquímica em amostras de fetos abortados em terço final de gestação em ovinos da raça Sulfock criados no Rio Grande do Sul (Motta et al. 2008). Em propriedades do estado do Maranhão, que possuíam histórico de aborto, a presença de T. gondii foi 2,89 vezes maior em comparação com fazendas que faltam tais antecedentes (Brandão et al. 2009).

Notou-se fator de proteção quanto a repetição de estro e animais soropositivos a T. gondii, provavelmente devido desenvolvimento de imunidade duradoura e protetora para re-infecções, após a fase aguda, tornando rara a repetição de quadros de distúrbios reprodutivos (Beverley & Watson 1971, Dubey & Kirkbride 1989). Santos et al. (2016), em ovelhas Santa Inês primo-infectadas experimentalmente antes da prenhez e durante diferentes estágios gestacionais, apesar de nenhum caso de aborto, observaram distúrbios em cordeiros como; alterações locomotoras, malformações, natimortalidade e debilidade, indicando que nem sempre ocorra proteção do feto contra T. gondii nas reinfecções.

No presente trabalho, a infecção por N. caninum demonstrou diminuir o risco de aborto nas ovelhas, já em estudo de rebanhos de São Paulo, Machado et al. (2011) observaram relação entre ovinos soropositivos e a presença de distúrbios reprodutivos. Dubey & Lindsay (1990) relataram que ovinos infectados experimentalmente aos dois meses de gestação, apresentaram casos de aborto ou absorção fetal, corroborando com os achados de Arranz-Solís et al. (2015) em ovelhas experimentalmente infectadas no primeiro e segundo terço de gestação, enquanto as infectadas no terço final apresentaram nascimento de cordeiros viáveis, embora alguns deles nascessem prematuros e fracos.

Pode-se especular que o grupo de ovelhas no estudo, que foi reativo ao parasita, podem ter sido infectadas no período pré gestacional concedendo a esses animais proteção imunológica, após a transformação de taquizoítos em bradizoítos, formando cistos teciduais, mantendo o hospedeiro na fase crônica da infecção na qual é assintomática, entretanto, se no período gestacional ocorrer redução da imunidade, a infecção pode ser reativada e os bradizoítos se transformarem em taquizoítos desenvolvendo a forma aguda da neosporose podendo levar ao abortamento (Buxton et al. 2002). Azevedo Filho et al. (2017) não observaram casos de abortos em treze ovelhas naturalmente infectadas antes da gestação, sendo que os títulos de anticorpos anti-T.gondii obtidos pelo ELISA reduziram de acordo com a proximidade do parto.

As alterações clínicas e distúrbios no trato reprodutivo, em carneiros do estudo, não tiveram relação significante com a soropositividade para os parasitas, corroborando com trabalhos que mostram ausência de alterações, principalmente em epidídimos e testículos, apesar de alguns dados de alterações no ejaculado de animais soropositivos que devem ser mais estudados para que se afirme uma correlação com a infecção (Lopes et al. 2009, Moraes et al. 2010). No entanto tem-se relatado a presença de T. gondii no trato reprodutivo de carneiros em amostras de sêmen, de ovinos infectados experimentalmente (Lopes et al. 2009) e naturalmente (Moraes et al. 2010) e em amostras de epidídimos de ovinos de abatedouro detectado pela PCR (Bezerra et al. 2013).

Uma série de estudos relata que a prevalência de N. caninum entre os rebanhos de ovinos geralmente é menor em comparação com T. gondii. A frequência de animais que foram concomitantemente soropositivas para ambos os agentes é geralmente baixo, Figliuolo et al. (2004) relataram a soropositividade para ambos os organismos em 3,5% de 597 amostras, Romanelli et al. (2007), em 5,2% de 305 amostras, Ueno et al. (2009), em 4,67% de 1.028 amostras e Pandero et al. (2010), em 9% de 177 amostras. No presente estudo, a taxa de animais que eram concomitantemente soropositivos para T. gondii e N. caninum também foi baixa, correspondendo 3,74% dos ovinos.

A não detecção do DNA genômico dos parasitas pela PCR, em nenhum dos quatro fetos abortados, pode ser justificado pelos resultados do estudo que demonstram a não relação desses quadros de abortamento, com animais soropositivos, apresentando ainda uma situação de redução no caso de T. gondii, além de que, das quatro fêmeas que foram encaminhados os fetos abortados, apenas uma foi soropositiva ao T. gondii e nenhuma a N. caninum. Os fetos se encontravam em bom estado de conservação, no entanto não foram encaminhas as suas placentas, amostras essas que aumentam as chances de identificação do agente infeccioso (Pereira et al. 2013). Sendo assim outros agentes etiológicos, falhas de manejos, causas nutricionais, metabólicas e tóxicas podem estar envolvidos nesses casos de abortos (Mobini et al. 2004, Masala et al. 2007).

Conclusões

Toxoplasma gondii esteve mais presente sorologicamente que Neospora caninum em ovinos com histórico de distúrbios reprodutivos.

Apesar de suas semelhanças, por serem parasitas apicomplexos formadores de cistos, diferem em muitos aspectos epidemiológicos relacionados com características da criação como raça e sexo dos ovinos, sistema de criação, tipo de alimentação e manejo reprodutivo que devem ser levadas em consideração, sempre que se objetivar o controle dessas enfermidades causadas por protozoários.

A exposição à pastagem se mostrou fator impotânte na infecção dos ovinos estudados.

Agradecimentos

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo financiamento do estudo e pelas bolsas de estudo concedidas para a realização deste estudo.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Jul 2018

Histórico

• Recebido
  07 Jun 2017
• Aceito
  21 Jun 2017