Esteatose hepática altera acúmulo celular em tilápias do Nilo durante aerocistite infecciosa

Hepatic steatosis alters cellular recruitment during induced aerocystitis in Nile tilapia

RESUMO:

O presente estudo avaliou a hepatotoxicidade induzida pelo CCl₄ durante o efeito glicocorticoide da dexametasona (DEX) na fisiopatologia da reação inflamatória aguda em tilápias do Nilo, Oreochromis niloticus, correlacionando a funcionalidade hepática à cinética de acúmulo celular em aerocistite infecciosa. Para tal, utilizou-se 84 tilápias do Nilo distribuídas em 4 tratamentos: controle, CCl₄, DEX e CCl₄+DEX. Sendo amostrados 7 animais por tratamento em três períodos, isto é: seis, 24 e 48h após indução de inflamação. Utilizou-se CCl₄ em dose única de 0,5mL/kg, via intraperitoneal para causar o transtorno hepático. Para indução da aerocistite utilizou-se inóculo de Aeromonas hydrophila. A dexametasona foi administrada via intramuscular na dose de 2 mg/kg de peso vivo. Os resultados revelaram que quanto maior foi à atividade sérica de aspartato aminotransferase (AST) maior foi a alteração somática do fígado, sendo estes achados inversamente proporcionais ao acúmulo celular no foco inflamatório, demonstrando menor número de células inflamatórias nos animais acometidos com maior grau de distúrbios hepáticos induzidos pelo CCl_4. O estudo histopatológico revelou alterações degenerativas transitórias na fase mais aguda, pois os fígados das tilápias revelaram o acúmulo lipídeos nos hepatócitos 6h após administração de CCl₄, sendo esta degeneração gordurosa não mais observada nos tempos de 24 e 48h. Contudo, a administração de CCl₄ em tilápias do Nilo resultou em degeneração hepática aguda e transitória, caracterizada pelo acúmulo de gordura nos hepatócitos, aumento de AST no sangue e hepatomegalia. Com a disfunção hepática houve comprometimento do recrutamento celular em aerocistite infecciosa, indicando que há participação do fígado na resposta imune inata em peixes.

TERMOS DE INDEXAÇÃO:
Esteatose hepática; tilápias; aerocistite infecciosa; peixe ciclídeo; tetracloreto de carbono; esteatose; inflamação aguda; glicocorticoide

ABSTRACT:

The study evaluated the hepatotoxicity induced by CCl₄ during the glucocorticoid effect of dexamethasone (DEX) on the pathophysiology of the acute inflammatory reaction in Nile tilapia, Oreochromis niloticus, correlating hepatic functionality with cellular accumulation kinetics in infectious aerocystitis. Eighty- four Nile tilapia were distributed into four treatments: control, CCl₄, DEX and CCl₄ + DEX. Seven tilapia were sampled per treatment in three periods: 6, 24 and 48h after induction of inflammation. CCl₄ was used in a single dose of 0.5mL/kg intraperitoneally to cause hepatic disorder. Aeromonas hydrophila inoculum was used to induce aerocystitis. Dexamethasone was administered intramuscularly at the dose of 2mg/kg b. w. The results revealed a higher serum aspartate transaminase (AST) activity associated with greater somatic liver alteration, being these findings inversely proportional to the cellular accumulation in the inflammatory focus, demonstrating a lower number of inflammatory cells in the animals affected with a higher degree of hepatic disorders induced by CCl₄. The histopathological study revealed transient degenerative changes in the most acute phase, as livers of tilapia showed accumulation of lipids in hepatocytes 6 hours after administration of CCl₄, and this fatty degeneration was no longer observed in 24 and 48h. However, administration of CCl₄ in Nile tilapia resulted in acute and transient liver degeneration, characterized by accumulation of fat in hepatocytes, increased AST in the blood and hepatomegaly. With liver dysfunction there was compromise of cellular recruitment in infectious aerocystitis, indicating that there is liver involvement in the innate immune response in tilapia.

INDEX TERMS:
Hepatic steatosis; aerocystitis; tilapia; cichlid fish; carbon tetrachloride; acute inflammation; glucocorticoid

Introdução

Diversos produtos químicos naturais e sintéticos provenientes das atividades domésticas, agrícolas e industriais são despejados sem tratamento prévio contaminando os ambientes aquáticos (Fernandes Neto & Ferreira 2007). Além disso, complementa-se o uso indiscriminado de antiparasitários, antifúngicos, antibióticos para controle e prevenção de enfermidades em plantéis aquícolas. Estes compostos podem atuar como xenobióticos para os organismos aquáticos, compromentendo a saúde dos animais e a funcionalidade de órgãos como o fígado (Cabello 2006, Maradonna et al. 2015). Em sistemas de criação intensiva tem se observado o agravamento destas condições mórbidas, pois o arraçoamento com balanceamento nutricional inadequado pode causar desequilíbrio no metabolismo energético dos peixes, resultando em acúmulo de lipidios no citoplasma dos hepatócitos, evoluindo para alterações severas de degeneração gordurosa, também chamada de esteatose (Li et al. 2014, Zhang et al. 2014).

Estes comprometimentos na fisiologia hepática dos peixes, associados às condições de estresse em sistemas de criação intensiva, provocam depleção da imunocompetência dos animais, favorecendo o surto de enfermidades por agentes etiológicos oportunistas (Belo et al. 2005, 2014). O fígado exerce papel biológico importante no sistema imume, apresentando células de defesa residentes como linfócitos natural killers (NK) e células de Kupffer, além de participar da modulação da produção de proteinas reagentes da fase aguda (Gabay & Kushner 1999), cujas concentrações sofrem significativas variações quando em contato com lipopolissacarideos bacterianos-LPS (Cray et al. 2010), assim mostrando-se como um importante sítio de regulação do sistema imune inato durante processos infecciosos e inflamatórios. No entanto, muitas destas funções não estão bem definidas em peixes teleósteos (Castro et al. 2014a, 2014b).

Modelos experimentais clássicos em mamíferos buscam avaliar a evolução fisiopatológica da esteatose, dentre estes se destaca o uso do tetracloreto de carbono, CCl₄, que atua como agente hepatotóxico seletivo por induzir estresse oxidativo, resultado da liberação do radical triclorometil (CCl₃-), o qual é subsequentemente convertido em um radical peroxil na presença do oxigênio, iniciando a peroxidação de fosfolipídios da membrana citoplasmática, promovendo mudanças funcionais e morfológicas por acúmulos de produtos derivados deste processo oxidativo, causando severas injúrias nos tecidos hepáticos (Belo et al. 2009). Jia et al. (2014) determinaram o mecanismo de ação deste composto orgânico em Cyprinus carpio pela ativação da enzima citocromo P450 2E1 para formação de radicais livres altamente reativos no fígado da carpa, resultando em estresse oxidativo e peroxidação lipídica. De acordo com estes autores, o estresse oxidativo também desencadeou a liberação de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e o aumento do nível de receptor do tipo Toll 4 (TRL4), que por sua vez ativa factor nuclear kappa B (NF-κ B), permitindo a translocação nuclear e consequente expressão de enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e interleucinas-1β, -6 e 12. Todos estes mecanismos levam ao comprometimento da função hepática com inflamação, esteatose, apoptose e necrose hepatocelular.

A dexametasona é um anti-inflamatório esteroidal, com ação imunossupressora uma vez que seu efeito resulta em linfopenia e leva a inibição da produção de várias citocinas, sendo cerca de vinte e cinco vezes mais potente que o cortisol (Parfitt et al. 1999), esteróide endógeno que em peixes teleósteos exerce efeitos glicocorticoides e mineralocorticóides (Belo et al. 2012a), participando da regulação do equilíbrio hidromineral, do metabolismo energético, além de suprimir o sistema imunológico e a capacidade reprodutiva dos animais (Bonga 1997).

Considerando a importância dos xenobióticos em ecossistemas aquáticos e o impacto destes compostos na saúde e bem estar dos peixes, o presente estudo avaliou a hepatotoxicidade induzida pelo CCl₄ durante o efeito glicocorticóide da dexametasona na fisiopatologia da reação inflamatória aguda em tilápias do Nilo, Oreochromis niloticus, associado a funcionalidade hepática à cinética de acúmulo celular ao efeito em aerocistite infecciosa.

Material e Métodos

Peixe e acondicionamento. Para a realização deste estudo foram utilizadas 84 tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus), linhagem Gift, masculinizadas, com peso médio de 130 g ± 25 g, oriundos da mesma desova, acondicionadas em 12 tanques com 1000L de água cada em sistema de fluxo continuo. No período de aclimatação e durante o estudo manteve-se o fotoperíodo de 12 horas e o arraçoamento foi realizado duas vezes ao dia, 07:30 e 18:30h com ração Socil Laguna^® 28%.

Os parâmetros de qualidade da água foram examinados diariamente às 7:00 da manhã e às 6:00 da tarde (sonda portátil de pH com condutivímetro, modelo YSI-63 e oxímetro modelo YSI-55, Yellow Springs,Ohio/EUA) e apresentaram os seguintes intervalos de valores: temperatura (25,6±1,8 ºC), pH (6,6±0,4), oxigênio dissolvido (5,3±0,5mg/L), condutividade elétrica (89,8±12,3mS/cm).

Os protocolos de pesquisa e tratamento dos animais foram de acordo com os princípios e recomendações do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Estadual Paulista (Unesp), Campus de Jaboticabal/SP, com processo nº 01040/13.

Anestesia. Para todas as manipulações, os peixes foram anestesiados por imersão em solução aquosa de benzocaína na proporção de 1:10.000 para tratamento e desafio e 1:500 para eutanásia (Manrique et al. 2015).

Delineamento experimental. Os peixes foram distribuídos aleatoriamente em 12 caixas com capacidade de 1000L de água cada, constituindo dois grupos: peixes que não receberam CCl₄ e peixes que receberam CCl₄. Estes grupos por sua vez receberam dois tipos de tratamentos: não tratados com dexametasona e tratados com dexametasona. Sendo amostrados sete animais por tratamento em três períodos, isto é: seis, 24 e 48 horas após indução da aerocistite infecciosa, para a avaliação da resposta no tempo, constituindo 12 grupos experimentais.

Indução da esteatose hepática. Para indução da esteatose hepática, utilizou-se CCl₄ (Merck^®) em dose única de 0,5mL/kg, homogeneizado com azeite de oliva na proporção de 1:1, v:v, administrado por via intraperitoneal adaptado de Belo et al. (2012b). No grupo sem tratamento com CCl₄ houve à aplicação somente do azeite de oliva em mesmo volume e local para padronização do estímulo de manipulação.

Para visualização de acúmulo de lipídeos, fragmentos de fígado foram fixados em formol acrescido de cálcio, congelados em nitrogênio líquido e cortados em micrótomo criostático e assim submetidos a coloração de Sudan Black.

Indução do processo inflamatório. Para a indução do processo inflamatório utilizou-se inóculo da bactéria Aeromonas hydrophila na concentração de 6 X10⁶ (Bozzo et al. 2007). O inóculo bacteriano foi identificado por sequenciamento genético (Sebastião et al. 2015). Neste sentido, foi injetado 1 mL do inóculo de Aeromonas hydrophila a 1cm do final do opérculo, à altura da linha lateral, com auxílio de agulha e seringa estéril de 1mL, para atingir a bexiga natatória anterior no mesmo momento da indução da esteatose.

Administração de dexametasona. A administração da dexametasona (Cortvet^®) também foi realizada no momento da indução da esteatose nos grupos correspondentes, via intramuscular na região dorso-lateral esquerdo na concentração de 0,2% na dose de 2mg/kg de peso vivo, segundo Viana (2007).

Os demais grupos foram submetidos à aplicação de solução fisiológica estéril em mesmo local e volume administração de dexametasona para padronização do estímulo de manipulação.

Avaliação do recrutamento celular na bexiga natatória. Para a avaliação do recrutamento de células totais na bexiga natatória, nos tempos pré-estabelecidos de 6, 24 e 48h foi injetado 1mL de solução tampão fosfato salina, contendo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 0,09%, à esquerda do final do opérculo, à altura da linha lateral, com auxílio de agulha e seringa estéril de 1mL para atingir a bexiga natatória anterior seguindo protocolo descrito por Reque et al. (2010). Em seguida, realizou-se a necropsia com secção da bexiga natatória, e então recolhimento do volume total do exsudato com uma micropipeta. O volume recolhido foi centrifugado a 1000rpm por cinco minutos em centrífuga clínica. O sobrenadante foi desprezado, o sedimento total ressuspendido com a adição de volume conhecido de tampão fosfato. Uma alíquota desse volume foi transferida para câmara de Neubauer para contagem das células inflamatórias totais em microscopia de luz (Fig. 1). Realizado a contagem de 5 quadrantes correspondente a 0,02μL^-1. Em seguida, multiplicou-se o valor de células encontrado na câmara de Neubauer pelo fator de diluição.

Fig.1.
Fotomicrografia (A) Visualização de alíquota de exsudato em câmara de Neubauer para contagem de células totais em microscopia de luz, obj.40x. (B) Extensão de alíquota de exsudato em lâmina de vidro com presença de células inflamatórias. Rosenfeld, obj.40x.

Bioquímica sérica. Foram colhidas amostras de sangue dos peixes por punção de vaso caudal sem anticoagulante e foram centrifugadas a 5.000rpm por cinco minutos para obtenção de soro em centrifuga de tubos (Modelo Quimis -Q222TM). Utilizou-se o soro para determinação da dosagem bioquímica de AST (aspartato aminotransferase), em analisador bioquímico semi-automático (Modelo LabQuest - BIOPLUS).

Avaliação de índice somático. Realizado a necropsia, com coleta do fígado para determinação do índice somático, através da proporção entre peso do órgão (PO) e peso corporal (PC). Calculado pela fórmula: Índice hepatossomático (IHS) = PO X 100/PC.

Metodologia estatística. Utilizou-se de forma conjunta a estatística multivariada e a univariada. Primeiramente utilizou-se a estatística multivariada por análise de fatores. Para tal, os dados foram padronizados e os autovalores foram extraídos segundo modelo de análise de componentes principais (Hair et al. 2009). Utilizou-se o critério de Kaiser (1958) para identificar novas variáveis latentes. Os valores das associações aceitas foram adotados de acordo com Streiner (2003). O escore fatorial resultante da análise multivariada foi submetido a análise univariada. Para a análise estatística univariada utilizou-se o modelo misto (Liu et al. 2010), aplicando o esquema experimental por parcelas subdivididas (Altman & Krzywinski 2015) em um delineamento inteiramente casualizado: onde os peixes foram aleatorizado em grupo com aplicação de CCl₄ e sem CCl₄ (parcela principal), onde novamente foram aleatorizado para administração de dexametasona (parcela secundaria) e comparando as interações entre tratamento (unidades experimentais) ao longo do tempo 6, 24, 48h (Liu et al. 2010). Para estabelecer a hipótese estatística de homocedásticidade e normalidade dos resíduos padronizados internamente utilizou-se o teste BoxCox (λ=1) e teste Shapiro-Wilk (P>0.05) respectivamente. Empregou-se o teste Tukey (P<0.05) para multicomparações entre as parcelas. Todas as análises estatísticas foram processadas no software SAS^® (Statistical Analysis System), versão 9.3, (SAS 2012) Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV), UNESP/Jaboticabal, São Paulo.

Resultados e Discussão

Durante o estudo todos os parâmetros analisados de qualidade de água permaneceram dentro da faixa de conforto para tilápia (Sipaúba-Tavares 2013). Pela análise multivariada de componentes principais houve a extração de um processo, relacionando o recrutamento celular com propensão direcional oposta as variáveis IHS e AST, as quais apresentaram a mesma propensão de direção, ou seja, quanto maior foi à atividade sérica de AST maior foi a alteração somática do fígado, sendo estes achados inversamente proporcionais ao acúmulo celular no foco inflamatório, demonstrando menor número de células inflamatórias nos animais acometidos com maior grau de distúrbios hepáticos induzidos pelo CCl₄ (Quadro 1).

Quadro 1.
Associação entre as variáveis AST, IHS e recrutamento celular na aerocistite aguda em tilápias do Nilo (n=84) submetidas à administração de CCl₄

Variáveis	Regeneração hepáticac
Aspartato aminotransferase (AST)	-0,70
Índice hepatossomático (IHS)	-0,75
Recrutamento celular na bexiga natatória	0,74
Autovaloresb	1,60
% de variância	53,39

• ^a
  Resultados extraídos pelo método de componentes principais para a análise de fatores no estudo de padrões na multivariada, ^b autovalores ≥1 de acordo com Kaiser (1958), ^c marcação ≥70 segundo Streiner (2003).

A reação inflamatória decorre de vários mecanismos fisiopatológicos, entre estes se destaca a participação dos hepatócitos na regulação da produção proteínas da fase aguda (Gabay & Kushner 1999), as quais apresentam diversas funções na modulação da resposta inflamatória de origem infecciosa ou não (Bayne & Gerwick 2001), como neutralização de microrganismo, impedimento e sinalização de danos tecidual (Jensen et al. 1997). Portanto, havendo comprometimento do hepatócito haverá também alteração na sua funcionalidade e consequente alteração na regulação destas proteínas. Na reação inflamatória ocorre migração celular para o sítio inflamado por diapedese de células recrutadas do compartimento sanguíneo (Sakabe et al. 2013, Manrique et al. 2017, Petrillo et al. 2017), auxiliando o reestabelecimento e reparação tecidual, assim como, no combate de agentes infecciosos (Havixbeck et al. 2016, Bayona et al. 2017) e no controle da hemostasia exercido primordialmente por trombócitos (Ferdous & Scott 2015).

A administração intraperitoneal de CCl₄ resultou em alterações degenerativas transitórias na fase mais aguda (Fig.2), pois os fígados das tilápias revelaram o acúmulo lipídeos nos hepatócitos no tempo de 6 h após administração de CCl₄, sendo esta degeneração gordurosa não mais observada nos tempos de 24 e 48h. Estes achados vão de encontro ao trabalho de Jia et al. (2014), os quais estudaram o efeito do CCl₄ em Cyprinus carpio. Neste sentido, denomina-se o processo resultante da análise multivariada como regeneração hepática (Fig.3), pois ocorreu diminuição da atividade sérica de AST e do IHS das tilápias associado ao aumento do acúmulo celular no foco inflamado nos tempos de 24 e 48h, sugerindo a hipótese de recuperação da funcionalidade hepática. Tais achados corroboram estudos realizados com roedores após administração de CCl₄ nos quais se observou mudanças hepáticas como hepatomegalia, esteatose, inflamação, infiltração celular, dilatação dos sinusóides e da veia centrolobular (Goessling & Sadler 2015). Estas alterações hepáticas na fase mais aguda da intoxicação por este composto orgânico resultaram em aumento significativo do índice somático hepático em ratos Wistar (Belo et al. 2012b). De acordo com Lawrence & Steiner (2017), o aumento da atividade de AST no soro é considerado um marcador sensível para a lesão hepatocelular principalmente quando associado a outros indicadores de lesões hepáticas como a esteatose.

Fig.2.
Fígado de tilápias do Nilo após administração do CCl₄: (A) 6 horas após a administração, (B) 24 horas após a administração, (C) 48 horas após a administração, (D) controle. Hepatócitos com acumulo de lipídeos (seta), veia central (asterisco). Sudan Black, obj.40x. Barra=100μm.

Fig.3.
Processo de regeneração hepática formada por análise de fatores entre tilápias com aerocistite, submetidas a administração de CCl₄ e tratadas com dexametasona. Colchete (^┌┴┐) compara a diferença entre o grupo que recebeu CCl₄ e o que não recebeu CCl₄, letras minúsculas comparam cada grupo ao longo do tempo, letra maiúscula compara a diferença entre os tratamentos. Teste de comparação Tukey com nível de significância P=<0,05. * Significativo, NS=não significativo.

No tempo de 6h ficou evidente o efeito glicocorticoide da dexametasona sobre as alterações hepáticas, pois peixes que receberam CCl₄ e foram tratados com dexametasona não apresentaram o mesmo grau de comprometimento no tecido hepático apresentado por peixes somente intoxicados com CCl₄ (Fig.3). Uma hipótese que justifica estes achados refere-se ao efeito glicocorticoide diminuir a infiltração de células inflamatórias no tecido hepático lesado por CCl₄ fato que amenizou os efeitos deletérios determinados por este composto orgânico. A intoxicação aguda com CCl₄ em roedores revelou aumento de infiltração celular no tecido hepático à ocorrência de esteatose e necrose no tecido hepático (Belo et al. 2012b). Claudiano et al. (2013) demonstraram o efeito glicocorticoide da dexametosona sobre a diminuição significativa de acúmulo celular em foco inflamatório de pacus. Por outro lado, a dexametosa também está relacionada à doença hepática não alcoólica (Woods et al. 2015), promovendo o aumento da biossíntese lipídica no fígado que pode levar a esteatose hepática com seu uso crônico (Mahendran & Devi 2001, D’Souza et al. 2012). No entanto, neste estudo tanto o CCl₄ quanto a dexametasona foram administrados uma única vez e o comprometimento hepático manifestou-se de forma transitória, justificando tais achados. A ação do CCl₄ provoca dano tecidual e consequente resposta inflamatória no fígado com a liberação de mediadores pró-Inflamatórios. Em estudo realizado por Cao et al. (2015), observou-se que IHS apresentou-se extremamente aumentado em carpas (Cyprinus carpio var. Jian) que receberam CCl₄ em relação as carpas do grupo controle. No entanto, o uso de curcumina não se observou este efeito decorrente de seu efeito anti-inflamatório. Também se observou em estudo in vitro com hepatócitos de carpa que um polissacarídeo do cogumelo Ganoderma lucidum apresentou efeito anti-inflamatório por inibição de TNF-a e IL-1β e também por citocinas imunorreguladoras (Liu et al 2015). Neste sentido estes dados corroboram a hipótese de que o efeito anti-inflamatório da dexametosona tenha contribuído para amenizar as alterações hepáticas decorrentes da exposição ao CCL₄.

Conclusões

A intoxicação por CCl₄ em tilápias do Nilo resultou em degeneração hepática aguda e transitória, caracterizada pelo acúmulo de gordura nos hepatócitos, aumento da atividade de AST no sangue e hepatomegalia.

Com a disfunção hepática houve comprometimento do recrutamento celular em aerocistite infecciosa, indicando que há participação do fígado na resposta imune inata das tilápias. Por outro lado, o glicocorticoide dexametasona amenizou o efeito lesivo do CCl₄ no fígado devido sua ação anti-inflamatória.

Contudo, os resultados desta investigação demonstraram a eficácia do modelo experimental clássico com CCl₄ para estudos de hepatotoxicidade em tilápias do Nilo, assim como, a sua viabilidade para estudos com hepatoprotetores que auxiliem a funcionalidade do fígado, permitindo avaliar a participação hepática na modulação de respostas de defesa.

Agradecimentos

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, (FAPESP, 10/09300-9).

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Ago 2018

Histórico

• Recebido
  13 Dez 2017
• Aceito
  21 Dez 2017