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Brazilian Journal of Botany

On-line version ISSN 1806-9959

Rev. bras. Bot. vol. 21 n. 2 São Paulo Aug. 1998

http://dx.doi.org/10.1590/S0100-84041998000200005 

Influência de fontes de nitrogênio sobre o desenvolvimento das gemas axilares de explantes caulinares de Chrysanthemum morifolium Ramat. cultivado in vitro

 

DANIELA DE ARGOLLO MARQUES1, SIMONE LILIANE KIRSZENZAFT SHEPHERD1,2 e OTTO JESU CROCOMO3

 

(recebido em 18/11/96; aceito em 15/12/97)

 

 

ABSTRACT - (Influence of nitrogen sources on in vitro morphogenesis of axillary shoots in stem explants of Chrysanthemum morifolium Ramat.) The effect of different nitrogen sources on the induction and rooting of axillary shoots in Chrysanthemum morifolium was tested. The total nitrogen concentration was maintained constant (60 mM) in all treatments, only the nitrogen source varying. Treatment E1 was a complete MS (Murashige & Skoog 1962) medium. The remaining treatments were: E2 = ammonium; E3 = nitrate; E4 = nitrate+urea (1.65 mM); E5 = nitrate+urea (3.33 mM); E6 = urea; E7 = urea+ glutamine, and E8 = glutamine. No phytohormones were added to the media. In treatment E1, both shoot and root development were promoted. The use of nitrate as the only source of nitrogen (treatment E3) was sufficient to maintain vigorous growth and no significant difference was found in any of the parameters measured when compared with the basic MS medium. The presence of urea promoted root development in Chrysanthemum, especially when used in addition to nitrate (treatments E4 and E5), hereby producing a dense root system. Both glutamine (treatment E7) and ammonium (treatment E2) were inefficient when used as the sole nitrogen source. Both of these sources resulted in a less vigorous plant growth, this being reflected in lower values for all of the parameters measured.

RESUMO - (Influência de fontes de nitrogênio sobre o desenvolvimento das gemas axilares de explantes caulinares de Chrysanthemum morifolium Ramat. cultivado in vitro). Foram testadas diferentes fontes de nitrogênio na indução e enraizamento de brotações axilares de Chrysanthemum morifolium. Manteve-se constante o teor de nitrogênio total (60 mM) em todos os tratamentos realizados, variando-se apenas as fontes nitrogenadas. O tratamento E1 constituiu-se do meio MS (Murashige & Skoog 1962) completo. Os demais tratamentos foram: E2 = amônio; E3 = nitrato; E4 = nitrato+uréia (1,65 mM); E5 = nitrato+uréia (3,33 mM); E6 = uréia; E7 = uréia+glutamina e E8 = glutamina. Em nenhum tratamento foram adicionados fitorreguladores. No tratamento E1 houve um favorecimento de desenvolvimento de plantas de crisântemo in vitro tanto da parte aérea como de raízes. Porém, a utilização apenas de nitrato como única fonte de nitrogênio (tratamento E3) foi suficiente para sustentar o desenvolvimento das plantas, pois, para a maioria dos parâmetros analisados não foi observada diferença significativa em relação às plantas mantidas no meio básico de MS. A presença de uréia no meio de cultura incrementou o desenvolvimento de raízes de crisântemo, principalmente quando utilizada em adição ao nitrato (tratamentos E4 e E5), proporcionando um sistema radicular bastante denso. Quando utilizadas como única fonte de nitrogênio, tanto a glutamina (tratamento E7) como o íon amônio (tratamento E2) não se mostraram eficientes. O resultado do uso das fontes mencionadas foi um baixo desenvolvimento das plantas, como evidenciado pelos baixos valores de crescimento obtidos em todos os parâmetros analisados.

Key words - Chrysanthemum, nitrogen sources, multiplication in vitro

 

 

Introdução

O crisântemo, utilizado como planta ornamental, é uma planta herbácea, anual, pertencente à família das Asteráceas cujas espécies ancestrais se originaram da China há mais de 2000 anos. O crisântemo sempre foi cultivado como planta ornamental, tendo sido introduzido na Europa em 1168 e nos Estados Unidos, em 1820. Esta introdução deu-se primeiramente como planta de jardim e posteriormente como planta de estufa (Horst 1990). O uso comercial do crisântemo mudou radicalmente com a descoberta, de Garner & Allard (1920), de que o fotoperíodo afeta a época de floração e o crescimento das plantas. Observou-se que a maioria das espécies de crisântemo requer dias curtos para florescer. Este conhecimento incrementou sobremaneira a produção desta planta ornamental que passou, então, a ser cultivada em escala mundial com alta produção. Para se ter uma idéia, o Japão, maior produtor mundial, produziu em 1987 cerca de dois bilhões de crisântemos de corte (Horst 1990).

Segundo Horst & Nelson (1975), o principal problema que afeta a produção dessa planta está relacionado à fitossanidade. Sugere-se o uso de ápices caulinares e/ou meristemas em programas de micropropagação para superar o problema de contaminação patogênica dos propágulos (Marques 1996).

No Brasil, a quantidade de crisântemos comercializados vem aumentando muito. Pelos dados da Central de Abastecimento Geral do estado de São Paulo (CEAGESP), o crisântemo de corte ocupa a primeira posição nas vendas de flores (Cacex 1991). Isto justifica a preocupação dos produtores em expandir a produção e melhorar a qualidade desta cultura, o que pode ser conseguido através de técnicas como a micropropagação.

Sabe-se que as fontes de nitrogênio são de grande importância tanto no crescimento quanto na diferenciação de células e tecidos cultivados in vitro. Dados de vários autores, citados por Grattapaglia & Machado (1990), mostram que é a combinação de amônio e nitrato que estimula o crescimento de várias espécies de plantas in vitro. A razão entre estas duas fontes de nitrogênio, para os autores em consideração, parece ser o fator determinante causador deste estímulo.

Entretanto, resultados de roseira (Nash & Davies 1972) e trigo (Bayley et al. 1972) evidenciam que o nitrato é a melhor fonte de nitrogênio, pois pode, como única fonte de nitrogênio, sustentar boa taxa de crescimento nestas culturas. Efeito favorável de nitrato sobre o crescimento longitudinal das raízes e na formação de raízes laterais em Oncidium varicosum também foi observado por Kerbauy (1993). Raab & Terry (1994), quando compararam duas fontes de nitrogênio constataram que quando o nitrogênio era suprido na forma de íon amônio, o crescimento de raízes e de brotos de Beta vulgaris L. foi bem menor do que quando o nitrogênio foi suprido na forma de nitrato. Além disso, altas concentrações do íon amônio podem causar toxidez nos tecidos de muitas espécies vegetais, segundo Brand (1993). Outras formas de nitrogênio reduzido, tais como aminoácidos, uréia, poliaminas e ureídeos, têm estimulado o crescimento de células e tecidos vegetais (Kirby et al. 1987).

O objetivo do presente trabalho foi observar como diversas fontes nitrogenadas influenciam o desenvolvimento de gemas axilares de crisântemos cultivados in vitro. Esta observação servirá como subsídio para o aperfeiçoamento do sistema de micropropagação desta espécie ornamental.

 

Material e métodos

Observou-se o efeito da influência de fontes de nitrogênio sobre o desenvolvimento in vitro das gemas axilares a partir de explantes caulinares assépticos de Chrysanthemum morifolium Ramat., o crisântemo renomado como planta ornamental. Esta espécie agora é conhecida botanicamente como Dendranthema grandiflora (Ramat.) Kitam. (Syn.Chrysanthemum morifolium) a partir da reclassificação de Anderson (1987). É interessante ressaltar que a reclassificação botânica da espécie não alterou a designação popular da mesma, pois continua sendo conhecida mundialmente como "chrysanthemum" (Horst 1990), o nosso crisântemo.

Empregamos nos nossos experimentos o cultivar Amarelo São Paulo. Mudas provenientes de plantas matrizes deste cultivar de C. morifolium foram plantadas em vasos contendo vermiculita e terra argilosa (50% v/v) e mantidas em casa de vegetação do Centro de Biotecnologia Agrícola, Departamento de Química, da Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", Universidade de São Paulo, em Piracicaba, SP, Brasil, com fornecimento de fotoperíodo de oito horas de luz com noite interrompida utilizando "flashes" de luz no meio da noite, condição que resultou em plantas vegetativas. Todo o material vegetal utilizado nos experimentos descritos neste trabalho proveio de um único meristema obtido de uma única planta em estado vegetativo. A partir deste meristema obtiveram-se, in vitro, várias plantas até um número suficiente para o início do experimento propriamente dito. Anteriormente à retirada do meristema foi feita a desinfeção do ápice caulinar da planta envasada, a qual envolveu as seguintes etapas: 1) lavagem em solução de água e detergente neutro comercial TWEEN 20 (0,1% v/v) e enxágüe em água corrente; 2) lavagem em solução comercial de hipoclorito de sódio (20% v/v) mais TWEEN-20 (0,1% v/v) durante 20 minutos sob agitação; 3) lavagem quatro vezes em água deionizada esterilizada. As etapas 2 e 3 foram realizadas no interior de câmara asséptica. Após a assepsia do ápice caulinar, foi aberto e retirado o meristema apical (com cerca de 0,1 mm e mais dois primórdios foliares) o qual foi inoculado em meio MS suplementado com 0,2 mg.l-1 de BA (benziladenina) e com valor de pH ajustado para 5,7. Nestas condições, o meristema se desenvolveu em planta cujas gemas foram, por sua vez, também inoculadas in vitro multiplicando-se assim o material original no meio 2: MS + 0,4 mg.l-1 de BAP. Este meio foi empregado unicamente para multiplicação em larga escala visando obter plantas in vitro para início do experimento com diferentes fontes de nitrogênio.Para a obtenção de explantes propriamente ditos, não foram consideradas as partes apicais e basais de cada eixo caulinar. Assim, a origem dos explantes foi a parte central da região caulinar, medindo aproximadamente 1 cm de comprimento e contendo uma gema e uma folha. Estes explantes excisados sob condições assépticas foram transferidos para os vários meios de cultura (figura 1).

 

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Figura 1. Esquema de obtenção de explantes. a) Planta matriz mantida vegetativamente em fotoperíodo de oito horas de luz diária com noite interrompida através de "flashes" de luz; b) Meristema apical acrescido de dois primórdios foliares inoculados em meio 1: MS + 0,2 mg.l-1 de BAP; c) Gemas axilares de explantes caulinares inoculadas em Meio 2: MS + 0,4 mg.l-1 de BAP. Este meio foi empregado unicamente para multiplicação em larga escala visando obter-se plantas in vitro para início do experimento propriamente dito com fontes de nitrogênio; d) Origem dos explantes utilizados no experimento com fontes de nitrogênio: parte central da região caulinar medindo aproximadamente 1 cm de comprimento e contendo uma gema e uma folha.

 

A partir desta obtenção dos explantes caulinares, instalou-se o experimento principal nas dependências do Departamento de Fisiologia Vegetal do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas, experimento este que constou de oito tratamentos de inoculação dos explantes caulinares em vários meios.

O tratamento E1 consistiu da inoculação dos explantes caulinares em meio MS básico (Murashige & Skoog 1962). Nos demais tratamentos, alteraram-se as fontes de nitrogênio em relação ao meio MS original, com a ressalva que todos os demais nutrientes essenciais (que não o nitrogênio) permaneceram exatamente nas mesmas concentrações encontradas no meio MS original. Em nenhum tratamento adicionaram-se fitorrreguladores. Os tratamentos utilizados foram: E1 = NH4+ + NO3-; E2 = NH4+; E3 = NO3-; E4 = NO3- + 100 mg.l-1 de uréia; E5 = NO3- + 200 mg.l-1 de uréia; E6 = uréia; E7 = uréia + glutamina ; E8 = glutamina.

Todos os tratamentos foram devidamente balanceados de forma a manter constante o teor de nitrogênio total equivalente ao contido originalmente no meio MS (60 mM), variando-se somente a fonte de nitrogênio e não a sua quantidade (tabela 1), sem haver deficiência de outros macronutrientes como o potássio, por exemplo, fornecido através de KCl. Foram feitas 20 repetições por tratamento num delineamento inteiramente casualizado. Aos 35 dias após a instalação do experimento coletaram-se, aleatoriamente, 10 amostras para análise comparativa dos seguintes parâmetros: massa de matéria fresca e seca, altura do eixo caulinar principal, número de folhas e número e comprimento das raízes. As 10 amostras restantes foram analisadas aos 70 dias, levando-se em conta os mesmos parâmetros, além de um parâmetro extra: determinação do nitrogênio total (NT). Para tanto, utilizou-se a matéria seca das partes aéreas das gemas brotadas in vitro, material este seco em estufa à 80ºC durante 48 horas. Os dados do experimento foram submetidos ao teste de Tukey a 5% de significância.

 

Tabela 1. Composição das fontes de nitrogênio nos tratamentos

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*Essa composição foi realizada de forma a manter constante o teor de nitrogênio total do meio original de MS (60 mM) sem haver deficiência de outros macronutrientes como o potássio , por exemplo, fornecido através de KCl.

 

Resultados e Discussão

O meio MS completo (E1) favoreceu o desenvolvimento tanto da parte aérea quanto de raízes de plantas de crisântemo. Pode-se observar que os valores de massas de matéria fresca e seca das plantas foram altos neste tratamento, evidenciando o bom desenvolvimento das mesmas (figura 2). Observa-se que o nitrato, como única fonte de nitrogênio (tratamento E3), também sustentou o desenvolvimento das plantas, tanto aos 35 como aos 70 dias da instalação do experimento. Nesse tratamento E3 foi obtido bom enraizamento (figura 3A e, principalmente, figura 3B), não tendo sido notada diferença estatística em relação às plantas mantidas no meio MS (E1) para todos os parâmetros analisados. Porém, quando adicionou-se uréia ao meio, além do nitrato, (tratamentos E4 e E5) foi observado um número estatisticamente maior de raízes, principalmente aos 70 dias (figura 3B). O comprimento das raízes em presença de uréia e nitrato também foi maior, embora não tenha sido observada diferença significativa em relação ao tratamento E3 (figura 3A). O maior volume de raízes nessas plantas poderia ter um valor adaptativo na fase posterior da micropropagação, ou seja, durante a aclimatação em casa de vegetação.

 

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Figura 2. Comportamento das plantas aos 35 (¨) e 70 (n) dias, mantidas em meios com diferentes fontes de nitrogênio, quanto a: A. massa de matéria fresca; B. massa de matéria seca. Onde, E1 = NH4 + NO3, E2 = NH4, E3 = NO3, E4 = uréia 1 (100 mg.l-1) + NO3 , E5 = uréia 2 (200 mg.l-1) + NO3, E6 = uréia, E7 = uréia + glutamina e E8 = glutamina. Letras distintas indicam diferenças significativas ao nível de 5% (Teste de Tukey). Letras minúsculas comparam massas de matérias fresca e seca aos 35 dias após a instalação do experimento e letras maiúsculas comparam esses parâmetros aos 70 dias.

 

 

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Figura 3. Comportamento das plantas aos 35 (¨) e 70 (n) dias mantidas em meios com diferentes fontes de nitrogênio quanto a: A. comprimento de raízes, B. número de raízes. Onde, E1 = NH4 + NO3, E2 = NH4, E3 = NO3, E4 = uréia 1 (100 mg.l-1) + NO3 , E5 = uréia 2 (200 mg.l-1) + NO3, E6 = uréia, E7 = uréia + glutamina e E8= glutamina. Letras distintas indicam diferenças significativas ao nível de 5% (Teste de Tukey). Letras minúsculas comparam comprimento e número de raízes aos 35 dias após instalação do experimento e letras maiúsculas comparam esses parâmetros aos 70 dias.

 

Em relação à altura do eixo caulinar principal, tanto aos 35 como aos 70 dias, observou-se que a presença de nitrato, tanto isoladamente como em presença de amônio ou uréia (E1, E3, E4 e E5) resultou em médias superiores de altura em relação aos demais tratamentos, sendo que uréia isoladamente e em conjunto com glutamina ou só glutamina resultaram em baixas médias de altura (figura 4A).

 

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Figura 4. Comportamento das plantas aos 35 (¨) e 70 (n) dias mantidas em meios com diferentes fontes de nitrogênio quanto a: A. altura do eixo caulinar principal, B. número de folhas. Onde, E1 = NH4 + NO3, E2 = NH4, E3 = NO3, E4 = uréia 1 (100 mg.l-1) + NO3, E5 = uréia 2 (200 mg.l-1) + NO3, E6 = uréia, E7 = uréia + glutamina e E8 = glutamina. Letras distintas indicam diferenças significativas ao nível de 5% (Teste de Tukey). Letras minúsculas comparam altura do eixo caulinar principal e número de folhas aos 35 dias após instalação do experimento e letras maiúsculas comparam esses parâmetros aos 70 dias.

 

Correlacionando-se os valores obtidos após 70 dias nos vários tratamentos em relação aos parâmetros de enraizamento e de altura da parte aérea, evidencia-se que o maior enraizamento ocorreu em detrimento do desenvolvimento da parte aérea (figuras 3 e 4A). Esse tipo de tendência também foi constatado por Grothge (1992) que também observou maior desenvolvimento das gemas de Eucalyptus grandis, principalmente nos primeiros quinze dias, e um enraizamento superior quando adicionou uréia ao meio de cultura.

Neste trabalho, quando a uréia foi empregada como única fonte de nitrogênio (E6) houve tanto promoção da parte aérea (altura do eixo caulinar principal) como das raízes (tanto em número como em comprimento). Porém, esse desenvolvimento foi inferior àqueles obtidos nos tratamentos onde uréia e nitrato estiveram presentes (E4 e E5). Os meios MS (E1) e com nitrato como fonte isolada de nitrogênio (E3) foram os que apresentaram maior número de folhas, embora não tenha sido observada diferença estatística significativa entre as plantas mantidas em E3 e aquelas mantidas em meios com uréia + nitrato (figura 4B).

Os tratamentos nos quais o íon amônio (E2) e a glutamina (E8) foram utilizados como fontes isoladas de nitrogênio, caracterizaram-se por apresentar plantas com pouco desenvolvimento, tanto da parte aérea como das raízes, evidenciado pelos baixos valores obtidos em todos os parâmetros analisados, e também por apresentar folhas pequenas e com manchas amareladas. No tratamento E2 (NH4+), foi observado o fenômeno da vitrificação na maioria das plantas. Segundo Letouzé & Daguin (apud Brand 1993), a presença de amônio em concentrações altas aumenta a atividade da desidrogenase do glutamato, enzima que converte rapidamente o íon amônio em ácido L-glutâmico pela aminação do ácido alfa-cetoglutárico, havendo também a liberação de íons H+ no meio. Portanto, a presença de amônio no meio induz a um aumento na síntese de aminoácidos e proteínas às expensas do metabolismo dos carboidratos, diminuindo, por exemplo, a síntese de lignina relacionada com o fenômeno da vitrificação. Ziv (1991) e Cuzzuol (1993) também relacionaram elevados níveis de amônio com o fenômeno da vitrificação. Outro fator que certamente contribuiu para o baixo desenvolvimento das plantas no tratamento E2 (NH4+) foi a acidificação do meio provocada pela liberação de íons H+. Segundo Tolley-Henry & Raper (apud Raab & Terry 1994), pH abaixo de 5 faz com que cesse a absorção de muitos nutrientes, inclusive nitrogênio, provocando sintomas característicos de deficiência nutricional, como folhas amareladas. Os dados de nitrogênio total (NT) mostrados na tabela 2 evidenciam que valores mais baixos de nitrogênio ocorreram nos tratamentos que continham uréia + nitrato (E4 e E5) e os que continham apenas nitrato (E3). O tratamento E4 (nitrato + 100 mg.l-1 de uréia) foi o menos eficaz em relação ao teor total de nitrogênio, como mostra a tabela 2. Curiosamente, os tratamentos nos quais foram obtidas plantas mais desenvolvidas, ou seja, tratamentos contendo uréia + nitrato (E4 e E5) e tratamento contendo apenas nitrato (E3), foram aqueles onde o teor de NT foi menor. Ao contrário, quando o meio continha uréia + glutamina (E7), apenas glutamina (E8) e apenas íon amônio (E2), as plantas obtidas foram nitidamente menos desenvolvidas, porém o NT foi mais elevado (tabela 2). O alto teor de NT observado no tratamento E2 (apenas amônio) pode estar relacionado com o aumento de amino-ácidos e proteínas solúveis nas folhas de plantas mantidas em meios com altos teores do íon amônio. Raab & Terry (1994) observaram um aumento de três a quatro vezes na quantidade de proteínas solúveis nas folhas de Beta vulgaris L. nos tratamentos com amônio em relação aos tratamentos com nitrato.

 

Tabela 2. Valores médios de porcentagem de nitrogênio total (% N total da matéria seca) obtidos nos tratamentos com diferentes fontes de nitrogênio, aos 70 dias da instalação do experimento. Letras diferentes representam valores estatisticamente diferentes pelo teste de Tukey ao nível de 5%.

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Apesar das plantas contidas em meios E2 (apenas amônio) apresentarem alto teor de NT e, provavelmente, de proteínas e aminoácidos, essas plantas tiveram um fraco desenvolvimento tanto da parte aérea quanto de raízes (figuras 3 e 4). Esta contradição pode ser explicada, pois a assimilação do íon amônio resulta em depleção de carboidratos pela ação da desidrogenase do glutamato que converte rapidamente alfa-cetoglutarato em glutamina, que é a forma não tóxica das células armazenarem nitrogênio (Raab & Terry 1994).

Uma observação interessante foi em relação à coloração das folhas nos tratamentos onde uréia foi adicionada ao meio de cultura, as quais assumiram um verde intenso classificado, pelo dicionário de cores de Maerz & Paul (1950), como" evergreen". Minocha (1981) observou um aumento no teor de clorofila quando adicionou uréia ao meio de cultura.

Observou-se também nos tratamentos E2 (NH4+) e E8 (glutamina) o aparecimento de coloração vermelha na base dos explantes. Evidências quimiotaxonômicas relacionam o surgimento de coloração avermelhada em plantas da família Asteraceae à presença de flavonóides (Cronquist 1981). O acúmulo de flavonóides é estimulado por vários fatores de estresse ambiental tais como luz ultravioleta (Broetto & Crocomo 1995), alta intensidade luminosa, traumatismos mecânicos, ataque de patógenos e deficiências nutricionais (McClure apud Deikman & Hammer 1995).

Em síntese, o meio básico MS, sem a adição de reguladores de crescimento, favoreceu o desenvolvimento tanto da parte aérea como das raízes de plantas de crisântemo in vitro. Porém, a utilização apenas do nitrato como única fonte de nitrogênio foi suficiente para sustentar o desenvolvimento das plantas, pois, para a maioria dos parâmetros analisados, não foi observada diferença significativa em relação às plantas mantidas no meio básico de MS. A presença de uréia no meio de cultura incrementou o desenvolvimento das raízes de crisântemo, principalmente quando utilizada em adição ao nitrato, proporcionando um sistema radicular bastante denso. Tanto a glutamina como o íon amônio, como fontes isoladas de nitrogênio, não se mostraram eficientes. O resultado do uso dessas fontes foi um pequeno desenvolvimento das plantas, como evidenciado pelos baixos valores de crescimento obtidos em todos os parâmetros analisados.

 

Agradecimentos - Os autores agradecem ao auxílio técnico de Dulce Regina Joaquim, do Departamento de Fisiologia Vegetal, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas. Um dos autores (S.L. Kirszenzaft Shepherd) agradece ao CNPq (Proc. 301614/83-0) pela Bolsa de Pesquisa concedida. 

 

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1. Departamento de Fisiologia Vegetal, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Caixa Postal 6109, 13083-970 Campinas SP, Brasil.

2. Correspondência; e-mail: kirszenz@turing.unicamp.br.

3. Centro de Biotecnologia Agrícola, Departamento de Química, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, USP, Caixa Postal 9, 13418-900 Piracicaba, SP, Brasil.