Histórico de vida de espécimens selvagens e variantes cromáticas de Gracilaria birdiae (Gracilariales, Rhodophyta)

Life history of wild specimens and chromatic variants of Gracilaria sp. (Gracilariales, Rhodophyta) Gracilaria birdiae

Histórico de vida de espécimens selvagens e variantes cromáticas de Gracilaria birdiae (Gracilariales, Rhodophyta)

VIVIANE L. COSTA¹ e ESTELA M. PLASTINO¹, ²

(recebido: 6 de setembro de 2000; aceito: 31 de janeiro de 2001)

ABSTRACT - (Life history of wild specimens and chromatic variants of Gracilaria sp. (Gracilariales, Rhodophyta) Gracilaria birdiae. (Gracilariales, Rhodophyta) is a common red (vm) marine macroalgae in the Northeastern coast of Brazil, which has been extensively harvested for the agar extraction. The aim of this study was to complete the life history of wild-type specimens (red color) and chromatic variants. Two variants were isolated besides the wild-type specimens collected in Paracuru beach, Ceará: i, greenish-brown (me), which was found in the natural population on Paracuru beach; ii, green (vd), which was obtained spontaneously in vitro from a tetrasporophyte branch. The culture conditions for both gametophytes and tetrasporophytes were: 25% von Stosch medium; 14L:10D (light: dark) photoperiod; irradiance of 100 µmol.m^-2.s^-1 and alternating 30 min aeration periods. Green, red and greenish-brown tetrasporophytes as well as green gametophytes were also cultivated in 10L:14D. The life history of Gracilaria sp. has been completed in vitro in 498 (vm), 523 (me) and 861 (vd) days, showing Polysiphonia-type. The tetrasporophytes produced tetraspores only at 10L:14D photoperiod, while green female gametophytes produced cystocarps only at 14L:10D photoperiod. However, the differentiation of verrucosa-type spermatangial conceptacles in green male gametophytes and spermatia liberation occurred in both photoperiods. Red male gametophytes showed henriquesiana-type spermatangial conceptacles and greenish-brown male gametophytes showed verrucosa and henriquesiana-type ones. Specimens of the three colors showed similar habit. Considering one color, specimens showed similar habit too, independently of the reproductive phase. Every tetrasporophytes showed in situ germination of tetraspores.

RESUMO - (Histórico de vida em espécimens selvagens e variantes cromáticas de Gracilaria sp. (Gracilariales, Rhodophyta) Gracilaria sp. (Gracilariales, Rhodophyta) é uma macroalga marinha de coloração vermelha (vm) comum na costa Nordeste do Brasil e amplamente coletada para a extração de ágar. O objetivo deste estudo foi completar o histórico de vida de espécimens selvagens (coloração vermelha) e variantes cromáticas. Duas variantes foram isoladas, além dos espécimens selvagens coletados na praia de Paracuru, Ceará: i, marrom-esverdeada (me), encontrada em uma população natural da praia de Paracuru; e ii, verde (vd), obtida espontaneamente in vitro a partir de um ramo tetrasporofítico. As condições gerais de cultivo tanto para gametófitos quanto para tetrasporófitos foram: meio de cultura von Stosch 25%; fotoperíodo 14L:10E (luz: escuro); irradiância 100 µm.m^-2.s^-1 e aeração a cada 30 min. Tetrasporófitos das três colorações e gametófitos verdes foram cultivados também em 10L:14E. O histórico de vida foi completado in vitro em 498 (vm), 523 (me) e 861 (vd) dias, mostrando-se do tipo Polysiphonia. Tetrasporófitos produziram tetrásporos apenas em fotoperíodo 10L:14E. Gametófitos femininos verdes desenvolveram cistocarpos apenas em fotoperíodo 14L:10E. No entanto, a diferenciação de conceptáculos do tipo verrucosa em gametófitos masculinos verdes e a liberação de espermácios ocorreu em ambos os fotoperíodos. Gametófitos masculinos vermelhos apresentaram conceptáculos espermatangiais do tipo henriquesiana, enquanto gametófitos masculinos marrom-esverdeados apresentaram os tipos verrucosa e henriquesiana. Não foram verificadas diferenças quanto ao hábito de espécimens de uma mesma coloração, independentemente do estádio reprodutivo analisado. Verificou-se em todos os tetrasporófitos a germinação de tetrásporos in situ.

Key words: Gracilaria, life history, chromatic variants, reproduction.

Introdução

Devido à importância como principal gênero utilizado na extração de ágar, várias espécies de Gracilaria Greville (Gracilariales, Rhodophyta) têm sido estudadas visando a obtenção de condições ideais de cultivo, bem como a seleção de linhagens mais adequadas à maricultura (Patwary & van der Meer 1982, van der Meer & Patwary 1983, Zhang & van der Meer 1987).

O manejo bem sucedido de uma espécie está condicionado ao conhecimento de sua biologia. Portanto, o histórico de vida tem sido objeto de estudo em muitas espécies de Gracilaria, como G. cervicornis (Turner) J. Agardh (Plastino 1985), G. chilensis Bird, McLachlan & Oliveira (Plastino & Oliveira 1988), G. debilis (Forsskål) Børgesen (Oliveira & Plastino 1984), G. domingensis (Kützing) Sonder ex Dickie (Guimarães et al. 1999), G. eucheumoides Harvey (Yamamoto & Noro 1993), G. verrucosa (Hudson) Papenfuss (Ogata et al. 1972), G. mammilaris (Montagne) Howe (Plastino 1985), G. foliifera (McLachlan & Edelstein 1977), G. salicornia (C. Agardh) Dawson (Yamamoto 1991) e Gracilaria spp. (Bird et al. 1977, Oliveira & Plastino 1984).

O histórico de vida para o gênero Gracilaria tem se revelado do tipo Polysiphonia. No entanto, a ocorrência de diferentes estruturas reprodutivas em um mesmo talo vem sendo referida (Oliveira & Plastino 1994). Uma delas é resultante da germinação de tetrásporos in situ, que formam gametófitos epífitas no tetrasporófito (Oliveira & Plastino 1984, Plastino 1985, Destombe et al. 1989, Guimarães et al. 1999). Esses gametófitos geralmente são menores e se tornam férteis precocemente, quando comparados aos gametófitos de mesma idade originados de tetrásporos liberados. Nesse caso, ocorre um encurtamento do tempo necessário para que o histórico de vida seja completado (Oliveira & Plastino 1984, Plastino 1985, Destombe et al. 1989).

A análise do histórico de vida em Gracilaria tem revelado diferenças no tempo necessário para que gametófitos e tetrasporófitos tornem-se férteis. Gametófitos podem se tornar férteis em um tempo menor do que os tetrasporófitos (Yamamoto & Noro 1993), enquanto que o inverso também já foi verificado (Guimarães et al. 1999). No entanto, são referidos casos em que gametófitos e tetrasporófitos atingiram a maturidade reprodutiva com a mesma idade (Bird et al. 1977, McLachlan & Edelstein 1977).

Estratégias reprodutivas distintas quanto à fertilidade de gametófitos e tetrasporófitos frente a fatores sazonais como temperatura e fotoperíodo, já foram referidas para espécies de Gracilaria (McLachlan & Edelstein 1977, Rabanal et al. 1997, Marinho-Soriano et al. 1998). A influência do fotoperíodo na diferenciação de estruturas reprodutivas é amplamente reconhecida para espécies com histórico de vida heteromórfico (Lobban & Harrison 1997). Alguns trabalhos têm demonstrado que este fator também pode atuar na diferenciação de tetrasporângios em espécies com histórico de vida isomórfico (Guiry 1984, Mairh et al. 1990, Fredriksen et al. 1990, Rabanal et al. 1997). Nestes casos, fotoperíodos de dias curtos foram determinantes na diferenciação dos tetrasporângios.

A proporção entre gametófitos femininos e masculinos produzidos a partir da germinação de tetrásporos tem sido reportada como de 1:1 nas espécies de Gracilaria em que estes aspectos foram avaliados (Ogata et al. 1972, van der Meer 1986, Guimarães et al. 1999). A regulação do sexo, em Gracilaria tikvahiae McLachlan, é determinada por um par de alelos mendelianos localizado em um par de cromossomos sexuais. O tetrasporófito é heterozigoto para estes alelos e, portanto, a segregação destes durante a meiose origina gametófitos femininos e masculinos na proporção de 1:1 (van der Meer 1986).

Dentre as espécies que ocorrem no litoral brasileiro, destaca-se Gracilaria sp., referida como Gracilaria sp. 3 por Plastino (1991), e ainda não formalmente descrita. Trata-se de uma espécie de talo cilíndrico e conceptáculos espermatangiais do tipo henriquesiana, comum na costa Nordeste do Brasil. É atualmente um importante recurso explorado comercialmente para a extração de ágar no país (Plastino & Costa 1999).

O presente trabalho tem como objetivo completar o histórico de vida de Gracilaria sp. in vitro, considerando-se espécimens selvagens, de coloração vermelha, bem como variantes cromáticas marrom-esverdeada e verde.

Material e métodos

Seleção de linhagens - Culturas unialgais de Gracilaria sp. foram estabelecidas a partir de tetrásporos liberados por um espécimen de fenótipo selvagem (coloração vermelha) coletado em uma população da região entre marés do município de Paracuru, CE (ca. 3,6^o S), por E.M. Plastino e M. Guimarães em 01/03/1994. Esporos recém liberados foram cultivados em placas de Petri. Após um mês, plântulas derivadas destes esporos foram destacadas e transferidas para frascos cônicos (Plastino et al. 1995). Estas foram então mantidas em cultivo no "Banco de germoplasma de algas gracilarióides" do Laboratório de Algas Marinhas, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo. Nesta ocasião, já era possível a distinção de espécimens de coloração vermelha (vm) e de coloração marrom-esverdeada (me). Espécimens de colorações diferentes foram mantidos em frascos distintos, até a diferenciação de estruturas reprodutivas.

Um espécimen tetrasporofítico mantido no banco de germoplasma e originado a partir do cruzamento entre gametófitos

vm e me diferenciou espontaneamente um ramo de coloração verde. Este foi seccionado, isolado e mantido nas condições gerais de cultivo até a formação de tetrasporângios e tetrásporos. Plântulas originadas da germinação destes tetrásporos apresentaram coloração verde (vd) e foram cultivadas até a diferenciação de estruturas reprodutivas.

Espécimens representativos das linhagens de gametófitos e tetrasporófitos de coloração vermelha, marrom-esverdeada e verde foram incluídos no Herbário Ficológico da Universidade de São Paulo (SPF), sob os números 27.930-33 e 28.049-53.

Condições de cultivo - Os cultivos foram realizados em água do mar com salinidade 32‰, previamente esterilizada e enriquecida com meio von Stosch (Edwards 1970), modificado por Plastino (1985), diluído a 25%. O meio de cultura foi renovado semanalmente. A aeração foi empregada em períodos alternados de 30 minutos. A temperatura foi de 25^oC ± 1, e a irradiância de 100 µmolfótons.m^-2.s^-1 provinda de lâmpadas fluorescentes "Luz do Dia" (Osram 40 W). Estas condições foram previamente estabelecidas para o cultivo de algas gracilarióides de regiões tropicais (Plastino & Oliveira 1989). Os fotoperíodos adotados foram de 14 h luz e 10 h escuro (14L:10E) e 10h luz e 14h escuro (10L:14E) (tabela 1).

Histórico de vida - Carpósporos liberados de cistocarpos formados a partir dos cruzamentos vm X vm, Xme X me e vd X vd foram isolados e cultivados segundo metodologia descrita em Plastino et al. (1995). Ápices de 10 espécimens derivados de carpósporos resultantes dos cruzamentos vm X vm e me X me foram selecionados e submetidos a dois fotoperíodos distintos (tabela 1). Ápices de 20 espécimens derivados do cruzamento vd X vd foram cultivados em dois frascos distintos, contendo 10 espécimens cada um deles. Ramos dos mesmos espécimens foram cultivados em fotoperíodos distintos (tabela 1). Estas condições foram mantidas até a diferenciação de tetrasporângios.

Ramos com tetrasporângios e representativos das três linhagens (vm, me e vd) foram trasferidos para placas de Petri. Tetrásporos derivados destes ramos deram origem a plântulas, que após um mês, foram transferidas para frascos cônicos e cultivadas até a diferenciação de estruturas reprodutivas (Plastino et al. 1995). A análise da proporção sexual de gametófitos foi realizada utilizando-se o teste de Qui-quadrado (x²).

Observações sobre o desenvolvimento morfológico e reprodutivo dos espécimens foram realizadas semanalmente. A documentação das estruturas reprodutivas foi feita através de fotografias. Espécimens herborizados representativos de gametófitos e tetrasporófitos foram digitalizados com o auxílio de um Scanner TCE S520, com resolução gráfica de 100 dpi. e incluídos no presente trabalho.

Resultados

Gracilaria birdae apresentou histórico de vida do tipo Polysiphonia (figura 1). Este foi completado em: 498 dias para espécimens vm, 523 dias para variantes cromáticas me, e 861 dias para variantes cromáticas vd.

Gametófitos femininos e masculinos, independente da coloração que apresentavam, foram obtidos na proporção de 1:1 (16: 20, c² = 0,444, p < 0,05), permanecendo inférteis 45% dos espécimens derivados de tetrásporos.

Gametófitos masculinos vm produziram conceptáculos espermatangiais do tipo henriquesiana (Yamamoto 1984), enquanto que gametófitos masculinos me diferenciaram conceptáculos dos tipos verrucosa e henriquesiana (Yamamoto 1984) (figura 2). Gametófitos masculinos vd, cultivados tanto em fotoperíodo 10L:14E quanto em 14L:10E, produziram conceptáculos do tipo verrucosa.

Gametófitos femininos, independentemente da coloração, formaram cistocarpos apenas na presença de gametófitos masculinos. Espécimens vd somente diferenciaram cistocarpos quando cultivados em fotoperíodo 14L:10E.

Cistocarpos maduros, independentemente da coloração, apresentaram uma célula de fusão basal extremamente ramificada e carposporófito preenchendo todo o espaço interno do cistocarpo, com ampla superfície de contato entre o mesmo e a base do cistocarpo (figura 3).

Grupos de carpósporos foram liberados envolvidos em uma massa de mucilagem, proporcionando, em muitos casos, sua coalescência durante a germinação. Carpósporos isolados desenvolveram-se inicialmente em pequenos discos basais que, aos 20 dias de idade, formaram um, ou mais raramente, vários eixos eretos cilíndricos. Plântulas de cerca de 10 mm de comprimento desprenderam-se do substrato em que germinaram e tiveram seu apressório convertido de uma forma discoidal para uma forma esférica.

Apenas espécimens derivados de carpósporos e cultivados em fotoperíodo 10L:14E diferenciaram tetrasporângios, independentemente da coloração. Os tetrásporos estavam arranjados de forma cruciada no tetrasporângio. Tetrásporos liberados não se fixaram ao substrato e morreram após alguns dias. No entanto, verificou-se germinação

in situ. Inicialmente, diferenciaram-se estruturas de forma esférica ou tetraédrica salientes ao talo (

figura 4), que ao se desenvolverem originaram vários ramos eretos (

figura 5). Estes ramos enquanto permaneceram presos ao tetrasporófito não diferenciaram estruturas reprodutivas. Apenas ramos destacados do talo tetrasporofítico diferenciaram espermatângios ou cistocarpos.

A progênie resultante dos cruzamentos entre gametófitos de uma mesma coloração de talo apresentou a coloração parental. Espécimens derivados de carpósporos (tetrasporófitos) de diferentes colorações diferenciaram tetrasporângios em períodos distintos após a germinação (tabela 2). O mesmo ocorreu para espécimens originados da germinação de tetrásporos (gametófitos) (tabela 2). A diferenciação de espermatângios em gametófitos vd e conseqüente liberação de espermácios tiveram início quando estes apresentavam 294 dias após a germinação de tetrásporos. Entretanto, a diferenciação de cistocarpos ocorreu somente quando os gametófitos já apresentavam 574 dias de idade, embora estes estivessem continuamente em contato com gametófitos masculinos férteis. Muitos destes gametófitos permaneceram inférteis após este período (tabela 2).

O hábito de gametófitos e tetrasporófitos herborizados está apresentado na figura 6. Distingue-se apenas um eixo principal cilíndrico, raramente dois ou mais, com ramificações de até segunda ordem, raramente terceira ordem, tanto para gametófitos quanto para tetrasporófitos.

Discussão

O histórico de vida de Gracilaria birdae foi completado in vitro para espécimens de colorações vermelha, marrom-esverdeada e verde, sendo do tipo "Polysiphonia", como reportado para outras espécies do gênero (Kain & Destombe 1995).

A observação de estruturas esféricas ou tetraédricas nos primeiros estádios da germinação de tetrásporos in situ é inédita entre as algas gracilarióides e parece resultar da germinação dos quatro tetrásporos ainda dentro do tetrasporângio. Descrições dos estádios iniciais da germinação de gametófitos in situ não são comuns na literatura (Oliveira & Plastino 1984).

A germinação de tetrásporos in situ é considerada uma estratégia na redução do tempo necessário para a espécie completar seu histórico de vida (Oliveira & Plastino 1984, Plastino 1985, Destombe et al. 1989). No entanto, para Gracilaria sp., apesar da ocorrência de germinação in situ, esta estratégia não foi confirmada, uma vez que apenas gametófitos destacados do talo tetrasporofítico diferenciaram estruturas reprodutivas.

O tempo necessário para que o histórico de vida fosse completado nas três linhagens foi superior ao verificado para outras espécies de Gracilaria (McLachlan & Edelstein 1977, Oliveira & Plastino 1984, Plastino 1985, Yamamoto 1991, Guimarães et al. 1999) e pode ter sido decorrência de características intrínsecas da espécie estudada, bem como das metodologias de cultivo utilizadas (Oliveira & Plastino 1994). Quanto à maturação reprodutiva, foram observados comportamentos distintos entre as fases do histórico de vida e entre as linhagens estudadas, o que sugere diferenças metabólicas, como já descritas para outras espécies do gênero (Kain & Destombe 1995, Hughes & Otto 1999).

O histórico de vida de espécimens de coloração vermelha foi completado mais rapidamente do que o de variantes marrom-esverdeadas e verdes. Estes resultados podem ter sido decorrência de deficiências metabólicas expressas em menor grau na variante cromática marrom-esverdeada e em maior grau na variante verde. Sabe-se que, para alguns mutantes verdes de Gracilaria tikvahiae, ocorre deficiência pigmentar, principalmente quanto ao conteúdo de ficoeritrina, que poderia influenciar a eficiência fotossintética dos mesmos e conseqüentemente comprometer seu desenvolvimento (van der Meer & Bird 1977, van der Meer 1979). Já foi reportado também que as taxas de crescimento e a viabilidade de variantes pigmentares podem ser menores do que as encontradas em linhagens selvagens (van der Meer & Bird 1977, van der Meer 1978). Espécimens verdes de G. sp. poderiam apresentar deficiências metabólicas que retardariam a maturidade reprodutiva de gametófitos, além de impedir o pleno desenvolvimento de conceptáculos espermatangiais e comprometer a diferenciação de cistocarpos (Costa 2000).

Gametófitos femininos vermelhos tiveram maturação reprodutiva retardada, se comparados com a variante marrom-esverdeada. No entanto, tetrasporófitos vermelhos apresentaram maturação reprodutiva mais rápida do que tetrasporófitos marrom-esverdeados e verdes, o que propiciou um menor tempo para que espécimens vermelhos completassem o seu histórico de vida.

Apesar de 45% dos gametófitos permanecerem inférteis, foi possível confirmar a proporção de 1:1 entre gametófitos femininos e masculinos, o que está de acordo com dados verificados para outras espécies de Gracilaria (van der Meer 1986, Guimarães et al. 1999). A ocorrência de gametófitos inférteis em cultivos in vitro já foi referida na literatura (Ogata et al. 1972). No entanto, a freqüência de espécimens inférteis em populações naturais de Gracilaria é geralmente muito baixa (Plastino 1985, Guimarães 1995).

A diferenciação de tetrasporângios em Gracilaria birdiae ocorreu apenas quando os espécimens foram submetidos ao fotoperíodo 10L:14E. Fotoperíodos de dia curto também ocasionaram a diferenciação de tetrasporângios em Gracilariopsis bailinae Zhang & Xia (Rabanal et al. 1997). Por outro lado, a diferenciação de cistocarpos em espécimens de coloração verde ocorreu apenas em fotoperíodo 14L:10E. Entretanto, conceptáculos espermatangiais de espécimens verdes diferenciaram-se e liberaram espermácios tanto em fotoperíodo 14L:10E quanto em 10L:14E.

A influência do fotoperíodo na diferenciação de estruturas reprodutivas, principalmente em algas com histórico de vida heteromórfico, é atribuída à ação do fitocromo (Lobban & Harisson 1997). No entanto, deve-se tomar o devido cuidado de distinguir as respostas ao fotoperíodo daquelas relacionadas à irradiância total recebida pela alga. Como a irradiância empregada nos experimentos foi a mesma nos dois fotoperíodos, pode-se afirmar que os espécimens cultivados em 10L:14E receberam quantidades inferiores de irradiância diária, quando comparados aos cultivados em 14L:10E. Portanto, neste caso, a indução ou não da diferenciação de estruturas reprodutivas poderia ser conseqüência do total de irradiância recebida, e não necessariamente do fotoperíodo. Um outro desenho experimental seria necessário para distinguir estes dois efeitos, como o adotado para Psilothalia dentata (Okamura) Kylin (Ceramiales, Rhodophyta), implicando necessariamente em uma quebra no período escuro (Fredriksen et al. 1990). Neste caso, a diferenciação de tetrasporângios foi induzida por dia curto, mas não foi interrompida por uma quebra no período escuro, descaracterizando uma possível ação do fitocromo. Por outro lado, espécies como Chondracanthus acicularis (Roth) Fredericq (como Gigartina acicularis) possuem respostas quantitativas ao fotoperíodo, atuando o dia longo apenas na redução do tempo necessário para a diferenciação de tetrasporângios (Guiry 1984).

Espécimens utilizados no atual trabalho foram derivados de uma população localizada na região equatorial, que está submetida a um fotoperíodo constante de 12L:12E. Desta forma, respostas legítimas ao fotoperíodo não seriam esperadas. No entanto, é necessário salientar que os espécimens utilizados estavam aclimatados às condições de cultivo in vitro, e que as respostas possivelmente poderiam ser alteradas caso a temperatura, o estado nutricional e/ou a irradiância fossem modificados. A interação entre fatores como temperatura e irradiância é amplamente reconhecida na literatura (Rabanal et al. 1997, Wilson & Critchley 1997).

Espécimens de Gracilaria sp. de coloração vermelha, marrom-esverdeada e verde apresentaram algumas diferenças quanto aos caracteres reprodutivos, que poderiam ser relevantes na definição de critérios taxonômicos na família Gracilariaceae (Costa 2000). A presença de célula de fusão extremamente ramificada é reportada como uma característica do gênero Hydropuntia Montagne. No entanto, este gênero apresenta conceptáculos espermatangiais do tipo henriquesiana, enquanto que conceptáculos do tipo verrucosa são uma característica do gênero Gracilaria (Fredericq & Hommersand 1990). A ocorrência de conceptáculos espermatangiais distintos em espécimens vermelhos e verdes, bem como a ocorrência dos dois tipos em espécimens marrom-esverdeados de Gracilaria sp. são indícios da fragilidade deste caráter como marcador taxonômico, já que estiveram presentes em linhagens cultivadas nas mesmas condições experimentais, não se tratando, no caso, de variações impostas pelo ambiente.

Os resultados obtidos a partir do estudo de variantes cromáticas de Gracilaria sp. realizado em condições controladas de laboratório demonstram que o tipo de conceptáculo espermatangial (verrucosa X henriquesiana), caráter diagnóstico para Gracilaria e Hydropuntia (Fredericq & Hommersand 1990), pode expressar-se na variabilidade de uma única espécie, e em última análise na variabilidade da descendência de um único indivíduo tetrasporofítico.

O presente trabalho demonstra que linhagens geneticamente distintas de Gracilaria sp. comportam-se diferentemente quanto ao tempo necessário para atingir a maturidade reprodutiva. Também confirma a influência de fatores ambientais na diferenciação de estruturas reprodutivas e conseqüentemente no tempo necessário para se completar o histórico de vida. Além disso, reforça a importância da realização de estudos adicionais que visem o reconhecimento e a distinção do efeito destes fatores.

Agradecimentos - à FAPESP pelo auxílio concedido (Proc. 98/11942-1); ao CNPq pelas bolsas de mestrado e de pesquisa concedidas para a primeira e segunda autoras, respectivamente (Proc. 132845/98-9 e 300148/93-3).

2. Autor para correspondência: [e-mail]

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  15 Jul 2002
• Data do Fascículo
  Dez 2001

Histórico

• Aceito
  31 Jan 2001
• Recebido
  06 Set 2000