Germinação in vitro e embriogênese somática a partir de embriões imaturos de canela sassafrás (Ocotea odorifera Mez)

In vitro germination and somatic embryogenesis from immature embryos of "canela sassafrás" (Ocotea odorifera Mez)

Resumos

Embriões zigóticos em diferentes estádios de desenvolvimento foram utilizados para avaliar o potencial de germinação e competência embriogênica in vitro. Frutos coletados entre 15 e 360 dias após a antese foram avaliados em relação ao diâmetro (mm), comprimento (mm) e massa fresca (g). Para avaliar a percentagem de germinação in vitro, embriões zigóticos em diferentes estádios de desenvolvimento foram inoculados em meio de cultura composto de sais minerais de Murashigue & Skoog (MS), ou em meio MS suplementado com 4,4 miM de BAP, sacarose (3%), ágar (0,6%), carvão ativado (0,15%). Para a indução de embriogênese somática, eixos embrionários em diferentes estádios de desenvolvimento foram inoculados em meio de cultura MS, suplementado com 2,4-D (0, 9, 18, 72 e 144 miM), sacarose (3%), ágar (0,6%), carvão ativado (0,15%). O embrião zigótico e o fruto apresentaram pequeno crescimento até 180 dias após a floração, aumentando após esta data até a última coleta (360 dias após a floração). A germinação in vitro foi observada em embriões imaturos coletados a partir dos 240 dias após a floração, com percentagem média de 40%. Na última coleta a percentagem média de germinação foi 80%. Culturas embriogênicas foram induzidas em meio de cultura contendo altas concentrações de 2,4-D (72-144 miM) em eixos embrionários coletados a partir dos 150 dias após a floração. As culturas embriogênicas foram mantidas in vitro em meio de cultura MS desprovido de reguladores de crescimento, pelo processo de embriogênese secundária repetitiva.

Zygotic embryos in different developmental stages were used to study the in vitro germination potential and embryogenic competence. Fruits harvested from 15 to 360 days after the anthesis were measured to the diameter (mm), length (mm) and fresh mass (g). For in vitro germination, zygotic embryos in different developmental stages were inoculated on Murashigue & Skoog (MS) medium or MS medium supplemented with 4.4 muM of BAP, sucrose (3%), agar (0.6%) and activated charcoal (0.15%). For the in vitro somatic embryogenesis induction, embryonic axis in different developmental stages were inoculated on MS culture medium, supplemented with 2,4-D (0, 9, 18, 72 e 144 muM), sucrose (3%), agar (0.6%) and activated charcoal (0.15%). The fruit and zygotic embryo showed some growth up to 180 days after flowering, increasing after this period until the last harvested (360 days after the flowering). The in vitro germination was observed in immature embryos collected 240 days after the flowering, with average of 40%. In the last harvesting the germination average was 80%. Embryogenic cultures were induced on MS culture medium containing high concentrations of 2,4-D (72-144 muM) in embryonic axis collected 150 days after flowering. Embryogenic cultures of O. odorifera were maintained in vitro, on MS culture medium without plant growth regulators, by repetitive secondary embryogenesis.

zygotic embryos; somatic embryogenesis; in vitro germination; woody plant; Lauraceae

Germinação in vitro e embriogênese somática a partir de embriões imaturos de canela sassafrás (Ocotea odorifera Mez)

CLAUDETE SANTA-CATARINA¹, SCHEILA DA CONCEIÇÃO MACIEL¹ e ENIO LUIZ PEDROTTI¹,²

(recebido: 4 de setembro de 2000; aceito: 21 de fevereiro de 2001)

ABSTRACT - (In vitro germination and somatic embryogenesis from immature embryos of "canela sassafrás" (Ocotea odorifera Mez). Zygotic embryos in different developmental stages were used to study the in vitro germination potential and embryogenic competence. Fruits harvested from 15 to 360 days after the anthesis were measured to the diameter (mm), length (mm) and fresh mass (g). For in vitro germination, zygotic embryos in different developmental stages were inoculated on Murashigue & Skoog (MS) medium or MS medium supplemented with 4.4 mM of BAP, sucrose (3%), agar (0.6%) and activated charcoal (0.15%). For the in vitro somatic embryogenesis induction, embryonic axis in different developmental stages were inoculated on MS culture medium, supplemented with 2,4-D (0, 9, 18, 72 e 144 mM), sucrose (3%), agar (0.6%) and activated charcoal (0.15%). The fruit and zygotic embryo showed some growth up to 180 days after flowering, increasing after this period until the last harvested (360 days after the flowering). The in vitro germination was observed in immature embryos collected 240 days after the flowering, with average of 40%. In the last harvesting the germination average was 80%. Embryogenic cultures were induced on MS culture medium containing high concentrations of 2,4-D (72-144 mM) in embryonic axis collected 150 days after flowering. Embryogenic cultures of O. odorifera were maintained in vitro, on MS culture medium without plant growth regulators, by repetitive secondary embryogenesis.

RESUMO - (Germinação in vitro e embriogênese somática a partir de embriões imaturos de canela sassafrás (Ocotea odorifera Mez). Embriões zigóticos em diferentes estádios de desenvolvimento foram utilizados para avaliar o potencial de germinação e competência embriogênica in vitro. Frutos coletados entre 15 e 360 dias após a antese foram avaliados em relação ao diâmetro (mm), comprimento (mm) e massa fresca (g). Para avaliar a percentagem de germinação in vitro, embriões zigóticos em diferentes estádios de desenvolvimento foram inoculados em meio de cultura composto de sais minerais de Murashigue & Skoog (MS), ou em meio MS suplementado com 4,4 mM de BAP, sacarose (3%), ágar (0,6%), carvão ativado (0,15%). Para a indução de embriogênese somática, eixos embrionários em diferentes estádios de desenvolvimento foram inoculados em meio de cultura MS, suplementado com 2,4-D (0, 9, 18, 72 e 144 mM), sacarose (3%), ágar (0,6%), carvão ativado (0,15%). O embrião zigótico e o fruto apresentaram pequeno crescimento até 180 dias após a floração, aumentando após esta data até a última coleta (360 dias após a floração). A germinação in vitro foi observada em embriões imaturos coletados a partir dos 240 dias após a floração, com percentagem média de 40%. Na última coleta a percentagem média de germinação foi 80%. Culturas embriogênicas foram induzidas em meio de cultura contendo altas concentrações de 2,4-D (72-144 mM) em eixos embrionários coletados a partir dos 150 dias após a floração. As culturas embriogênicas foram mantidas in vitro em meio de cultura MS desprovido de reguladores de crescimento, pelo processo de embriogênese secundária repetitiva.

Key words - zygotic embryos, somatic embryogenesis, in vitro germination, woody plant, Lauraceae

Introdução

Ocotea odorifera Mez (canela sassafrás) é uma espécie originária da Mata Atlântica do Brasil, onde foi intensamente explorada nas décadas de 40-70 para a extração do óleo de sassafrás. No estado de Santa Catarina, esse extrativismo caracterizou-se como importante fonte de renda no Alto do Vale do Rio Itajaí, visando principalmente à exportação do óleo, para o uso na indústria alimentar, farmacêutica e agroquímica (Reitz et al. 1978). Em conseqüência disso, ocorreu uma redução na população original que resultou na inclusão dessa arbórea na lista das espécies ameaçadas de extinção (Viana et al. 1999).

A propagação sexual de genótipos da O. odorifera no seu local de ocorrência é dificultada, pois a produção de sementes é irregular e a sua viabilidade é baixa em virtude de ser uma espécie recalcitrante. Além disso, a semente é atacada por insetos e fungos antes e após a maturação fisiológica. Seu alto teor em óleo também provoca a oxidação e deterioração rápida da semente, determinando uma baixa taxa de germinação (Carvalho 1994). Outro fator limitante para a propagação dessa espécie é a baixa resposta à propagação vegetativa convencional por estaquia, que muitas espécies florestais apresentam. Dentre as principais restrições da estaquia para espécies florestais destacam-se a relação inversa da taxa de enraizamento e idade da planta mãe e o reduzido número de estacas que podem ser produzidas por planta (Högberg et al. 1998).

As técnicas da embriogênese somática e da a germinação in vitro podem ser utilizadas para a multiplicação e conservação dessa espécie, à semelhança do que se tem verificado com outras lenhosas (Jain & Ishii 1998). Segundo Ammirato (1983), a embriogênese somática é um processo análogo à embriogênese zigótica em que, uma única célula ou um grupo de células somáticas são precursoras de embriões somáticos. Este sistema é utilizado para a propagação massal de plantas elites, apresentando grande potencial pois possibilita elevadas taxas de multiplicação (Gupta et al. 1993). Para várias espécies florestais, incluindo vários membros da família Lauraceae, como para Laurus nobilis (Canhoto et al. 1999), Persea americana Mill. (Witjaksono et al. 1999) e Ocotea catharinensis (Viana & Mantell 1999), foi possível estabelecer protocolos de indução de embriogênese somática. Porém a indução de culturas embriogênicas depende do genótipo, tipo de explante, estádio de desenvolvimento do explante e da composição do meio de cultivo in vitro (Litz et al. 1998). O estádio de desenvolvimento dos embriões zigóticos utilizados como fonte de explante é fundamental para a expressão de seu potencial morfogenético (Chalupa 1999). A germinação in vitro de embriões zigóticos imaturos e maturos pode ser utilizada para o resgate de embriões em programas de conservação e melhoramento genético, na recuperação de híbridos de cruzamentos incompatíveis e também como fonte de explante para a cultura de tecidos (Zhang & Lespinasse 1991).

O crescimento e o desenvolvimento do embrião zigótico depende da espécie, podendo durar 35 dias em Prunus (Pedrotti et al. 1992) e 140 dias em macieira (Zhang & Lespinasse 1991). Para O. odorifera não foram encontrados trabalhos que demonstrassem a evolução e os estádios de desenvolvimento dos embriões zigóticos em função do tempo.

O objetivo deste trabalho foi quantificar o crescimento do fruto e do embrião zigótico em função do tempo, avaliar o potencial de indução à embriogênese somática e o potencial da germinação in vitro, a partir de embriões zigóticos e eixos embrionários em diferentes estádios de desenvolvimento.

Material e métodos

Embriões zigóticos nos estádios de desenvolvimento de pró-embrião, globular, cotiledonar inicial, cotiledonar intermediário e cotiledonar final, foram excisados de frutos coletados de plantas matrizes de canela sassafrás (Ocotea odorifera Mez) localizadas no município de Taió (SC). As coletas foram iniciadas 15 dias após a plena floração (meados de fevereiro) e a última coleta foi realizada aos 360 dias após a plena floração (final de fevereiro do ano seguinte), totalizando 13 coletas. Os frutos foram submetidos a um processo de desinfestação, em câmara de fluxo laminar, mediante a imersão em etanol 70% (v/v), durante 5 minutos, hipoclorito de sódio 2% (v/v) por 30 minutos, etanol 70% (v/v) por 1 minuto e em seguida de três lavagens com água destilada autoclavada. Para as fases de germinação in vitro e indução da embriogênese somática, os embriões zigóticos e eixos embrionários foram inoculados sobre o meio de cultura composto de sais minerais e vitaminas de MS (Murashigue & Skoog 1962), suplementado com sacarose (3%), carvão ativado (0,15%) e ágar (0,6%). O pH foi ajustado para 5,8 antes da autoclavagem.

Desenvolvimento do fruto e do embrião zigótico - Os frutos e embriões zigóticos foram avaliados em relação ao diâmetro (mm), comprimento (mm) e massa fresca (g) após cada coleta. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado. Cada unidade experimental foi constituída de 10 frutos com 3 repetições.

Germinação in vitro - Embriões zigóticos imaturos em diferentes estádios de desenvolvimento, foram inoculados em meio composto de sais minerais e vitaminas de MS sem reguladores de crescimento ou suplementado com 6-benzilaminopurina (BAP) (4,4 mM) para avaliar o potencial de germinação in vitro (figura 1A). As culturas foram mantidas em sala de crescimento com temperatura de 25 + 1°C, permanecendo durante 5 dias no escuro e posteriormente foram transferidas para sala de crescimento com intensidade luminosa de 40 mmol.s^-1.m² e fotoperíodo de 16 horas. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado. Cada unidade experimental foi constituída de 8 embriões zigóticos com 3 repetições. Dados de percentagem de germinação foram coletados após 50 dias em cultura.

Indução da embriogênese somática - Eixos embrionários imaturos foram inoculados em meio de cultura composto de sais minerais e vitaminas de MS suplementado com ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) (0, 9, 18, 72 e 144 mM) para a indução da embriogênese somática (figura 1B). As culturas foram mantidas no escuro, em sala de crescimento na temperatura de 25 + 1°C. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado. Cada unidade experimental foi constituída de 8 eixos embrionários com 3 repetições. Dados de percentagem de indução embriogenética foram coletados após 90 dias em cultura.

Manutenção das culturas embriogênicas - Culturas embriogênicas induzidas foram transferidas para meio de cultura composto de sais minerais e vitaminas de MS: 1) desprovido de reguladores de crescimento; 2) suplementado com 2,4-D (9 mM) e cinetina (4,6 mM) e 3) suplementado com 2,4-D (72 ou 144 mM). As culturas foram mantidas no escuro, em sala de crescimento na temperatura de 25 + 1°C.

Análise estatística dos dados - Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e ao teste de separação de médias SNK (5%), com auxílio do programa estatístico Stagraphics 7.0. Os dados de percentagem de germinação e de indução de embriogênese somática foram transformados para raiz quadrada de X + 1.

Resultados

Desenvolvimento do fruto e do embrião zigótico - O desenvolvimento do embrião zigótico de O. odorifera foi identificado pelos estádios de pró-embrião, que ocorre no período após a floração (figura 2) até 50 dias; estádio globular, observado em frutos coletados entre 50 até 70 dias após a floração; estádio cotiledonar inicial, observado em frutos com 90 (figura 3) até 150 dias após a floração; estádio cotiledonar intermediário, observado em frutos coletados no período entre 180 e 300 dias após a floração (figura 4) e o estádio cotiledonar final, o qual foi observado em frutos coletados no período entre 330 à 360 dias após a floração (figura 5).

Entre o período da floração até 150 dias após, foi observado um pequeno crescimento do fruto e do embrião para os parâmetros massa fresca (figura 6A), comprimento (figura 6B) e diâmetro (figura 6C). No período entre 180 e 300 dias após a floração foi observado incremento no crescimento do fruto e do embrião zigótico de forma exponencial e, aos 360 dias após a floração, tanto o fruto quanto o embrião atingiram o ponto máximo de crescimento em massa fresca, comprimento e diâmetro, como pode ser observado na figura 6 A, B e C.

Germinação in vitro - A maior percentagem média de germinação in vitro (78,5%) foi obtida com o uso de embriões zigóticos coletados aos 360 dias após a floração, 50 dias após a inoculação (figura 7), diferindo significativamente da percentagem de germinação obtida nas demais coletas. Nas condições estabelecidas, o potencial de germinação in vitro de embriões zigóticos de O. odorifera foi observado somente a partir de 240 dias após a floração, independente do meio de cultura utilizado. A concentração de BAP utilizada (0 ou 4,4 mM) não apresentou, pela análise da variância, diferenças significativas na percentagem de germinação dos embriões zigóticos. O início da germinação, emissão da radícula pelo embrião, ocorreu entre 20 e 30 dias após a introdução no meio de cultura (figura 8). Plântulas com 70 dias em cultura apresentaram uma altura média de 8 cm e com potencial para estudos da morfogênese in vitro.

Indução da embriogênese somática - A adição de 72 ou 144 mM de 2,4-D ao meio de cultura composto de sais minerais e vitaminas de MS apresentaram as maiores percentagens médias de indução com 3,8 e 5,1%, respectivamente, não diferindo estatisticamente entre si (tabela 1). O uso de eixos embrionários coletados em 240 dias após dias a floração revelou a maior percentagem de média de indução de culturas embriogênicas com 6,5%, não diferindo estatisticamente da percentagem média de indução obtida de eixos embrionários coletados em 270 e 300 dias após a floração, com 4,1% (tabela 1). Somente eixos embrionários excisados de frutos coletados a partir de 150 dias após a floração apresentaram potencial de indução embriogenética (figuras 9, 10). Além disso, foram observados altos níveis de contaminação (aproximadamente 40%) dos embriões coletados até 120 dias após a floração e em todas as coletas, foi observado a oxidação dos explantes quando inoculados em meio de cultura (aproximadamente 90-100%).

Manutenção das culturas embriogênicas - A transferência das culturas embriogênicas para meio desprovido de 2,4-D possibilitou a manutenção da competência morfogênica. Nestas condições, foram observadas a indução e multiplicação dos embriões somáticos no estádio globular (figura 11), diretamente sobre o explante transferido, que posteriormente evoluíram para o estádio cotiledonar (figuras 12, 13). Culturas embriogênicas transferidas para o meio de cultura basal suplementado com 2,4-D (9 mM) e cinetina (4,6 mM) apresentaram, visualmente, respostas semelhante àquelas encontradas quando se utilizou o meio de cultura desprovido de reguladores de crescimento. O meio de cultura suplementado com 2,4-D (72 ou 144 mM) induziu a multiplicação de embriões somáticos no estádio globular. No entanto, essas culturas apresentaram, visualmente, maior oxidação quando comparado com os demais meios de cultura testados.

Nos primeiros 20 dias após a transferência das culturas embriogênicas para os meios de cultura testados, foi observado a oxidação dessas. Sobre essas culturas oxidadas foi observada a diferenciação de novos embriões somáticos de forma direta, processo denominado de embriogênese secundária, no período entre 20 e 50 dias após a inoculação. As transferências das culturas embriogênicas para novo meio de cultura foram realizadas após 60 dias em cultivo. Embriões somáticos no estádio globular apresentaram coloração branco creme, enquanto que no estádio cotiledonar eram de coloração branco com tonalidade rosa na borda dos cotilédones.

A transferência de embriões somáticos no estádio cotiledonar para meio de cultura desprovido de reguladores de crescimento, possibilitou o desenvolvimento do meristema radicular e apical (figura 14), quando mantidos por 4 meses em cultura nessas condições.

Discussão

O crescimento do fruto e do embrião zigótico de O. odorifera foi semelhante ao obtido por Murneek (1954). Porém, não foi verificada uma curva típica da proporção entre o crescimento do fruto e do embrião, como foi observado para Prunus, por Pedrotti (1993). Para esta espécie o embrião só se desenvolve rapidamente quando o fruto atinge o máximo volume, enquanto que em O. odorifera, o crescimento do fruto e do embrião são concomitantes e coincidentes quanto aos períodos de baixo e alto incremento em massa fresca. A formação e o desenvolvimento completo do embrião de O. odorifera ocorre num período de 360 dias, período relativamente longo quando comparado aos embriões de outras angiospermas. Em Prunus avium, os embriões zigóticos atingem o tamanho máximo em 35 dias após a floração (Pedrotti 1993). Essa característica pode estar associada à espécie, pois O. odorifera é considerada uma espécie de crescimento lento, o que poderia explicar em parte esse longo período necessário para o desenvolvimento completo do embrião.

A germinação dos embriões zigóticos de O. odorifera foi maior quando esses apresentaram maior crescimento dos cotilédones. Aumentos na percentagem de germinação coincidentes com o maior crescimento do embrião também foram observadas para pessegueiro, por Tukey (1933) e para a cerejeira, por Pedrotti et al. (1992). Esses últimos autores constataram uma maior conexão vascular entre os cotilédones e o eixo embrionário, o que provavelmente melhorou o fluxo de nutrientes e substâncias de crescimento que foram utilizados para a germinação e o crescimento inicial dos eixos embrionários em plântulas. Nessa condição, os embriões zigóticos de O. odorifera embora imaturos, já podem ser coletados e introduzidos in vitro. Entretanto, embriões zigóticos dessa espécie introduzidos in vitro até 180 dias após a floração não germinaram, provavelmente porque os mesmos não haviam acumulado reservas suficientes para continuar seu completo desenvol-vimento no ambiente in vitro. A sacarose foi adicionada ao meio de cultura utilizado para a germinação, como fonte de carbono inicial para os embriões zigóticos de O. odorifera pois, segundo George (1996), a cultura de células, tecidos ou órgãos necessita de uma fonte de carbono visto que as mesmas apresentam um comportamento heterotrófico. Nesse sentido, Bewley & Black (1994) demostraram que as substâncias de reserva acumuladas nos cotilédones, são necessárias para o metabolismo durante o processo de germinação dos embriões. Apesar disso, a composição do meio de cultura utilizado pode não ter fornecido os elementos nutricionais e os reguladores de crescimento necessários para completar o desenvolvimento do embrião

A adição de BAP ao meio de cultura não apresentou efeito significativo sobre a percentagem de germinação in vitro de embriões zigóticos de O. odorifera, apesar de que, alguns reguladores de crescimento vegetal podem ser utilizados com o objetivo de promover a germinação e crescimento das plântulas. Nesse sentido, Zhang & Lespinasse (1991) utilizaram o BAP e obtiveram altas taxas de germinação de embriões de macieira.

Eixos embrionários de O. odorifera produziram culturas embriogênicas quando coletados somente a partir dos 150 dias após a floração e quando inoculados em meio de cultura composto de sais minerais e vitaminas de MS contendo 2,4-D. Em períodos anteriores a esse possivelmente, os tecidos embrionários não possuem competência ou não estão receptivos à indução com 2,4-D, como salienta Tulecke (1987). Além disso, George (1996) salienta que fatores relacionados à condição fisiológica do explante, as caraterísticas da espécie e condições experimentais, como a composição do meio de cultura e atmosfera dos frascos, podem não ter favorecido o estabelecimento da competência e recepção dos sinais para desencadear o processo de diferenciação celular.

Os resultados obtidos com O. odorifera diferem dos obtidos para Tilia cordata (Chalupa 1999). Para essa espécie, os períodos de 5, 6 e 7 semanas após a floração são os melhores períodos de coleta de embriões zigóticos para indução de embriogênese somática, e nessa condição, esses autores obtiveram a proliferação de calos embriogênicos em meio de cultura composto de sais minerais e vitaminas de MS suplementado com 2,4-D. Provavelmente essas diferenças são devidas ao estádio de desenvolvimento dos embriões utilizados. Em O. odorifera, os embriões necessitaram de um período maior para atingirem o estádio de desenvolvimento necessário para tornarem-se responsivos à indução embriogênica. Além disso, em O. odorifera foi observada a indução de culturas embriogênicas somente em meio de cultura contendo altas concentrações de 2,4-D. Esse resultado está de acordo com os obtidos para O. catharinensis, por Moura-Costa et al. (1993).

A embriogênese somática secundária possibilitou a manutenção in vitro das culturas embriogênicas de O. odorifera. Este processo também ocorre em muitos sistemas de embriogênese somática de espécies arbóreas (Raemakers et al. 1999). Em algumas espécies como a Mangifera indica (Litz et al. 1995) e Juglans regia (Tulecke et al. 1995), a capacidade embriogênica pode manter-se mais de 5 e 9 anos, respectivamente, via embriogênese secundária repetitiva. Além disso, em O. odorifera a embriogênese secundária foi mantida pela transferência das culturas em meio de cultura desprovido de reguladores de crescimento vegetal. Resultado semelhante foi obtido em O. catharinensis, por Viana & Mantell (1999).

Os resultados obtidos para O. odorifera são promissores e mostram a viabilidade do uso desta técnica em programas de conservação desta espécie. No entanto, novos trabalhos devem ser realizados no sentido de sincronizar a indução e a expressão da embriogênese somática, controlar a embriogênese secundária, visando aumentar a percentagem de conversão dos embriões somáticos em plantas. Além disso, não é necessário aguardar a maturação completa do embrião zigótico para a germinação in vitro, diminuindo o tempo necessário para a obtenção de plantas quando comparado ao sistema natural.

Agradecimentos - Os autores agradecem ao Sr. Lírio Luiz Dal Vesco e ao Sr. Vanildo Silveira pelas sugestões na redação do manuscrito e ao CNPq pela concessão de bolsas e recursos financeiros

2. Autor para correspondência: [e-mail]

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. Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Dep. de Fitotecnia, Lab. de Morfogênese e Bioquímica Vegetal, Caixa Postal 476, 88040-900. Florianópolis, SC, Brasil.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  04 Jul 2002
• Data do Fascículo
  Dez 2001

Histórico

• Aceito
  21 Fev 2001
• Recebido
  04 Set 2000