Variação sazonal em antioxidantes em folhas de plantas jovens de Caesalpinia echinata Lam. (pau-brasil)

Seasonal variation in antioxidants in leaves of young plants of Caesalpinia echinata Lam. (brazilwood)

Variação sazonal em antioxidantes em folhas de plantas jovens de Caesalpinia echinata Lam. (pau-brasil)¹

Seasonal variation in antioxidants in leaves of young plants of Caesalpinia echinata Lam. (brazilwood)

Patricia BulbovasI, ²; Mirian C.S. Rinaldi^II; Welington B.C. Delitti^I; Marisa Domingos^II

^IUniversidade de São Paulo, Instituto de Biociências, Departamento de Ecologia Geral, Rua do Matão, Travessa 14, 321, 05508-900 São Paulo, SP, Brasil

^IIInstituto de Botânica, Seção de Ecologia, Caixa Postal 4005, 01061970 São Paulo, SP, Brasil

RESUMO

O ambiente urbano pode gerar condições de estresse oxidativo nas plantas, levando à estimulação de antioxidantes como ácido ascórbico (AA), tióis (Ti), peroxidases (POD) e superóxido dismutase (SOD), em diferentes níveis, de acordo com sua capacidade de tolerar tais condições. Este estudo, em sua primeira fase, buscou conhecer o perfil destas defesas em folhas de plantas jovens de C. echinata com diferentes graus de desenvolvimento. Os níveis dos antioxidantes foram similares em todas as folhas analisadas. Em uma segunda fase, tais antioxidantes e a glutationa (GSH) foram avaliados em 130 plantas mantidas em casa de vegetação com monitoramento constante de temperatura, umidade relativa e irradiância, por um período de 18 meses, para estabelecer se variações sazonais nessas defesas ocorrem em resposta a fatores climáticos. Nesse período, os antioxidantes foliares foram analisados a cada três meses. Em geral, a concentração de AA e a atividade da POD foram altas em C. echinata, quando comparadas com as de outras espécies arbóreas tropicais. Houve variações nas defesas ao longo do tempo. A concentração de GSH e a atividade da POD mostraram ser influenciadas por mudanças na temperatura e a SOD foi estimulada em resposta à temperatura e à umidade relativa.

Palavras-chave: ácido ascórbico, Caesalpinia echinata, glutationa, peroxidases, superóxido dismutase, tióis

ABSTRACT

The urban environmental factors generate conditions of oxidative stress in plants. Cellular antioxidants, such as ascorbic acid (AA),thiols (Ti), peroxidases (POD) and superoxide dismutase (SOD) are induced to different levels depending on their capacity to tolerate stressing conditions. In the first part of this study we determined the profile of these defenses in leaves of different ages of young plants of C. echinata. The levels of antioxidants were similar in all leaves analyzed, independently of the age. Secondly, we evaluated the same antioxidants and glutathione (GSH) in 130 young plants kept in a greenhouse with constant monitoring of temperature, relative humidity and irradiance during 18 months, in order to establish the seasonal variations occurring in response to climatic factors. During this period, leaf antioxidants were analyzed every three months. In general, AA concentrations and POD activity in C. echinata were higher than the levels reported for other tropical tree species. Seasonal variations were observed. GSH concentration and POD activity were significantly influenced by temperature and SOD by temperature and humidity.

Key words: ascorbic acid,Caesalpinia echinata, glutathione, peroxidases, superoxide dismutase, thiols

Introdução

A exploração descontrolada do pau-brasil (Caesalpinia echinata Lam., Leguminosae - Caesalpiniodeae), nos primeiros séculos da colonização, contribuiu significativamente para a redução de suas populações naturais. Apesar de seu valor, tanto histórico quanto econômico, na atualidade essa espécie está em perigo de extinção. Uma possível forma de conservação ex situ da espécie seria a expansão do seu uso em ambientes urbanos para fins de arborização e paisagismo, tendo em vista seu potencial ornamental, por apresentar porte elegante, copa arredondada, folhas cor verde-brilhante e flores em cacho amarelo-ouro suavemente perfumadas (Lima et al. 2002, Rocha 2004).

No entanto, tal ação somente será bem sucedida se C. echinata for tolerante ao estresse oxidativo imposto pelas condições do ambiente urbano, que induz, nas células vegetais, a formação de espécies reativas de oxigênio, que podem atacar e modificar quase todas as moléculas orgânicas, resultando em sérios danos às células e aos tecidos. Por outro lado, as plantas podem mobilizar enzimas e substâncias antioxidantes para protegê-las contra o excesso ou a produção inapropriada dessas espécies. Esses compostos antioxidantes interagem entre si formando um sistema de resposta antioxidativa, que pode minimizar as conseqüências do estresse e manter o equilíbrio pró-oxidante/antioxidante (Muggli 1993, Bray et al. 2000).

Nas células vegetais, enzimas como superóxido dismutase (SOD) e peroxidases (POD) e moléculas solúveis em água como ácido ascórbico (AA) e compostos orgânicos contendo grupos sulfidrila (SH), denominados tióis (Ti), são importantes antioxidantes. A glutationa reduzida (GSH), um tripeptídeo formado por glutamato, cisteína e glicina, é geralmente o mais abundante entre os tióis. Todas são substâncias-chave integrantes do ciclo ascorbato-glutationa, o mais estudado sistema antioxidante (Kocsy et al. 2001). A SOD catalisa a dismutação do radical superóxido (O₂^.-), produzindo peróxido de hidrogênio (H₂O₂) (Rank 1997), o qual pode ser eliminado pelas POD (Meloni et al. 2003). O AA, além de eliminar o H₂O₂, também remove O₂^•-, ^•OH (radical hidroxila) e ¹O₂ (oxigênio singleto) e, ainda, inibe reações desencadeadas por espécies reativas de oxigênio e protege os lipídios da membrana (Muggli 1993). A GSH funciona como substrato para a remoção de H₂O₂ pela glutationa peroxidase, convertendo-se para forma oxidada, o que previne a peroxidação dos lipídios e reage com o ^•OH e ¹O₂, protege os grupos SH das enzimas essenciais ao metabolismo da célula, sendo oxidada no lugar destas, e tem o papel importante de regenerar o AA (Foyer et al.1994).

Muitas vezes, plantas expostas à situação estressante do ambiente urbano não apresentam injúrias visíveis, mas seu sistema antioxidante pode ser bastante alterado, de modo que, por meio da quantificação de antioxidantes, pode-se detectar se as condições de temperatura, umidade relativa, irradiância, poluição atmosférica, entre outros, são capazes de agir sobre as plantas (Arndt & Schweizer 1991, Fangmeier et al. 1994). Certamente, alguns fatores de variação devem ser previamente conhecidos para que se tenha certeza da ativação do sistema de respostas antioxidativas em plantas que crescem em ambientes urbanos, pois se sabe que tais defesas variam não somente entre espécies, como também entre plantas da mesma espécie em diferentes estádios de desenvolvimento e entre folhas da mesma planta, em fases distintas de desenvolvimento (Klumpp et al. 2000). Além disso, as espécies também respondem às variações ambientais ao longo das estações do ano (Chaitanya et al. 2002, Kuk et al. 2003, Lee et al. 2004, Rivero et al. 2004, Zhou & Zhao 2004).

Sendo assim, este trabalho buscou, em uma primeira fase, determinar as variações na atividade de SOD e POD, e nas concentrações de AA e de Ti, em folhas de diferentes estádios de desenvolvimento, de plantas jovens de C. echinata e, em uma segunda fase, determinar a variação sazonal intrínseca da espécie no que diz respeito a esses antioxidantes, incluindo glutationa, e verificar se esta poderia ser induzida por condições climáticas, sem a influência da poluição atmosférica. Para tanto, um lote de plantas foi mantido em casa de vegetação com ar filtrado, isento de partículas e gases tóxicos, por um período de 18 meses. Os resultados deste trabalho podem subsidiar estudos sobre perturbações ambientais urbanas em plantas de C. echinata, como por exemplo, as causadas por poluentes atmosféricos, definindo um ponto de comparação para delimitar mudanças nos antioxidantes nestes estudos.

Material e métodos

As plantas de Caesalpinia echinata Lam. utilizadas na primeira fase de experimentos eram provenientes do mesmo lote de produção, tinham a mesma idade (cerca de quatro anos) e, em média, 23 cm de altura e pelo menos quatro folhas no caule principal. Foram cultivadas em sacos de mudas, com terra vegetal disponível comercialmente, irrigadas diariamente e mantidas em viveiro com sombreamento de 50%, na Reserva Biológica e Estação Experimental de Mogi-Guaçu, São Paulo, e trazidas ao Instituto de Botânica, na cidade São Paulo, SP, duas semanas antes do início das análises.

Na fase inicial, a amostragem das folhas com diferentes graus de desenvolvimento foi feita de acordo com sua posição no caule principal, tomando por base seus diferentes nós de crescimento. Estabeleceu-se que a folha mais jovem, no ápice da planta, pertencia ao primeiro nó do caule principal e as demais, com graus de desenvolvimento crescentes, ao segundo nó em diante. Para determinação de cada antioxidante, cinco plantas de C. echinata foram analisadas. Esse ensaio foi realizado em duplicata (ensaios 1 e 2).

Para a segunda fase do estudo, determinaram-se os mesmos antioxidantes, com o acréscimo da glutationa entre os Ti, em plantas jovens de C. echinata mantidas em casa de vegetação com ar filtrado, isento de partículas grossas e finas e de gases, construída na sede do Instituto de Botânica, São Paulo, SP. Para esta fase, cento e trinta mudas de C. echinata, produzidas em tubetes com substrato Plantmax do tipo hortaliça da Eucatex, na Reserva Biológica e Estação Experimental de Mogi-Guaçu, foram transplantadas para vasos plásticos com o mesmo substrato, acrescido de adubação adequada (adubo encapsulado misturado ao substrato e aplicação semanal de solução preparada com adubos foliar e de enraizamento). Em abril de 2002, foram levadas para a casa de vegetação e tinham, em média, dois anos de idade, 24 cm de altura e seis folhas no caule principal. As plantas foram irrigadas por capilaridade, segundo modelo proposto por Arndt & Schweizer (1991), através de barbantes de náilon inseridos na base dos vasos, sendo que uma de suas extremidades ficava em contato com as raízes e a outra metade mergulhada em caixas que serviam como reservatórios de água. Sobre estas caixas foram colocadas telas de arame galvanizado que permitiram apoiar os vasos e mergulhar os barbantes na água. Durante o experimento, as plantas de C. echinata foram adubadas mensalmente. A partir de três meses da transferência para casa de vegetação, quinze plantas foram retiradas trimestralmente: aos 3 meses de experimento: julho/02; 6 meses: outubro/02; 9 meses: janeiro/03; 12 meses: abril/03; 15 meses: julho/03; 18 meses: outubro/03. Desse modo, grupos distintos de plantas permaneceram na casa de vegetação por períodos crescentes de tempo. Nessa fase, foram usadas as folhas que mostraram respostas mais evidentes na etapa inicial acima. Assim, foram usadas folhas do segundo nó para a análise de Ti e GSH, do terceiro nó para AA e SOD, e do quarto nó para POD. Ao longo de todo o período de experimentação, foram tomadas, com um termohigrógrafo, medidas contínuas de temperatura e umidade relativa. O perfil da radiação fotossinteticamente ativa foi estabelecido por meio de medidas descontínuas realizadas em um dia por semana, ao redor das 12:00 h, com radiômetro portátil LiCor Li-185B. Esses dados do ambiente encontram-se sumarizados na tabela 1.

Em todos os ensaios, as coletas foram realizadas no período matutino. Primeiramente foram determinadas as concentrações de AA, de Ti e de GSH. Para a análise dos antioxidantes enzimáticos (SOD e POD), as folhas foram coletadas e congeladas a -40 ºC. Após a coleta do material para análise, o restante das folhas foi retirado, imediatamente pesado e levado para estufa à 60 ºC para obtenção do peso seco. A razão entre peso fresco e peso seco foi utilizada para expressar a concentração ou atividade dos antioxidantes por unidade de massa seca.

Os antioxidantes de folhas de C. echinata foram analisados, conforme descrição abaixo, empregando-se métodos previamente definidos para plantas jovens de árvores nativas da Floresta Atlântica (Domingos et al. 1998, Klumpp et al. 2000) ou amplamente cultivadas no Brasil (Klumpp et al. 1997, Moraes et al. 2002).

Ácido ascórbico (AA) – Folhas frescas (0,2 g) foram homogeneizadas com 12 mL de solução aquosa de etileno diamina ácido tetracético - sal de sódio (EDTA-Na₂) (0,07%) e ácido oxálico (0,5%). O extrato resultante foi centrifugado (40.000 g, 30 min, a 2 ºC). Leituras foram realizadas em espectrofotômetro (l = 520 nm), após o acréscimo 2,5 mL de solução 2,6 diclorofenol-indofenol sal de sódio dihidratado (DCPiP) (0,02%) (primeira leitura) e 0,05 mL de ácido ascórbico 1% ao sobrenadante (segunda leitura). O conteúdo de ácido ascórbico foi estimado a partir da diferença entre o branco e o resultado da diferença dessas leituras (Keller & Schwager 1977).

Tióis (Ti) e glutationa (GSH) – Folhas frescas foram homogeneizadas (0,7 g) com ácido ascórbico 0,15% e centrifugadas (44.000 g, 30 min, a 2 ºC), sendo adicionados 0,2 mL de 3 carboxi-4-nitrofenil disulfeto (DTNB) 0,04% em tampão fosfato (0,02 M pH 7,0), 0,2 mL de tampão fosfato (0,02 M pH 7,0) e 1,3 mL de tampão tris-HCl (pH 8,0) ao extrato resultante. A leitura da absorbância foi realizada em espectrofotômetro em 415 nm. Para a determinação da GSH, na segunda fase deste estudo, os tióis não protéicos foram obtidos a partir destes mesmos extratos, que foram aquecidos em banho-maria a 100 ºC por 5 min e depois centrifugados (44.000 g, 10 min, a 2 ºC), visando à desnaturação e separação das proteínas. Nesses extratos desproteinizados, foi realizada uma leitura como descrita acima e, em seguida, a eles foram adicionados 0,2 mL de DTNB 0,04% em tampão fosfato (0,02 M pH 7,0), 0,2 mL de tampão fosfato (0,02 M pH 7,0) e 1,1 mL de tampão tris-HCl (pH 8,0), 0,3 mL de albumina (1%), 0,01 mL de glioxilase I e 0,09 mL de metil-glioxal (0,1 M), e foram mantidos por 15 min em temperatura ambiente, visando a conversão da glutationa em S-lactonil glutationa. O conteúdo de GSH foi, então, calculado pela diferença entre as concentrações obtidas nos extratos desproteinizados e naqueles incubados com glioxalase I e metil-glioxial (De Kok et al. 1985).

Atividade das peroxidases (POD) – As folhas congeladas (0,3 g) foram homogeneizadas com tampão fosfato (0,1 M, pH 7,0) e polivinilpolipirrolidona (PVPP) 2% e centrifugadas (40.000 g, 30 min, a 2 ºC). Após adição ao sobrenadante de 2 mL de outro tampão fosfato (0,1 M, pH 5,5), 0,3 mL de fenilendiamina (1%) e 0,05 mL de peróxido de hidrogênio (0,3%), conforme descrito por Klumpp et al. (1989), realizouse a leitura da absorbância em espectrofotômetro (l = 485 nm). A absorbância do complexo H₂O₂-POD formado foi medido em dois tempos, dentro de uma faixa linear da curva de reação. O delta da absorbância (DE) foi dividido pelo tempo em que ambas as medidas foram tomadas (aos 2,0 e 3,5 min), indicando a atividade da POD durante a redução do peróxido de hidrogênio.

Atividade da superóxido dismutase (SOD) – As folhas congeladas (0,4 g) foram homogeneizadas com PVPP e solução contendo tampão fosfato (50 mM, pH 7,5), EDTANa₂ 1 mM, NaCl 50 mM e ácido ascórbico 1 mM e centrifugadas (22.000 g, 25 min, a 2 ºC). Ao sobrenadante foram adicionados 0,5 mL de EDTA-Na₂ 0,54 mM, 0,8 mL de tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,0), 0,5 mL de metionina 0,13 m M, 0,5 mL de azul p-nitrotetrazólio (NBT) 0,44 mM e 0,2 mL de riboflavina 1 mM, e a solução resultante foi exposta a luz fluorescente (80 W) por 20 min. Extratos preparados seguindo o mesmo procedimento foram mantidos no escuro. A absorbância da solução foi medida em espectrofotômetro (l = 560 nm) em ambos os tipos de extrato (iluminado e não iluminado) e a diferença entre as duas absorbâncias foi considerada para a determinação da atividade da SOD, que consistiu na inibição da redução do NBT, pela dismutação enzimática do superóxido (Osswald et al. 1992).

Os resultados da primeira fase deste estudo foram analisados estatisticamente através de análise de variância com dois fatores (ensaios e folhas de diferentes nós), para verificar se houve interação entre os fatores e diferenças entre os resultados de cada indicador de estresse obtidos nas folhas provenientes dos diferentes nós. Os resultados da segunda fase deste estudo foram analisados estatisticamente através de análise de variância não paramétrica (Kruskal-Wallis), seguida por testes de comparações múltiplas (teste Dunn ou Student-Newman-Keuls). Também foi realizada análise de componentes principais (ACP), objetivando verificar se o sistema de defesas antioxidantes variou ao longo dos dezoito meses de estudo e indicar os antioxidantes mais importantes para explicar qualitativamente tal variação. Análises de correlação de Pearson foram realizadas para determinar se as variações nos antioxidantes estariam relacionadas às mudanças sazonais na temperatura e umidade relativa do ar.

Resultados

A análise estatística fatorial aplicada aos resultados da primeira fase mostrou que não houve interação entre os fatores ensaio e idade das folhas (p > 0,05), assim como não houve diferença significativa entre os resultados dos indicadores bioquímicos obtidos nas plantas dos dois ensaios utilizados e nas folhas dos diferentes nós, observando-se tendências, que apenas nortearam a escolha das folhas para análises ao longo do experimento realizado na casa de vegetação (figura 1).

Os níveis de AA nas plantas mantidas na casa de vegetação foram significativamente maiores aos 3 meses de experimento e menores aos 9 e 12 meses (figura 2A). A concentração de Ti foi maior aos 12 meses e mais baixo aos 6 e 9 meses (figura 2B). Ao longo dos 18 meses de estudo, houve grande variação na concentração e porcentagem de GSH (figuras 2C, D). Apesar da alta concentração de Ti aos 12 meses, neste mesmo período foi observada a mais baixa concentração de GSH e, consequentemente a menor porcentagem de GSH em relação ao total de Ti. Valores significativamente menores de GSH e de porcentagem de GSH também foram encontrados aos 15 meses. As maiores proporções desta substância em relação aos tióis foram verificadas nos primeiros 6 meses de experimento.

A atividade das POD também variou bastante durante o experimento (figura 2E). A maior atividade foi verificada aos 3 e 12 meses e as menores aos 6, 15 e 18 meses de estudo. Finalmente, a atividade da SOD oscilou menos ao longo do tempo, tendo sido maior aos 12 meses e menor aos 18 meses (figura 2F).

A análise de componentes principais resumiu 67% da variabilidade total dos dados nos dois primeiros eixos, sendo que o eixo 1 responde por 42% dos resultados e o eixo 2 por 25% (figura 3). GSH e porcentagem de GSH apresentaram forte relação com o eixo 1 (r = 0,76 e r = 0,90, respectivamente) e POD e Ti com o eixo 2 (r = -0,67 e r = -0,66, respectivamente). O gráfico também mostra que os períodos de coletas se separam, indicando que a concentração ou atividade dos antioxidantes foram diferentes ao longo dos 18 meses de amostragem e que, dependendo da época de amostragem, cada antioxidante contribuiu mais ou menos para explicar a variação total no sistema antioxidativo. Por exemplo, aos 3, 6, 9 e 18 meses (unidades amostrais situadas do lado positivo do eixo 1), a GSH, tanto em concentração quanto em porcentagem do total de Ti, foi o antioxidante mais importante entre os analisados, e aos 12 e 15 (unidades amostrais situadas do lado negativo do eixo 1), as atividades de POD e de SOD prevaleceram.

A análise de correlação mostrou que a concentração de GSH e a porcentagem de GSH foram relacionadas negativamente com a temperatura. A atividade das enzimas POD e SOD, por outro lado, apresentou relação positiva com a temperatura, e a SOD, adicionalmente, esteve relacionada negativamente com a umidade relativa. As variações nos teores de AA e de Ti, por sua vez, não foram relacionadas significativamente com a sazonalidade em ambos os fatores climáticos (tabela 2).

Discussão

Os resultados obtidos na primeira fase mostraram que os níveis de antioxidantes foram semelhantes em C. echinata, independentemente da idade da folha. Desse modo, as variações sazonais observadas ao longo da exposição das plantas em casa de vegetação, na segunda fase deste estudo (figura 3), não poderiam ser atribuídas ao estádio de desenvolvimento das folhas, podendo-se excluir esta possível interferência na interpretação dos resultados posteriormente obtidos.

As quantidades médias de AA em C. echinata, nas diferentes amostragens (médias entre 4,0-8,0 mg g¹; figuras 1, 2), além de muito conservativas, foram muito altas quando comparadas com as encontradas, utilizando os mesmos métodos analíticos, em outras espécies nativas da Floresta Atlântica ou cultivadas no Brasil (Tibouchina pulchra Cogn., Psidium guajava L. e Psidium cattleyanum Weinw.), expostas em locais poluídos ou não (médias entre 0,31,1 mg g^-1). Por outro lado, essas espécies apresentaram quantidades foliares de Ti (0,84,5 µmol g¹) semelhantes à de C. echinata (0,74,4 µmol g^-1). A atividade da POD, por sua vez, foi geralmente mais alta em C. echinata (103697 DE.min g¹) do que nas referidas espécies (médias entre 27-250 DE.min g ^-1) (Klumpp et al. 1997, Domingos et al. 1998, Klumpp et al. 2000, Moraes et al. 2002).

No entanto, não se pode inferir sobre o grau de tolerância de C. echinata ao estresse oxidativo com base no conteúdo ou na atividade basal dos antioxidantes, como preconizam Bray et al. (2000), devido a restrições metodológicas. O método empregado para análise de AA, por exemplo, não permite diferenciar o composto com função antioxidativa daquele sem tal função (ácido isoascórbico) (Speek et al. 1984). Do mesmo modo, determinou-se a atividade das peroxidases em geral, entre as quais se incluem não somente a ascorbato peroxidase e a guaicol peroxidase, com reconhecida função antioxidativa, como também outras que não têm esta capacidade. Assim, no presente estudo, o perfil dos compostos analisados ao longo do tempo foi considerado um indicador mais adequado da capacidade de C. echinata tolerar o estresse oxidativo do que seus níveis basais. Nesse caso, partiu-se do princípio de que a intensificação das defesas em resposta ao aumento da formação de espécies reativas de oxigênio induzido por fatores ambientais poderia ser percebida por intermédio de mudanças nesse perfil.

As figuras 2 e 3 indicam que as variações nos antioxidantes das plantas de C. echinata não pareceram estar relacionadas ao tempo crescente de exposição ou à idade das plantas. Caso isso fosse evidente, tais figuras apresentariam gradientes de concentração ou atividade dos antioxidantes ao longo do período de exposição. O perfil dos antioxidantes não aponta, igualmente, indícios de aclimatação das plantas às condições de exposição da casa de vegetação, o que seria verificado caso os níveis dos mesmos variassem pouco ao longo das amostragens (Barnes et al. 1999). Assim, as mudanças nos antioxidantes dessas plantas possivelmente aconteceram em função de mudanças sazonais de fatores do ambiente. Conforme indicado pelas análises de correlação (tabela 2), a temperatura foi o fator mais importante, entre os monitorados, a comandar os níveis dos antioxidantes. Nos períodos mais quentes, como o que corresponde ao intervalo entre o 9º e 12º mês, enquanto o nível de GSH, tanto em termos de concentração quanto em termos de proporção do total de Ti, foi baixo, a atividade das enzimas foi alta. O inverso ocorreu nos períodos mais frios, como os correspondentes aos intervalos de tempo entre 3º e 6º mês e entre o 15º e 18º mês (tabela 1; figuras 2, 3).

Estudos realizados por outros autores também já mostraram que a temperatura do ambiente pode causar mudanças na concentração de GSH e na atividade dos antioxidantes enzimáticos em plantas como Morus alba L., sob altas temperaturas, e Zea mays L. e Cucumis sativus L., sob baixas temperaturas (Chaitanya et al. 2002, Lee et al. 2004, Takac 2004).

A SOD, nas plantas de C. echinata, pareceu ser mais influenciada por variações nos fatores ambientais do que os demais antioxidantes estudados, pois apresentou relação significativa com a temperatura e com a umidade relativa (tabela 2). Assim, esta enzima, a primeira a atuar no ciclo ascorbato-glutationa (Bray et al. 2000), pode exercer um papel importante na defesa das plantas jovens de C. echinata contra o estresse oxidativo induzido por fatores ambientais. Resposta semelhante foi observada por Rivero et al. (2004), que verificaram que essa enzima foi a única a ser estimulada em plantas de Lycopersicon esculentum L. cv. Tmknvf (2) expostas à alta temperatura, enquanto POD, catalase e glutationa redutase foram inibidas.

Na verdade, em ambiente natural, as respostas antioxidativas de plantas às variações abióticas são induzidas por mecanismos similares, que resultam em adaptações a épocas mais secas ou mais úmidas, a dias de maior ou menor incidência luminosa, como também a baixas e altas temperaturas. Isso porque todos esses fatores ambientais extremos levam ao aumento das concentrações das espécies reativas de oxigênio, e, consequentemente, estimulam do mesmo modo os antioxidantes (Bray et al. 2000, Kuk et al. 2003). Por exemplo, Zhou & Zhao (2004) verificaram que gramíneas forrageiras que crescem em regiões montanhosas e frias podem produzir grande quantidade de antioxidantes e assim tolerarem um período de condições climáticas extremas. Por outro lado, os antioxidantes podem, também, ser estimulados nessas gramíneas, em períodos favoráveis ao crescimento, quando há aumento na produção de espécies reativas de oxigênio na cadeia de transporte de elétrons dos cloroplastos.

Os resultados obtidos neste estudo permitiram padronizar metodologia de amostragem e de análises de antioxidantes em plantas jovens de C. echinata e caracterizar o perfil dos mesmos para a espécie. A concentração de AA e a atividade da POD foram altas, quando comparadas com as de outras espécies arbóreas tropicais. Verificou-se, ainda, que as variações nos antioxidantes nessas plantas ocorreram em resposta a variações sazonais nos fatores do ambiente monitorados. A concentração de GSH e a atividade da POD variaram significativamente em reposta às mudanças na temperatura. A SOD foi mais sensível às mudanças ambientais.

Agradecimentos – À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo pela bolsa de doutorado concedida à primeira autora (Processo 00/11051-5) e pelo auxílio financeiro (Processo 00/06422-4).

(recebido: 18 de novembro de 2004; aceito: 13 de outubro de 2005)

• ARNDT, U. & SCHWEIZER, B. 1991. The use of bioindicators for environmental monitoring in tropical and subtropical countries. In Biological monitoring. Signals from the environment (H. Ellenberg, ed.). Vieweg, Eschborn, p.199-298.
• BARNES, J., BENDER, J.B., LYONS, T. & BORLAND, A. 1999. Natural and man-made selection for air pollution resistance. Journal of Experimental Botany 50:1423-1435.
• BRAY, E.A., BAILEY-SERRES, J. & WERETILNYK, E. 2000. Responses to abiotic stresses. In Biochemistry & Molecular Biology of Plants (B.B. Buchanan, W. Gruissen, & R.L. Jones, eds.). American Society of Plant Physiologists, New York, p.1158-1203.
• CHAITANYA, K.V., SUNDAR, D., MASILAMANI, S. & REDDY, A.R. 2002. Variation in heat stress-induced antioxidant enzyme activities among three mulberry cultivars. Plant Growth Regulation 36:175-180.
• DE KOK, L.J., BOSMA, W., MAAS, F.M. & KUIPER, P.J.C. 1985. The effect of short-term H₂O fumigation on water-soluble sulphydryl and glutathione levels in spinach. Plant, Cell and Environment 8:189-194.
• DOMINGOS, M., KLUMPP, A. & KLUMPP, G. 1998. Air pollution impact on the Atlantic forest in the Cubatão region, SP, Brazil. Ciência e Cultura 50:230-236.
• FANGMEIER, A., BRUNSCHÖN, S. & JÄGER, H.J. 1994. Time course of oxidant biomarkers in flag leaves of wheat exposed to ozone and drought stress. New Phytologist 126:63-69.
• FOYER, C.H., DESCOURVIÈRES, P. & KUNERT, K.J. 1994. Protection against oxygen radicals: an important defense mechanism studied in transgenic plants. Plant, Cell and Environment 17:507-523.
• KELLER, T. & SCHWAGER, H. 1977. Air pollution and ascorbate. European Journal of Forest Pathology 7:338-350.
• KLUMPP, G., GUDERIAN, R. & KÜPERS, K. 1989. Peroxidase-und Superoxiddismutase- Aktivität sowie Prolingehalte von Fichtennadeln nach Belastung mit O₃, SO₂ und NO₂ European Journal of Forest Pathology 19:84-97.
• KLUMPP, A., KLUMPP, G. & DOMINGOS, M. (resp.) 1997. Vegetation module. In Air pollution and vegetation damage in the tropics - the Serra do Mar as an example - Final report 1990-1996 (D. Klockow, H.T. Targa & W. Vautz, eds). GKSS - Forschungszentrum Geesthacht GmbH, Geesthacht, p.V.1-V.47.
• KLUMPP, G., FURLAN, C.M., DOMINGOS, M. & KLUMPP, A. 2000. Response of stress indicators and growth parameters of Tibouchina pulchra Cogn. exposed to air and soil pollution near the industrial complex of Cubatão, Brazil. The Science of the Total Environment 246:79-91.
• KOCSY, G., GALIBA, G. & BRUNOLD, C. 2001. Role of glutathione in adaptation and signaling during chilling cold acclimation in plants. Physilogia Plantarum 113:158164.
• KUK, Y.I., SHIN, J.S., BURGOS, N.R., HWANG, T.E., HAN, O., CHO, B.H., JUNG, S.Y. & GUH, J.O. 2003. Antioxidative enzymes offer protection from chilling damage in rice plants. Crop Science 43:2109-2117.
• LEE, M.A., CHUN, H.S., KIM, J.W., LEE, H., LEE, D.H. & LEE, C.B. 2004. Changes in antioxidant enzyme activities in detached leaves of cucumber exposed to chilling. Journal of Plant Biology 47:117-123.
• LIMA, H.C., LEWIS, G.P. & BUENO E. 2002. Pau-brasil: uma biografia. In Pau-Brasil (E. Bueno, ed.). Axis Mundi Editora, São Paulo, p.39-76.
• MELONI, D.A., OLIVA, M.A., MARTINEZ, C.A. & CAMBRAIA, J. 2003. Photosynthesis and activity of superoxide dismutase, peroxidase and glutathione reductase in cotton under salt stress. Environmental and Experimental Botany 49:69-76.
• MORAES, R.M., KLUMPP, A., FURLAN, C.M., KLUMPP, G., DOMINGOS, M., RINALDI, M.C.S. & MODESTO, I.F. 2002. Tropical fruit trees as bioindicators of industrial air pollution in southeast Brazil. Environment International 28:367-374.
• MUGGLI, R. 1993. Free radicals tissue damage: the protective role of antioxidant nutrients. In Free radicals and antioxidants in nutrition (F. Corongiu, S. Banni, M.A. Dessi & C. Rice-Evans, eds.). Richelieu Press, London, p.189-250.
• OSSWALD, W.F., KRAUS, R., HIPPELI, S., BENZ, B., VOLPERT, R. & ELSTNER, E.F. 1992. Comparison of the enzymatic actives of dehydroascorbic acid redutase, glutathione redutase, catalase, peroxidase and superoxide dismutase of healthy and damaged spruce needles (Picea abies (L.) Karst). Plant Physiology 139:742-748.
• RANK, B. 1997. Oxidative stress response and photossystem efficiency in trees of urban areas. Photosynthetica 33:467481.
• RIVERO, R.M., RUIZ, J.M. & ROMERO, L. 2004. Oxidative metabolism in tomato plants subjected to heat stress. Journal of Horticultural Science & Biotechnology 79:560-564.
• ROCHA, Y.T. 2004. Ibirapitanga: história, distribuição geográfica e conservação do pau-brasil (Caesalpinia echinata Lam. Leguminosae) do descobrimento à atualidade. Tese de doutorado. Universidade de São Paulo, São Paulo.
• SPEEK, A., SCHRIJVER, J. & SCHREURS, W.H.P. 1984. Fluorometric determination of total vitamin C and total isovitamin C in foodstuffs and beverages by high-performance liquid chromatography with precolumn derivatization. Journal of Agricultural Food Chemistry 32:352-355.
• TAKAC, T. 2004. The relationship of antioxidant enzymes and some physiological parameters in maize during chilling. Plant Soil and Environment 50:27-32.
• ZHOU, R. & ZHAO, H. 2004. Seasonal pattern of antioxidant enzyme system in the roots of perennial forage grasses grown in alpine habitat, related to freezing tolerance. Physiologia Plantarum 121:399-408.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  01 Ago 2006
• Data do Fascículo
  Dez 2005

Histórico

• Recebido
  18 Nov 2004
• Aceito
  13 Out 2005