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Brazilian Journal of Botany

On-line version ISSN 1806-9959

Rev. bras. Bot. vol.31 no.4 São Paulo Oct./Dec. 2008

http://dx.doi.org/10.1590/S0100-84042008000400007 

ARTIGOS

 

Identificação de flavonóides em Hypericum cordatum (Vell.) N. Robson (Clusiaceae)1

 

Identification of flavonoids in Hypericum cordatum (Vell.) N. Robson (Clusiaceae)

 

 

Rodrigo Strohmayer Dourado; Ângela Maria Ladeira2

Instituto de Botânica, Seção de Fisiologia e Bioquímica de Plantas, Caixa Postal 3005, 01061-970 São Paulo, SP, Brasil

 

 


RESUMO

Este trabalho teve como objetivo realizar o fracionamento de extratos metanólicos de caules e folhas de Hypericum cordatum e a identificação de flavonóides. O fracionamento dos extratos foi feito por cromatografia de filtração em resina de Sephadex LH 20, em camada delgada e cromatografia líquida de alta eficiência. Os extratos metanólicos mostraram a presença de vários flavonóides, em especial flavonóis e flavonas. Foram identificados quatro flavonóides: quercetina, quercitrina, rutina e canferol. Os compostos foram identificados pela análise de seus espectros na luz ultravioleta obtidos em CLAE-UV/DAD e por co-cromatografia realizada com os padrões.

Palavras-chave: Cerrado, compostos fenólicos, erva de São João, flavonóides, planta medicinal.


ABSTRACT

The aim of this work was the fractionation of methanolic extracts from stems and leaves of Hypericum cordatum and the identification of flavonoids. The fractionation of methanolic extracts was done using filtration columm in Sephadex LH 20 resin, thin layer and high performance liquid chromatography techniques. Several flavonoids were found in the methanolic extracts, specially flavonols and flavones. Four flavonoids were identified: quercetin, quercitrin, rutin and kaempferol. The identification of these compounds was done by the analyses of the ultraviolet light spectrum obtained in HPLC-UV/DAD and by co-chromatography with standard solutions.

Key words: "Cerrado", flavonoids, medicinal plant, phenolic compounds, Saint John's worth


 

 

Introdução

Hypericum cordatum (Vell.) N. Robson é uma espécie de pequeno porte encontrada no Cerrado das regiões Sudeste e Sul do Brasil, que foi selecionada em uma triagem de plantas com atividade antimicrobiana para estudos fitoquímicos (Biota/Fapesp 98/05074-0). Pertence à família Clusiaceae (Guttiferae), que é formada por 49 gêneros, sendo Hypericum o único a ocorrer efetivamente nas regiões temperadas (Robson 1981, Robson 2006).

O gênero Hypericum vem tendo grande destaque na literatura uma vez que várias ações farmacológicas da espécie européia Hypericum perforatum L. vêm sendo confirmadas (Ozturk et al. 1996, Suzuki et al. 1984, Franklin et al. 1999, Barnes et al. 2001, Zou et al. 2004, Silva et al. 2005, Perfumi et al. 2005). Essa espécie, empregada desde a antiguidade por suas atividades medicinais, é atualmente comercializada como fitoterápico no tratamento de depressão média a moderada (Marques 1999). Entre os principais componentes identificados em H. perforatum destacam-se como princípios ativos a hiperforina (floroglucinol) e hipericina (antraquinona). Segundo Barnes et al. (2001), parece existir uma interação entre o teor desses compostos e o dos flavonóides encontrados na espécie para que atividade antidepressiva seja observada.

Apesar disso, poucas investigações têm identificado flavonóides nas espécies de Hypericum (Calie et al. 1983, Rocha et al. 1996, Barnes et al. 2001). Flavonóides são compostos comuns na natureza, atuando na atração de polinizadores e como co-pigmentos das antocianidinas. Apresentam diversas atividades biológicas, destacando-se as antiinflamatória, antibiótica, antitumoral e antioxidante (Bruneton 1995). Quimicamente são compostos derivados da via do ácido chiquímico-acetato, caracterizados por apresentarem dois núcleos fenólicos ligados por uma cadeia de três carbonos (Harborne 1984).

No Brasil, algumas espécies brasileiras passaram a ser estudadas. Rocha et al. (1994, 1995, 1996), isolaram floroglucinóis, a-pirona, xantonas e ácido betulínico de Hypericum brasiliense Choisy. Abreu et al. (2005) determinaram nessa espécie a distribuição de compostos durante o crescimento da planta, verificando alta concentração de compostos fenólicos na floração e de terpenos na frutificação. Ferraz et al. (2005) verificaram benzopiranos com atividade anti-tumoral em Hypericum polyanthemum Klotzsch ex Reichardt. Fenner et al. (2005) verificaram atividade antifúngica em Hypericum ternum A. St.-Hil. e Viana et al. (2005) verificaram atividade anti-depressiva em Hypericum caprifoliatum Cham. & Schltdl., em função da presença de floroglucinóis que agem no sistema dopaminérgico.

Estudos preliminares realizados com extratos de diferentes partes de Hypericum cordatum indicaram a presença de flavonóides no extrato metanólico, inativo em bioensaios de atividade antifúngica e anti-tumoral (Gallina 1999).

O objetivo do presente trabalho foi realizar o fracionamento dos extratos metanólicos de caules e folhas e a identificação de flavonóides presentes em Hypericum cordatum.

 

Material e métodos

Material vegetal - Hypericum cordatum coletado por Cordeiro; material testemunho Cordeiro 1702 depositado no herbário SP.

Coleta - As plantas foram coletadas em Ibiúna (São Paulo, SP) em campo aberto na beira da estrada, nas proximidades da Rodovia SP-250, Km 63, às margens da Rua Caieiras.

Obtenção do pó de folhas e caules - O material foi seco à sombra. Caules e folhas foram separados e pulverizados em moinho Tecnal TE-625.

Preparo do extrato - Os caules e folhas pulverizados foram submetidos à extração seqüencial com solventes de polaridades crescentes (éter de petróleo, clorofórmio e metanol), conforme metodologia descrita por Rocha et al. (1994). Neste trabalho foram analisados apenas extratos metanólicos. Após concentração em rota-evaporador Büchi, obteve-se 59,67 g do extrato de caule e 63,91 g para o extrato de folha.

Fracionamento dos extratos metanólicos de caule e folha - Foi realizado por cromatografia de filtração em coluna (48,0 cm x 4,5 cm) de Sephadex LH-20. Utilizou-se como eluente metanol e foram coletadas frações de 50 mL (Harborne 1984, Rocha et al. 1994). O fracionamento foi monitorado por cromatografia em camada delgada em placa de sílica, desenvolvida em tolueno: acetato de etila: ácido fórmico (5:4:1) sendo as placas posteriormente reveladas com NPPEG (difenilboriloxietilamina 1,0% em metanol, seguida de solução de polietilenoglicol 4000 5,0% em etanol), reagente para detecção de flavonóides (Wagner & Bladt 2001). As frações que mostraram mobilidade cromatográfica semelhante foram reunidas. As quatro frações que mostraram a presença de flavonóides foram submetidas a novo fracionamento em coluna de Sephadex LH 20, de acordo com a metodologia já descrita.

As novas frações obtidas foram solubilizadas em metanol e submetidas à partição líquido:líquido com tolueno: acetato de etila: ácido fórmico (5:4:1), tendo-se obtido duas fases, a solúvel e a insolúvel nessa mistura de solventes. Tendo em vista a mobilidade das frações solúveis no solvente citado, elas foram submetidas a novos fracionamentos em coluna (40,0 cm x 2,2 cm) de Sephadex LH-20, utilizando-se como eluente metanol. As subfrações obtidas foram monitoradas por cromatografia em camada delgada em placa de sílica no mesmo eluente citado, e reunidas de acordo com a semelhança após revelação com NP-PEG.

As frações insolúveis foram analisadas por cromatografia em camada delgada em cromatoplaca de celulose (Merck) utilizando como eluente butanol: ácido acético: água (3:1:1) e revelação com NP-PEG. Em seguida essas frações insolúveis foram analisadas por eletroforese conforme técnica descrita em Seabra et al. (1991) e Seabra & Alves (1991). Amostras das frações da fase insolúvel (10 mg) solubilizadas em água ácida com TFA 0,1% foram submetidas à hidrólise parcial (com HCl 3,0 N à temperatura ambiente, por 30 minutos) e à hidrólise total (com HCl 3,0 N à 100 ºC por duas horas) O material hidrolisado foi submetido à partição com acetato de etila e a fração aquosa foi neutralizada com cloreto de bário 1,5 g. A eletroforese foi realizada com as frações insolúveis (100 µg) ressuspendidas em H2O com ácido trifluoroacético (TFA) a 0,1%, que foram aplicadas em papel Whatmann 3 mm, de 20,0 cm por 35,0 cm. Utilizou-se tampão (buffer) de pH 2,0 com ácido fórmico: ácido acético: água (3,3 mL: 14,7 mL: 182,0 mL), e uma tensão de 400V por 30, 60 e 90 minutos, em fonte Bio Rad - Power Pac 3000. Após a eletroforese, o papel foi revelado com vapor de amônio para detecção de flavonóides sulfatados.

Posteriormente, as frações solúveis e insolúveis foram analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Para estas análises utilizou-se cromatógrafo Varian equipado com detector na luz ultravioleta (CLAE-UV) e cromatógrafo Dionex equipado com detector de arranjo de diodo (CLAE-UV/DAD). Nas análises nos cromatógrafos Varian e Dionex foram utilizadas colunas analíticas de sílica RP-18, fluxo de 1,0 mL min-1. Foram injetados 20,0 µL das frações na concentração de 5,0 mg mL-1, e a detecção foi feita a 250 e 370 nm.

Utilizou-se dois gradientes diferentes para eluição dos compostos. O gradiente de eluição 1 foi programado com rampa variando de 0 a 5 minutos com água (0,1% TFA): acetonitrila (0,1% TFA) (95:5) (V/V), em seguida água (0,1% TFA): acetonitrila (0,1% TFA) (9:1) (V/V) até 10 minutos, água (0,1% TFA): acetonitrila (0,1% TFA) (8:2) até 20 minutos, água (0,1% TFA): acetonitrila (0,1% TFA) (4:6) (V/V), até 40 minutos, acetonitrila (0,1% TFA) 100% até 43 minutos e posteriormente 100% de metanol até 46 minutos.

O gradiente de eluição 2 foi programado com rampa variando de 0 a 10 minutos com água (0,1% TFA) 100%, em seguida água (0,1% TFA): acetonitrila (0,1% TFA) (8:2) (V/V) até 20 minutos, água (0,1% TFA): acetonitrila (0,1% TFA) (6:4) até 30 minutos, água (0,1% TFA): acetonitrila (0,1% TFA) (4:6) (V/V) até 40 minutos, água (0,1% TFA): acetonitrila (0,1% TFA) (2:8) (V/V) até 50 minutos, acetonitrila (0,1% TFA) (100%) até 60 minutos, acetonitrila (0,1% TFA): metanol (8:2) (V/V) até 70 minutos e finalmente metanol 100% até 80 minutos. Utilizou-se acetonitrila e metanol padrão CLAE (J.T. Baker), Ácido triflouracético (Merck) e os padrões rutina, quercitrina, quercetina e canferol, da Sigma.

 

Resultados e discussão

O fracionamento por cromatografia em coluna dos extratos metanólicos brutos de caules e de folhas produziu oito frações. Destas, apenas as quatro primeiras mostraram presença de flavonóides e foram selecionadas para análises mais detalhadas (figura 1). As análises das cromatografias em camada delgada das subfrações solúveis obtidas dessas frações mostraram flavonas e flavonóis (Tabelas 1 a 5), fato pouco comum nas espécies de Hypericum, de acordo com Calie et al. (1983). Foram então selecionadas para cromatografia líquida de alta eficiência as frações 4.1 (1,8 g) e 4.2 (2,3 g) do extrato de caule, uma vez que mostraram fatores de retenção semelhantes aos de alguns dos padrões de flavonóides, nas análises em cromatografia de camada delgada de sílica.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Inicialmente foram realizadas análises em CLAE-UV da fração 4.1 do extrato de caule, do padrão de canferol, e da fração 4.1 misturada com o padrão (canferol). As análises foram realizadas em dois gradientes de eluentes para comprovação da identificação do canferol na fração. Houve aumento do pico referente ao composto observado no tempo de retenção 21,4 min. quando a mistura foi analisada com o eluente 1 (figura 2), do mesmo modo que para o pico do composto com tempo de retenção 34,0 min. observado nas análises com o eluente 2 (figura 3). Nas análises realizadas em CLAE-UV/DAD foi possível obter os espectros na região do ultravioleta para o composto com tempo de retenção 24,1 min. na fração 4.1 e para o canferol, comprovando assim esse dado (figura 4). Pode-se então concluir que canferol ocorre em Hypericum cordatum.

 

 

 

 

As figuras 5 e 6 apresentam os perfis cromatográficos obtidos nas análises em CLAE-UV da fração 4.2 do extrato de caule, dos padrões de flavonóides (rutina, quercitrina e quercetina) e da mistura da fração 4.2 com padrões de flavonóides.Verificou-se aumento do pico dos compostos com tempo de retenção 17,1; 18,2 e 21,4 min. para o eluente 1 e do pico dos compostos com tempos de retenção 25,9; 27,4 e 31,0 min. para o eluente 2. As figuras 7, 8 e 9 apresentam os espectros na região do ultravioleta dos compostos com tempos de retenção 17,1 min., 18,2 min. e 21,4 min. da fração 4.2 que são semelhantes aos espectros dos padrões de flavonóides rutina, quercitrina e quercetina, respectivamente. A presença de quercetina, quercitrina e rutina, foi também identificada nas frações solúveis 1.3.1 (88,5 mg) e 2.2.3 (19,3 mg) do extrato metanólico de folhas (dados não apresentados).

 

 

 

 

Quercetina e canferol são flavonóides comuns em vegetais. Rutina e quercitrina são flavonóides glicosilados encontrados em um menor número de espécies. Esses quatro flavonóides foram identificados em H. perforatum, que também contém luteolina, hiperosídeo, isoquercitrina, os biflavonóides biapigenina e amentoflavona além de flavonóides associados a taninos condensados como a catequina (Marques 1999, Barnes et al. 2001). A espécie Hypericum brasiliense Choisy possui os mesmos quatro flavonóides identificados em Hypericum cordatum, e compostos fenólicos ocorrem em maior concentração na época da floração (Rocha et al. 1995, Abreu et al. 2005).

As sub-frações insolúveis não saíram da origem das placas de sílica, quando o solvente empregado foi tolueno: acetato de etila: ácido fórmico (5:4:1) e foram arrastadas para o Rf 0.50 nas análises cromatográficas realizadas em butanol: ácido acético: água (3:1:1). Assim sendo cogitou-se a possibilidade de se tratarem de flavonóides sulfatados como a quercetina 3 glucuronide-3'sulfato e a quercetina 3 sulfato, identificadas em três espécies de Hypericum (Seabra & Alves 1991, Seabra et al., 1991). A realização de eletroforese com essas sub-frações insolúveis mostrou que não há compostos sulfatados nessa espécie.

Apesar dos flavonóides apresentarem atividades antimicrobianas e de ter sido comprovada sua ocorrência nos extratos metanólicos de Hypericum cordatum, atividades anti-fúngicas e antibacterianas não foram produzidas por eles (Gallina 1999).

Além disso atividade antidepressiva não foi verificada em estudos farmacológicos feitos com essa espécie e com Hypericum brasiliense (Mendes et al. 2002). Em Hypericum perforatum hiperosídeo e hipericina mostraram atividade anti-depressiva (Luo et al. 2004), e em Hypericum caprifoliatum a atividade anti-depressiva está relacionada a um floroglucinol (Viana et al. 2005). Por outro lado, hipericina não foi detectada em nenhuma espécie brasileira (Abreu et al. 2005, Fenner et al. 2005, Viana et al. 2005). Assim sendo, parece que realmente há necessidade de uma interação entre vários compostos para que atividade anti-depressiva seja produzida por espécies de Hypericum.

No presente trabalho foi obtida a identificação parcial de quatro flavonóides descritos também em outras espécies do gênero. A identificação de outros flavonóides detectados dependerá de novas etapas de purificação dos componentes das frações obtidas, que serão objeto de estudos futuros.

Agradecimentos - Os autores agradecem à Fapesp pelos auxílios concedidos (98/05074-0 e 00/05761-0), à Dra. Luciana Retz de Carvalho pela permissão de utilização do equipamento CLAE-UV/DAD, pertencente à Seção de Ficologia do Instituto de Botânica, e às Dras. Maria Claudia Marx Young e Luce Maria Brandão Torres pelas sugestões dadas durante a realização deste trabalho.

 

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(recebido: 16 de março de 2007; aceito: 29 de agosto de 2008)

 

 

1 Parte da dissertação de Mestrado do primeiro autor, Programa de Pós Graduação em Biodiversidade e Meio Ambiente, Instituto de Botânica de São Paulo.
2 Autor para correspondência: amladeira@yahoo.com.br