Isolamento e seleção de fungos filamentosos do solo de sistemas agroflorestais do Município de Bom Jardim (PE) com base na capacidade de produção de enzimas hidrolíticas

Isolation and screening of filamentous fungi from soil of agroforestry systems in the municipality of Bom Jardim (PE) for the ability to produce hydrolytic enzymes

NOTA CIENTÍFICA SCIENTIFIC NOTE

Isolamento e seleção de fungos filamentosos do solo de sistemas agroflorestais do Município de Bom Jardim (PE) com base na capacidade de produção de enzimas hidrolíticas¹

Isolation and screening of filamentous fungi from soil of agroforestry systems in the municipality of Bom Jardim (PE) for the ability to produce hydrolytic enzymes

Dianny Carolyne Vasconcelos da Silva^I,II; Patricia Vieira Tiago^I; Jorge Luiz Schirmer de Mattos^II; Laura Mesquita Paiva^I; Cristina Maria de Souza-Motta^I,*

^IUniversidade Federal de Pernambuco, Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Micologia, Avenida Professor Nelson Chaves s/n, 50676-420 Recife, PE, Brasil

^IIUniversidade Federal Rural de Pernambuco, Departamento de Educação, Avenida Dom Manoel de Medeiros s/n, Dois Irmãos, 52171-900 Recife, PE, Brasil

RESUMO

O presente trabalho teve por objetivo isolar e identificar fungos de solo de sistemas agroflorestais e avaliar a atividade enzimática destes fungos. Estes foram isolados pela técnica de diluição sucessiva e avaliados quanto à capacidade de degradar amido, celulose e caseína. Foram identificadas 11 espécies de fungos anamorfos (Hyphomycetes) distribuídos em cinco gêneros: Aspergillus, Cladosporium, Curvularia, Fusarium e Penicillium. As espécies estudadas não apresentaram atividade amilolítica satisfatória. Cladosporium cladosporioides (Fres.) De Vries e Penicillium chrysogenum Thom apresentaram maior índice de relação enzimática (IRE) para protease e celulase. Entre as espécies estudadas seis apresentaram maior Índice de Relação Enzimática (IRE) para celulase em comparação as demais enzimas.

Palavras-chave: amilase, celulase, protease

ABSTRACT

This study aimed to isolate and identify fungi from soil of agroforestry systems and to evaluate the enzymatic activity of these fungi. These were isolated by successive dilution technique and evaluated for their ability to degrade starch, cellulose and caseine. Eleven species of anamorph fungi (Hyphomycetes) distributed in five genera were identified: Aspergillus, Cladosporium, Curvularia, Fusarium and Penicillium. The species studied did not show satisfactory amylolytic activity. Cladosporium cladosporioides (Fres.) De Vries and Penicillium chrysogenum Thom had higher enzyme relation index (ERI) for protease and cellulase. Among the species studied six showed higher Relative Enzymatic Index (IRE) for cellulase in comparison to the other enzymes.

Key words: amylase, cellulase, protease

Introdução

Os Sistemas Agroflorestais (SAFs) são sistemas de uso da terra nos quais espécies perenes lenhosas (árvores, arbustos, palmeiras e bambus) são intencionalmente utilizadas e manejadas em associação com cultivos agrícolas e/ou animais. Determinado consórcio pode ser chamado de agroflorestal na condição de ter pelo menos uma espécie tipicamente florestal, nativa ou aclimatada, de porte arborescente ou arbustivo (May & Trovatto 2008).

O solo é um recurso natural essencial para o funcionamento do ecossistema terrestre e representa um balanço entre os fatores físicos, químicos e biológicos. Os microrganismos são um dos principais seres vivos encontrados e a sua atividade afeta diretamente os fatores químicos e físicos do solo, contribuindo para sua produtividade (Pereira et al. 2007). O conhecimento da micota do solo, além de fundamental para o levantamento taxonômico das populações que ali se encontram, pode levar ao descobrimento de processos metabólicos utilizados por estes organismos que poderão ser importantes para as interações ambientais e em aplicações biotecnológicas (Ruegger & Tauk-Tornisielo 2004). O presente trabalho teve por objetivo isolar e identificar fungos de solo de sistema agroflorestal no município de Bom Jardim, PE e avaliar a produção enzimática destes fungos.

Material e métodos

Coleta do solo - A coleta das amostras de solo foi realizada em 08/10/2007 em três propriedades familiares, com aproximadamente 0,5 ha, localizadas na comunidade Feijão I, no Município de Bom Jardim, PE, 07º47´45,0" de latitude sul e 35º35'14,0" de longitude oeste. Os SAFs, tipo agrofloresta, apresentam predominantemente fruteiras tropicais e arbóreas nativas da Mata Atlântica. As amostras de solo foram coletadas até 20 cm de profundidade, em três pontos aleatórios por propriedade, constituindo uma amostra composta.

Isolamento dos fungos - Para obtenção das colônias fúngicas foi realizada a técnica de suspensão seriada de acordo com Clark (1965) modificado, em que 25 g de amostra de solo foram homogeneizadas em 225 mL de água destilada esterilizada. As diluições (10^-2 e 10^-3) foram plaqueadas em ágar Sabouraud, acrescido de cloranfenicol (100 mg L^-1) (Lacaz et al. 1991) e as placas foram incubadas a 28 ± 1 ºC, durante cinco dias. As colônias fúngicas distintas (características macroscópicas) foram purificadas através da técnica de esgotamento por estrias (Ribeiro & Soares 2002) em ágar Sabouraud adicionado de cloranfenicol (100 mg L^-1) e incubadas a 28 ± 1 ºC durante três dias. Após a purificação, as amostras foram transferidas para meios específicos (ágar Czapeck, batata dextrose ágar-BDA, ágar malte) contidos em tubos de ensaio (18 × 180 mm) para identificação, observando as características macroscópicas (textura, coloração e diâmetro das colônias) e microscópicas (microestruturas), com base na literatura especializada. Um representante de cada espécie foi depositado na Coleção de Culturas Micoteca URM, do Departamento de Micologia da Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE.

Índice enzimático dos fungos - Pequenas porções da cultura fúngica com sete dias de crescimento em ágar Czapeck (Aspergillus e Penicillium) e BDA (demais gêneros) foram transferidas com fio de platina para o centro da placa de Petri contendo o meio de cultura específico para cada enzima. Para a avaliação da capacidade de produzir amilase, foi utilizado o meio ágar Czapeck (Lacaz et al. 2002), modificado com adição de amido (0,01 g mL^-1). Para a celulase foi utilizado o meio descrito por Neirotti & Azevedo (1988) sem adição de extrato de malte e para protease o meio de caseína (Lacaz et al. 1991). As culturas foram incubadas a 28 ± 1 ºC por cinco dias. Após esse período, para a visualização do halo de degradação do amido e da caseína foi utilizado álcool iodado e a solução acidificada de cloreto de mercúrio, respectivamente. Para visualização do halo de degradação pela celulase foi utilizado o método de acordo com Ruegger & Tauk-Tornisielo (2004). Para obtenção dos índices enzimáticos, foi utilizado o Índice de Relação Enzimática (IRE = D/d), em que D equivale ao diâmetro total (halo + colônia) e d equivale ao diâmetro da colônia, ambos medidos com régua (Tiago & Silva 2007).

O experimento foi realizado em delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial 11 × 3, sendo onze espécies de fungos isolados e três meios de cultura, com três repetições. Os dados foram submetidos à análise de variância a 5% de probabilidade, e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Foi utilizado o programa Assistat 7.5 beta (Silva & Azevedo 2009).

Resultados e discussão

Foram isoladas 11 espécies de fungos anamorfos (Hyphomycetes) distribuídos em cinco gêneros: Aspergillus (4 spp.), Cladosporium (1 sp.), Curvularia (1 sp.), Fusarium (2 sp.) e Penicillium (3 spp.) (Tabela 1). Resultados semelhantes foram observados por Cavalcanti et al. (2006), no solo de caatinga na região Xingó, por Souza-Motta et al. (2003), na rizosfera de girassol (Helianthus annuus L.). Schoenlein et al. (2008) observaram a prevalência dos gêneros Aspergillus, mas também Trichoderma em amostras de solo da região dos lagos no município de Santa Gertrudes, SP.

Observou-se que Fusarium lateritium e Fusarium oxysporum não apresentaram capacidade de degradar o amido (tabela 1). Para as demais espécies, foi observado halo de degradação correspondente ao tamanho da colônia (IRE = 1). Link & Onofre (2010) verificaram, em meio sólido, a atividade amilolítica de fungos do gênero Penicillium e Fusarium isolados de ramos de vassourinha (Baccharis dracunculifolia DC.). Outras espécies de fungos apresentaram capacidade de degradar o amido, como Mucorales isolados de solo de mineração de cobre (Santiago & Souza-Motta 2006), Paecilomyces variotii, Rhizopus microsporus var. rhizopodiformis e Aspergillus phoenicis de amostras de solo de diferentes regiões do Estado de São Paulo (Guimarães et al. 2006), enquanto Silva et al. (2006) observaram ausência de atividade amilolítica para os gêneros Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Nigrospora, fungos endofíticos de Annona spp.

Cladosporium cladosporioides (IRE = 1,95) e Penicillium chrysogenum (IRE = 1,94) se destacaram quanto à capacidade de degradar celulose, seguidos por Penicillium decumbens. Degradação de celulose também foi observada para as espécies de Aspergillus e Penicillium isoladas de resíduos de mamona (Ricinus communis) (Herculano et al. 2011). Vinte espécies de Penicillium, isoladas de solo da Estação Ecológica de Juréia-Itatins - SP, foram avaliadas por Ruegger & Tauk-Tornisielo (2004) quanto à produção de celulase e, entre estas espécies, P. decumbens não apresentou atividade celulolítica.

Cladosporium cladosporioides e P. chrysogenum apresentaram maior capacidade de degradar caseína. Atividade proteolítica já foi observada para os gêneros Fusarium e Penicillium, fungos isolados de frutos do café (Coffea arabica L.) por Rodarte et al. (2011). Santiago & Souza-Motta 2008, obtiveram resultados semelhantes com Mucorales isolados de milho processado (Zea mays).

Não houve diferença na degradação de amido, caseína e celulose por Aspergillus clavatus, Curvularia pallescens e Penicillium janthinelum. Fusarium lateritium e F. oxysporum apresentaram os maiores índices enzimáticos para celulase e protease em comparação à amilase, a qual não foi produzida por estes fungos. No entanto, A. flavus, A. niger, A. niveus, C. cladosporioides, P. chrysogenum e P. decumbens apresentaram maiores índices enzimáticos para celulase em comparação às demais enzimas. Segundo Ruegger & Tauk-Tornisielo (2004), os fungos que decompõem substâncias celulósicas geralmente ocorrem no solo, colonizando vegetais, suas raízes e resíduos, com importante função de reciclagem de nutrientes.

Os fungos isolados de solo de sistemas agroflorestais apresentaram os maiores índices enzimáticos para celulase e, entre estes, as espécies que se destacaram foram C. cladosporioides e P. chrysogenum, sendo indicadas para estudos de produção em meio líquido.

(recebido: 31 de maio de 2011; aceito: 07 de dezembro de 2011)

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1

. Parte da monografia de Graduação da primeira autora, Curso de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco, PE, Brasil.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  12 Jan 2012
• Data do Fascículo
  Dez 2011

Histórico

• Aceito
  07 Dez 2011
• Recebido
  31 Maio 2011