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Food Science and Technology

Print version ISSN 0101-2061On-line version ISSN 1678-457X

Ciênc. Tecnol. Aliment. vol.17 no.3 Campinas Sept./Dec. 1997

http://dx.doi.org/10.1590/S0101-20611997000300006 

SÍNTESE DE ESTERES TERPENÓIDES POR VIA ENZIMÁTICA:
INFLUÊNCIA DO TAMANHO DA CADEIA ALIFÁTICA DO ÁCIDO GRAXO E DA ESTRUTURA DO ÁLCOOL DE TERPENO1

 

CASTRO2, Heizir F.; OLIVEIRA2, Pedro C. & SOARES2, Cleide, M.F.

 

 


RESUMO

A especificidade de uma preparação comercial de lipase imobilizada, com relação a molécula ácida e alcoólica do substrato, foi estudada através da síntese de diversos ésteres de terpenóides. Na série de reações do citronelol e ácidos graxos com diferentes tamanho de cadeia alifática (C2 a C18), altas taxas de esterificação (95 a 98%) foram alcançadas para ácidos contendo 4 ou mais carbonos. Numa segunda série de experimentos, diferentes álcoois terpenos foram esterificados com ácido butírico, sendo constatado uma influência marcante da estrutura do álcool de terpeno no desempenho desta preparação enzimática. Graus de esterificação maiores que 95% somente foram obtidos para os álcoois primários como citronelol, geraniol e nerol. Álcoois secundários (mentol) e terciários (linalol) não foram esterificados, sob as condições testadas.

Palavras-chave: lipase, especificidade, ésteres terpenóides


SUMMARY

SYNTHESIS OF TERPEN ESTERS BY ENZYMATIC ROUTE: INFLUENCE OF THE FATTY ACID SIZE CHAIN AND ALCOHOL STRUCTURE.The selectivity of a commercial immobilized lipase preparation was tested in two set of esterification reactions. In the first group, synthesis were carried out with citronellol and different organic acids (C2 to C18). For this case, with the exception of acetic acid, the size of the carbon chain showed no significant alteration in the esterification rates. Acids containing four or more carbons, were considered to be excellent acyl donors, resulting in the esterification rates in the range of 95% to 98%. Alternatively, the esterification reactions were carried out with different terpen alcohols and butyric acid. The alcohol structure showed to have great influence on the performance of this enzyme preparation. Esterification degree over 95% were attained for primary alcohols such as citronellol, geraniol and nerol. Secondary (menthol) and tertiary (linallol) were not esterified under the tested conditions.

Key words: lipase, specificity, terpen esters.


 

 

1 — INTRODUÇÃO

As limitações existentes na obtenção de produtos e intermediários de interesse comercial podem ser associadas aos tipos de catalisadores químicos empregados, que são pouco versáteis e exigem altas temperaturas para atingir razoável velocidade de reação. Além disso, possuindo baixa especificidade, geralmente fornecem produtos de composição química mista, ou produtos contaminados, que requerem uma etapa posterior de purificação (2, 8, 14).

Nesse contexto, o enfoque biotecnológico, vem se apresentando como uma opção interessante para sua exploração em síntese orgânica, principalmente quando são consideradas algumas das vantagens dessa rota, tais como: i) maior rendimento do processo; ii) obtenção de produtos biodegradáveis; iii) menor consumo de energia; iv) redução da quantidade de resíduos; v) introdução de rotas mais acessíveis de produção (1, 2, 8, 12).

A área de atuação da biotecnologia, que pode alcançar as metas acima traçadas é denominada de biotransformação. O presente trabalho, se insere nesta nova área de pesquisa e utiliza enzimas purificadas para mediar modificações específicas ou interconversões de estruturas químicas (6, 19).

Enzimas isoladas ou purificadas possuem um número de propriedades que tornam seu uso atrativo como catalisador em biotransformação. Elas são extremamente ativas, versáteis e realizam uma variedade de transformações sob condições brandas e de maneira seletiva. Adicionalmente, desenvolvimentos recentes em enzimologia, principalmente engenharia de proteínas e reações enzimáticas em meios não aquosos, aumentaram consideravelmente o potencial de aplicação das enzimas como catalisador em processos industriais (1, 2, 19, 25).

No entanto, a aplicação de enzimas em síntese orgânica é ainda restrita a um grupo reduzido, particularmente aos grupos que não requerem presença de co-fatores, como por exemplo, as hidrolases (19, 24). Entre esse grupo, o reconhecido fato que as lipases podem catalisar diversos tipos de reações quando submetidas a condições especiais (meio não aquoso), tem criado novas oportunidades de mercado, bem como, a substituição de alguns produtos naturais (2, 17, 25).

A função das lipases é catalisar a hidrólise de glicerídeos e outros ésteres graxos; contudo, essas reações são facilmente reversíveis. Consequentemente, as lipases são excelentes catalisadores, para um largo espectro de reações de esterificação e transesterificação (6, 9, 10). Entretanto, para sua aplicação industrial, a especificidade da lipase é um fator crucial, isto é, a enzima pode ser específica com relação a molécula ácida ou alcoólica do substrato (20, 24). Estudos de processos de biotransformação utilizando lipases, têm sido desenvolvidos em nossa instituição desde de 1992 (3-8). Esta linha de pesquisa tem gerado importantes resultados relativos à produção de ésteres aromatizantes, empregando preparações comerciais de lipase imobilizada (Lipozyme) em meios não convencionais, adotando como modelo de estudo, a síntese do butirato de citronila (7, 8). Neste trabalho, o escopo da nossa pesquisa foi ampliado com o objetivo de completar as informações necessárias quanto à adequação desta preparação comercial de enzima para obtenção de compostos terpenóides potencialmente interessantes para aplicação prática, especialmente nas indústrias de fragrâncias e aromatizantes. Como parâmetro de avaliação foi considerado a especificidade desta preparação enzimática com relação a molécula ácida e alcoólica do substrato, sendo verificado o efeito do tamanho da cadeia alifática do ácido graxo, bem como o efeito da estrutura do álcool de terpenos (primários, secundários e terciários) na obtenção de butiratos de terpenóides.

 

2 — MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 – Materiais

Preparação comercial de enzima (Lipozyme TM20- Mucor miehi lipase imobilizada em resina de troca iônica, manufaturada pela Novo Nordisk/ Dinamarca) empregada numa concentração fixa de 10% p/p em relação ao peso total de reagentes. Como materiais de partida foram utilizados: ácido acético (Rio Lab, 99,7%); ácido butírico (Merck, 99,5%); ácido oenântico (Merck, 97%); ácido caprílico (Vetec, 99%); ácido pelargônico (Merck, 92%); ácido cáprico (Merck, 98%); ácido láurico (Merck, 98%); ácido miristínico (Merck, 97%); ácido óleico (Reagem, 96%), d,l-citronelol (Sigma, 95%), geraniol (Sigma, 95%), nerol (Sigma, 95 %), d-mentol, l-mentol e d,l-mentol (Sigma, 95%), linalol (Sigma, 95%). Todos os experimentos utilizaram heptano, como solvente. Os substratos foram previamente desidratados com peneira molecular em forma de pellets com 4 A° (Aldrich), de acordo com metodologia previamente descrita (7, 8).

2.2 – Condições experimentais

As sínteses foram conduzidas em reatores fechados de 100 mL contendo: 0,25 M citronelol e 0,30 M dos diversos ácidos testados ou 0,25 M dos diversos álcoois e 0,30 M de ácido butírico, em 20 mL de heptano. As misturas foram incubadas com quantidades adequadas de Lipozyme, sob condições de agitação de 150 rpm, numa temperatura de 45°C durante 24 horas. Foram analisadas, amostras referentes ao tempo inicial e final de cada teste efetuado. Os resultados apresentados são referentes as médias de três bateladas.

2.3 – Métodos Analíticos

A reação foi monitorada pela medida da concentração do álcool de terpeno usando cromatografo à gás (Modelo CG-37, com DIC empregando uma coluna CG 5814 (1/4"x 3m) l5% DEGS S/E CHRWPP, numa temperatura de 190°C e heptanol como padrão interno). Os teores dos ácidos foram determinados por volumetria, utilizando uma solução alcoólica de KOH 0,02N e fenolftaleína como indicador. A concentração de água na fase líquida foi medida por um titulador automático Karl Fisher (Mettler Modelo D-18).

 

3 — RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 – Efeito do tamanho da cadeia do ácido

A síntese de ésteres de citronelol com os diferentes ácidos alifáticos é mostrada na Figura 1. Após 24 horas de incubação do citronelol e ácidos numa razão molar fixa e próxima de 1, com Lipozyme (10% p/p), numa temperatura de 45°C, 95 a 98% dos diferentes ácidos (C4 a C18) foram esterificados. A única exceção constatada foi referente ao emprego do ácido acético como substituinte no grupo acila. Nesse caso particular, foram alcançadas taxas de esterificação de apenas 14%.

 

 

Resultados similares foram reportados na literatura (9, 18, 22, 23) empregando condições experimentais semelhantes as descritas neste trabalho. Segundo diversos autores (23, 28), a presença de ácido acético no meio reacional pode ocasionar danos na camada de hidratação da interação camada-protéica ou na estrutura da enzima, resultando numa inibição parcial ou total da preparação enzimática. Esse efeito negativo, pode ser atribuído a alta polaridade do ácido acético (log P = –0,23), o que ocasiona uma partição (migração) do ácido para a fase sólida (enzima/ suporte), resultando numa saturação do micro-ambiente da enzima. Desta forma, cerca de 50% da água contida napreparação enzimática é removida, ocorrendo redução da atividade da lipase. É importante notar, que Lipozyme tem uma atividade plena para teores de umidade entre 9-11% (26). Além disso, pode ocorrer uma redução da disponibilidade de ácido acético na fase líquida interrompendo a reação de esterificação.

Assim os fenômenos de partição causam a modificação do estado original de hidratação enzimática (redução do teor de umidade de 10% para 5%) e um aparente desequilíbrio entre a taxa de conversão e disponibilidade do ácido no meio reacional. Para melhor exemplificar estes fenômenos, na Tabela 1 são mostrados os resultados obtidos referentes ao consumo em mols do citronelol e de todos os ácidos testados. Se para cada mol de éster formado é consumido um mol de álcool e um mol de ácido, apenas no caso do ácido acético, esta proporcionalidade entre álcool/ ácido consumido, não foi verificada.

 

 

Conforme descrito anteriormente, este resultado é uma conseqüência direta de uma maior partição da molécula ácida do substrato para a fase sólida (enzima), uma vez que, a presença do ácido acético no meio reacional confere ao substrato uma elevada polaridade.

Considerando que o acetato de citronila é um importante aromatizante, inúmeros trabalhos têm sido desenvolvidos com a finalidade de minimizar os fatores de inibição da lipase, obtendo, desta forma, rendimentos mais atrativos para o setor industrial (9-11, 13). Tais metodologias incluem o desenvolvimento do processo de esterificação em reatores operando em regime de batelada alimentada (13) ou a substituição da reação de esterificação pela reação de interesterificação, empregando substituintes no grupo acila com menor grau de polaridade (10, 11). Esses procedimentos são objeto de intenso estudo em nosso laboratório, cujos os resultados estão em fase de análise final.

3.2 – Efeito da estrutura do álcool

Para estudar a especificidade da preparação enzimática com relação a estrutura do álcool, a síntese de diferentes álcoois de terpenos (primários, secundários e terciários) com ácido butírico foi conduzida em condições previamente estabelecidas (7).

Conforme mostrado na Tabela 2, para todos os álcoois primários testados, taxas de esterificação maiores que 90% foram obtidas em regime de batelada (45°C/ 24h/ 100 rpm). A água formada durante a reação de esterificação foi adsorvida pela preparação enzimática, mantendo baixos valores de água no meio reacional, evitando desta forma, a reversibilidade da reação. Para ilustrar o comportamento da preparação enzimática durante a síntese dos butiratos de terpenos primários, foi selecionado o progresso da esterificação do citronelol com ácido butírico, conforme mostrado na Figura 2. Este tipo de comportamento foi similar para as esterificações do geraniol e nerol com o ácido butírico.

 

 

 

Com relação ao mentol, foram encontradas diferenças marcantes quanto ao tipo de isômero empregado, tendo sido constatado, conversões da ordem de 16%, apenas para o isômero l-mentol (Tabela 3). Ao contrário do constatado com os álcoois primários, a manutenção de teores reduzidos de água no meio reacional durante a síntese do butirato de l-metila foi extremamente dificultada (Figura 3), mesmo em presença de agentes dessecantes (dados não mostrados).

 

 

 

Álcoois terciários, como por exemplo, linalol não foram esterificados sob as condições testadas (Figura 4), sugerindo que a especificidade desta preparação enzimática obedece preferencialmente a seguinte seqüência: primários > secundários > terciários.

 

 

É importante ressaltar que, os resultados descritos neste trabalho são restritos apenas ao uso de uma preparação enzimática (Lipozyme). De acordo com dados descritos na literatura, altas taxas de esterificação do mentol com diversos ácidos graxos, podem ser obtidas, através do emprego de outras preparações de lipase (15, 16, 21, 27). Entretanto, até o momento, não foi descrito na literatura, preparações lipolíticas com capacidade de esterificar álcoois de terpenos terciários.

 

4 — CONCLUSÕES

Os resultados obtidos neste trabalho mostraram que, com exceção do ácido acético, o tamanho da cadeia influenciou de maneira pouco significativa o rendimento de esterificação. Ácidos de cadeias alifáticas contendo quatro ou mais carbonos, foram considerados excelentes substituintes no grupo acila, fornecendo taxas de esterificação entre 95 a 98%. O baixo rendimento alcançado na síntese do acetato de citronila pode ser atribuído, a atuação do ácido acético, como inibidor do mecanismo enzimático da lipase. Foi ainda verificado que, este tipo de preparação de lipase (Lipozyme) apresenta sérias limitações para aplicação em reações de esterificação de álcoois secundários e terciários, sendo portanto, recomendado o seu uso apenas na síntese de ésteres terpenóides, empregando álcoois primários como citronelol, geraniol e nerol.

 

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6 — AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao CNPq pelo apoio financeiro (Projeto Nº 510402/ 93-3).

 

 

1 Recebido para publicação em 23/05/97. Aceito para publicação em 22/10/97.

2 Faculdade de Engenharia Química de Lorena (FAENQUIL)/ Departamento de Engenharia Química/ C.P.116 - CEP 12600-000- Lorena- SP.

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