Caracterização de propriedades funcionais do isolado protéico de sementes de algaroba (Prosopis juliflora(SW) D.C.). modificado por acetilação

Characterization of functional prorperties of acylated mesquite bean (Prosopis juliflora (SW) D.C.) protein isolate

CARACTERIZAÇÃO DE PROPRIEDADES FUNCIONAIS DO ISOLADO PROTÉICO DE SEMENTES DE ALGAROBA (Prosopis juliflora(SW) D.C.). MODIFICADO POR ACETILAÇÃO¹

SILVA², José Barros da; BORA³, Pushkar Singh & NETO⁴, Vicente Queiroga

RESUMO

O isolado protéico das sementes de algaroba (Prosopis juliflora (SW) D.C.) foi modificado com anidrido acético nas concentrações de 5, 10, 20 e 30% (V/P), resultando, portanto, nos respectivos graus de modificação: 69,5; 83,2; 89,7 e 91,1% da lisina disponível. Caracterizou-se a funcionalidade do isolado nas formas não modificada e acetilada. O isolado não modificado apresentou alta solubilidade em pH ácido e básico, com exceção da faixa de pH 4 a 6. A acetilação deslocou o ponto isoelétrico das proteínas do pH 5 para o pH 4,5 , diminuiu em pequena extensão a solubilidade abaixo do ponto isoelétrico e aumentou a partir do pH 5, principalmente em pH 7. A capacidade de absorção de água e de óleo do isolado não modificado, que por sua vez se mostrou baixa (1,89 e 1,04g/g proteína), não melhorou satisfatoriamente após a modificação. O efeito de modificação nas propriedades espumantes foi maior com relação ao volume e a expansão da espuma formada do que na sua estabilidade. A capacidade emulsificante do isolado acetilado aumentou em grande extensão, no entanto, a atividade emulsificante e estabilidade de emulsão revelaram pequenos incrementos, em comparação com o isolado não modificado.

Palavras-chaves: semente de algaroba; isolado protéico; acetilação; propriedades funcionais.

ABSTRACT

CHARACTERIZATION OF FUNCTIONAL PRORPERTIES OF ACYLATED MESQUITE BEAN (Prosopis juliflora (SW) D.C.) PROTEIN ISOLATE. Protein isolate from seed of mesquite bean (P. juliflora (SW) D.C) were modified with acetic anhydride at concentrations 5, 10, 20 and 30% (ml per 100 g of protein) thus resulting 69.5; 83.2; 89.7 and 91.1% modification of available lysine. Functional characteristic of protein isolate was studied in native and acetilated form. Protein isolate in native form presented high solubility at acidic and basic pH, except in the pH range of 4 to 6. Acetilation shifted the isoelectric point of the proteins pH 5.0 to a pH 4.5; reduced the solubility at pH values below the isoelectric point and increased above pH 5.0, mainly at pH 7.0. The capacity of water and oil absorption of the native protein was small (1.89 and 1.04 g) and did not improve satisfactorily after modification. The effect of the modification on the foaming properties was higher in relation to the volume and foam expansion than its stability. Emulsifyng capacity of the acetylated protein isolate increased to the a higher extent, however, emulsifying activity and emulsion stability presented small variations in comparison to native protein isolate.

Key words: seed of mesquite bean; protein isolate; acetylation; functional properties.

1 — INTRODUÇÃO

Concentrados e isolados protéicos extraídos da soja têm sido produzidos em grande escala para servir como ingredientes funcionais numa ampla e sempre crescente faixa de aplicação em alimentos. Quando substituem proteínas convencionais, os concentrados e isolados desenvolvidos deverão manter ou melhorar a qualidade e aceitabilidade dos produtos aos quais foram incorporados (24).

A semente de algaroba colhida em áreas secas do Nordeste brasileiro, hoje é considerada uma matéria prima de significativo potencial para o desenvolvimento de produtos alimentícios. Em investigações com sementes dessa leguminosa, FIGUEIREDO (12;13;14) e FIGUEIREDO E PRICE (15) analisaram a sua composição e algumas possibilidades de uso, caracterizaram os ácidos graxos do óleo extraído, identificaram os polissacarídeos, analisaram o perfil de aminoácidos e determinaram o peso molecular das proteínas isoladas. DEL VALLE et al. (10) e MARAGONI e ALLI (28), observaram teores de proteínas iguais a 37,2% e 35,0%, respectivamente em sementes de Prosopis juliflora.

Quando não atendem satisfatoriamente aos requisitos de funcionalidade, as proteínas podem ser modificadas visando a melhoria desta característica. Dentre os vários métodos empregados na modificação da cadeia protéica, a acilação é um dos mais efetivos e tem sido aplicado em proteínas vegetais de diversas espécies e partes das plantas, tais como, folha (16), amendoim (6), girassol (8), Vicia faba (35), algodão (9), ervilha (20), aveia (27), germe de milho (30) e Canola (33).

Os anidridos acético e succínico são os acilantes de maior utilização direta em proteínas para consumo humano. Esses reagentes são considerados como GRAS (Generally Recognized as Safe) pelo Food and Dry Administration - FDA dos Estados Unidos (EISELE citado em 20).

O anidrido acético, particularmente, reage basicamente com o Î-amino grupo da lisina para formar um grupo neutro acetila (20). As mudanças de afinidade eletrostática da molécula protéica como resultado da acetilação, podem causar dissociação de proteínas agregadas em subunidades e desdobramento da estrutura protéica (29). É esperado que essas mudanças na estrutura provoquem modificação nas propriedades físicas, químicas e funcionais das proteínas.

Dessa forma, sugere-se que isolados protéicos de origem vegetal ainda não utilizados na indústria de alimentos, sejam caracterizados quanto ao aspecto funcional nas formas natural e modificada, o que indicará um conhecimento mais amplo das suas potencialidades como ingrediente alimentício. O presente trabalho tem como objetivo caracterizar algumas propriedades funcionais do isolado protéico de sementes de algaroba (P. juliflora (SW) D.C.), no que diz respeito a solubilidade, absorção de água e de óleo, propriedades emulsificantes e propriedades espumantes, sob o efeito de diferentes graus de modificação com anidrido acético.

2 — MATERIAL E MÉTODOS

2.1 – Matéria prima

As sementes de algaroba (P. juliflora (SW) D.C.) utilizadas na obtenção dos isolados protéicos foram fornecidas pela Delegacia do IBAMA do Rio Grande do Norte. As sementes foram quebradas em moinho de disco (Arbel) e posteriormente moídas em moinho doméstico. A farinha obtida foi peneirada em malha de 0,42 mm e desengordurada com éter de petróleo em aparelho Soxhlet.

2.2 – Obtenção do isolado protéico

O processo de obtenção do isolado protéico foi conduzido de acordo com o método de BETSCHART e SAUNDERS (5) modificado. Adicionou-se à farinha desengordurada água destilada na proporção de 1:10. A dispersão foi agitada durante 30 minutos e ocasionalmente ajustado a pH 10 com NaOH 1N. O extrato foi centrifugado por 20 minutos a 7.040 x g em centrifuga refrigerada. O resíduo foi extraído por mais duas vezes nas mesmas condições. Em todas as extrações foram determinados os volumes dos sobrenadantes e as respectivas concentrações protéicas. Os três sobrenadantes foram combinados, medindo-se o volume total e a concentração de proteína e sob agitação ajustou-se o pH a 5 com HCl, provocando, dessa maneira, a precipitação das proteínas. O precipitado foi coletado após centrifugação refrigerada por 20 minutos a 7.040 x g, lavado em água destilada, centrifugado novamente, tamisado em malha de 1,00mm, secado sob refrigeração (5°C), pulverizado em moinho manual (Geska Qualitat - DR), tamisado a 0,43mm e estocado em frascos de vidro a 5°C, até posterior utilização.

2.3 – Acetilação do isolado protéico e grau de modificação

O anidrido acético (Vetec Ltda) foi usado como agente de modificação do isolado protéicos de sementes de algaroba, conforme GRONINGER (19). Amostras foram solubilizadas em água destilada e ajustadas a pH 8,0 com NaOH 1N a baixa temperatura (2-4°C). O teor protéico de cada amostra, após a solubilização, foi considerado para definir a quantidade de anidrido acético a ser adicionado em diferentes níveis: 5, 10, 20 e 30% (V/P). Alíquotas de volumes iguais do reagente foram adicionadas no período de uma hora, sob constante agitação e ao mesmo tempo mantendo o pH entre 8,0-8,5 com NaOH 1N. A reação foi considerada completa quando o pH se manteve estabilizado (pH 8). O grau de modificação das proteínas foi determinado colorimetricamente de acordo com BECKWITH et al (4 ).

2.4 – Métodos analíticos

Na quantificação do teor proteíco da matéria prima da farinha desengordurada e do isolado, utilizou-se o método Kjeldahl (1). As proteínas solúveis dos extratos obtidos foram quantificadas pelo método do biureto (17), usando-se como padrão a albumina bovina (Sigma chemical).

2.5 – Propriedades funcionais

2.5.1 – Solubilidade

A partir de volumes iguais a 20ml de Suspensão a 0,5% (p/v) de proteína, determinou-se a solubilidade do isolante protéico, variando o pH de 2 a 10, conforme FRANZEN e KINSELLA (16). As proteínas solúveis foram quantificadas pelo método do biureto (17).

2.5.2 – Absorção de água e de óleo

Na avaliação da absorção de água e de óleo, amostras equivalentes a 0,25g de proteína em pH de precipitação, foram misturadas individualmente em tubos centrifuga com 5 ml de água destilada ou de óleo refinado de soja (Violeta-Olvebra), seguindo a metodologia descrita por PAREDES - LÓPES et al. (32).

2.5.3 – Capacidade emulsificante

Conforme o método de WEBB et al. (38), determinou-se a capacidade emulsificante a diferentes pH (3,5; 7 e 8) em amostra de 50 ml de suspensão a 0,1% (p/v) de proteína, utilizando-se como parâmetro o aumento da resistência elétrica até a inversão da emulsão original óleo/água em água/óleo, detectada por um par de eletrodos. A emulsão foi agitada numa velocidade de 10.000 rpm à temperatura ambiente (28ºC), sendo adicionado óleo refinado de soja a um fluxo constante (26 ml/minuto), até o registro da resistência infinita do meio pelo multímetro (Figura 1).

2.5.4 – Atividade emulsificante e estabilidade de emulsão

A atividade emulsificante e estabilidade de emulsão foram avaliadas com modificação de YASUMATSU et al. (39) sugeridas por DESHPANDE et al. (11). Volumes de 20 ml de suspensão semelhante a utilizada na determinação da capacidade emulsificante, foram misturados com 20 ml de óleo refinado de soja, fazendo-se uso do equipamento esquematizado na Figura 1, na velocidade de 10.000 rpm por 1 minuto. A emulsão formada foi dividida em tubos centrífuga (10ml) e centrifugados (1800 x g) por 5 minutos. A atividade de emulsão foi determinada como sendo o percentual da mistura que permaneceu emulsionado. A estabilidade de emulsão, foi avaliada, após aquecimento a 80°C por 30 minutos em banho maria, resfriamento e recentrifugação dos tubos que continham a emulsão formada na avaliação da atividade emulsificante. A estabilidade de emulsão foi calculada como sendo o percentual da atividade emulsificante que permaneceu emulsionado após sofrer tratamento térmico.

2.5.5 – Propriedades espumantes

As características espumantes do isolado protéico foram avaliadas pelo método desenvolvido por WANISKA e KINSELLA (37) e modificado por KOYORO (25). O principal componente da aparelhagem utilizada para produção de espuma, foi uma coluna de vidro (100cm de altura x 0,98cm de diâmetro interno) de parede dupla, graduada em mililitros (Figura 2). O espaço entre as paredes da coluna foi preenchido com água a temperatura ambiente (28°C). O ar procedente de um compressor (Figura 2), penetrou na coluna por meio de um disco poroso de vidro, localizado internamente na parte inferior da coluna. Suspensões equivalentes a 0,5% de proteína foram preparadas a diferentes valores de pH (3; 5; 7 e 8). Volumes de 15 ml foram injetados na coluna por meio de pipeta volumétrica. O ar foi insuflado por 1 minuto num fluxo de 60 ml/min. O volume de espuma formado no final do período (1 minuto) de insuflamento de ar, representou a capacidade espumante. O tempo necessário para que a metade do volume do líquido na espuma fosse drenado, utilizou-se como medição de estabilidade da espuma. A expansão da espuma foi calculada de acordo com a equação sugerida por BRITTEN e LAVOIE (7):

A caracterização de cada propriedade funcional foi executado com três determinações para cada ponto experimental. Os resultados finais, representam a média destas determinações. Análises de variância, aplicando o teste de Tukey, foram realizadas visando comparar as médias obtidas nas determinações da atividade emulsificante e estabilidade de emulsão.

3 — RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 – Obtenção do isolado protéico

O conteúdo protéico da ordem de 34,5% observado nas sementes de algaroba, aproximaram-se dos resultados de MARAGONI e ALLI (28) quando obtiveram 35,0% de proteínas em sementes colhidas no Equador. Enquanto que DEL VALLE et al. (10) extraíram 37,2% de proteína de sementes procedentes do México. Após a retirada do tegumento das sementes e da extração de lipídios, a farinha obtida aprensentou 57,85% de proteína.

A partir da farinha desengordurada, 75,73% das proteínas foram extraídas e 63,20% foram precipitadas em relação ao conteúdo protéico da amostra inicial e o precipitado recuperado por centrifugação resultou num isolado com 94,3% de proteína em base seca. Estes valores foram superiores aos índices citados por BAIÃO (2) na extração (44,9%) e na precipitação (64,0%) e ao teor protéico do isolado (91,8%), obtido com sementes da mesma espécie. MARAGONI e ALLI (28), também pesquisando sementes de P. Juliflora, verificaram rendimento superior na extração (78,2%) e inferior na precipitação (55,0%) das proteínas.

O isolado apresentou uma estrutura bastante compacta após a secagem.

3.2 – Extensão da modificação

A extensão da modificação do isolado protéico de sementes de algaroba estimada como a quantidade de Î- amino grupos da lisina acetilada, está apresentada na Tabela 1. Observou-se que o grau de modificação aumentou progressivamente com a concentração do anidrido acético, sendo que este se mostrou eficaz logo nos níveis iniciais (5 e 10%), proporcionando 64,5 e 83,2% de modificação, respectivamente, da lisina disponível. MA (27) obteve resultados aproximados (50,2 e 86,1) com proteína de aveia acetilada, enquanto NARAYANA e RAO (31) registraram índices inferiores (33,0 e 80,1%) de modificação com feijão alado (Psophocarpus tetragonolobus), também utilizando baixa concentração do reagente. Ao contrário, GOULET et al. (18) observaram que o anidrido acético, numa concentração muito baixa (0,092g/g proteína), modificou 76,4% dos Î-amino grupos do concentrado protéico de aveia.

3.3 – Solubilidade

Observa-se na Figura 3, que os isolados acetilados apresentaram solubilidade mínima no pH 4,5 (ponto isoelétrico), decréscimo progressivo da solubilidade abaixo do ponto isoelétrico em função do grau de modificação e aumento entre os pHs 5 e 7, em comparação com as proteínas não modificadas. Na faixa de solubilidade mínima, constatou-se um deslocamento do ponto isoéletrico (pH 5) para um valor mais ácido (pH 4,5), após a modificação. CANELLA et al. (8), do mesmo modo, verificaram que a acetilação do concentrado protéico de girassol deslocou o ponto isoelétrico, aumentou a solubilidade acima do pH 5. KIM et al. (22 ) observaram um aumento na solubilidade de glicinina acetilada em pH acima do ponto isoelétrico.

As alterações na solubilidade refletiram o aumento das cargas negativas na proteína, como resultado da substituição dos Î-amino grupos da lisina por grupos neutros acetilas promovida pela acetilação. Conforme SCHMANDKE et al. (35), o aumento das cargas negativas na proteína induz a um desdobramento da estrutura protéica, o qual está relacionado com processos de dissociação.

Observa-se na Figura 3 a inexistência de proporcionalidade direta de solubilidade versus nível de aceitação das proteínas em determinados valores de pH. Este fato sugere que a característica físico-química do isolado de sementes de algaroba modificado, pode ter sido afetado por outros efeitos na molécula protéica, além das mudanças de cargas.

3.4 – Absorção de água e de óleo

A capacidade de absorção de água do isolado protéico de sementes de algaroba modificada foi ligeiramente superior ao isolado não modificado (Figura 4). A massa de água absorvida aumentou progressivamente com o grau de modificação, mesmo sendo em pequena magnitude os incrementos observados. PONNAMPALAM et al. (34) obtiveram resultado aproximado ao da proteína de algaroba modificada a 69,5%, com proteínas de aveia acetilada (0,031g/g proteína), em que a capacidade de absorção de água cresceu em 10% com relação à proteína não modificada. A acetilação tem se mostrado favorável na absorção de água de outras proteínas vegetais incluindo girassol (8, 21) e feijão alado (31). A modificação pode causar desdobramento das proteínas devido às repulsões eletrostáticas entre grupos carboxílicos adicionados e os grupos carboxílicos nativos adjacentes, produzindo mais interação proteína-água e menos interação proteína-proteína (34). No entanto, BARMAN et al. (3) relataram decréscimo da absorção de água em isolado protéico de soja acetilado.

A modificação do isolado protéico de sementes de algaroba apresentou um pequeno efeito positivo na capacidade de absorção de óleo, nos níveis de 89,7 e 91,1% de modificação. Este efeito, entretanto, foi quase inexistente nos graus inferiores (69,5 e 83,2%) de modificação (Figura 4). O isolado de girassol, submetido por KABIRULLAH e WILLS (21) a diferentes níveis de acetilação (23, 54 e 85%), igualmente mostrou aumentos de pequena magnitude da capacidade de absorção de óleo.

A estrutura compacta adquirida pelo isolado em estudo, após secagem, possivelmente contribuiu negativamente na absorção de óleo pelas proteínas, tanto na forma nativa como acetilada. Esta dedução converge para as conclusões de MA (27), que após obter uma capacidade de absorção de óleo com proteína de aveia acetilada, três vezes a capacidade da proteína não modificada, concluiu que o decréscimo da densidade das proteínas acetiladas pode ter contribuído para o grande aumento da capacidade de absorção de óleo, uma vez que, esta propriedade está parcialmente relacionada com a retenção física do óleo pela matriz protéica. Por outro lado VOUTSINAS et al. (36) sugerem que a hidrofobicidade das proteínas ocupa o principal papel na absorção de óleo.

3.5 – Capacidade Emulsificante

O volume de óleo emulsionado (Figura 5), aumentou acentualmente no pH inicial (pH 3), particularmente a 89,7 e 91,1% de modificação, onde se verificaram os maiores valores (237 e 238ml óleo /100mg proteína), decresceu no pH 5 e voltou a crescer, progressivamente nos pH 7 e 8. O máximo de óleo emulsionado (238ml /100mg proteína), correspondeu a um aumento de 160% em comparação com o isolado não modificado (91,3ml óleo/100mg proteína). Efeito aproximado foi verificado por CANELLA et al. (8) para um concentrado protéico de girassol após a acetilação. Estes autores obtiveram, a pH 7, um aumento de 120% na capacidade emulsificante das proteínas de um concentrado protéico de girassol após a acetilação, enquanto MA (27) registrou uma capacidade emulsificante máxima equivalente a 228ml óleo/100mg proteína de aveia modificada, que representou um pequeno aumento (14%) em relação a proteína não modificada. As propriedades emulsificantes da glicinina também apresentaram melhores resultados após a acetilação (23).

Além do efeito dos grupos neutros acetila no isolado modificado, com respeito a interação com a fase oleosa, um adicional aumento na interação entre óleo e proteínas acetiladas quando comparada com a proteína não modificada, pode ocorrer em conseqüência do desdobramento da cadeia polipeptídica causada pelas repulsões eletrostáticas na molécula protéica após acetilação.

3.6 – Atividade emulficante e estabilidade de emulsão

A atividade emulsificante e a estabilidade de emulsão do isolado modificado apresentaram pequenos incrementos com referência ao isolado não modificado, inclusive não sendo estas propriedades melhoradas em grande magnitude, em qualquer um dos graus de modificação estudados. Observou-se que os maiores aumentos da atividade emulsificante (10,44%) e da estabilidade de emulsão (5,84%) em relação ao isolado não modificado, ocorreram com o isolado acetilado a 83,2% e 91,1% respectivamente, a pH 8. Sendo estes incrementos estaticamente significativos ao nível de 5% de propabilidade (Tabelas 2 e 3).

FRANZEN e KINSELLA (16), pesquisando um concentrado protéico de folhas de alfafa, igualmente verificaram pequeno aumento (6,23%) na estabilidade de emulsão e nenhuma mudança na atividade emulsificante após a acetilação. Enquanto, SCHMANDLE et al. (35) observaram aumentos de apenas 12,5% (60,9 -68,5) na atividade emulsificante e um extraordinário crescimento de 60,4% (57,2-91,76) na estabilidade de emulsão em proteínas de feijão fava no mais alto nível de acetilação estudado (97%).

Resultados superiores aos obtidos com o isolado protéico de sementes de algaroba para ambas propriedades, atividade emulsificante (50,46%) e estabilidade de emulsão (35,70%), foram registrados por PONNAPALAM et al. (34) na investigação de um concentrado protéico de aveia acetilada.

3.7 – Propriedades espumantes

A capacidade espumante (Figura 6) do isolado modificado, igualmente ao isolado não modificado, sofreu marcante influência do pH. Verificou-se que a capacidade espumante das proteínas acetiladas aumentou progressivamente com o nível de acetilação nos diferentes valores de pH, com exceção do pH 5, em que não houve alteração. Esta constatação revela, portanto, que as proteínas permaneceram insolúveis no ponto isoelétrico. Nesse aspecto, o resultado diverge daquele relatado por KABIRULLAH e WILLS (21), quando observaram que o efeito acilante contribuiu para melhorar o desempenho da proteínas de girassol na formação de espumas nesta faixa de pH.

Semelhante à capacidade espumante, a estabilidade de espuma (Figura 7) aumentou progressivamente com o grau de modificação, com exceção das amostras modificadas a 91,1% a pH 7 e 8, que apresentaram um tempo de estabilidade abaixo do verificado no grau de modificação anterior (89,7%). Em pH 5 (ponto isoelétrico) não se verificou nenhuma mudança nos resultados das propriedades espumantes do isolado modificado, com referência ao isolado não modificado. A pH 3, obteve-se a espuma mais estável independente do grau de modificação.

A expansão de espuma (Figura 8), a exceção do pH 5, aumentou progressivamente conforme o grau da modificação protéica. Visto que a acetilação resulta da adição de grupos neutros acetila sobre a superfície das proteínas, estes podem atuar no incremento da expansão e estabilidade da espuma, pelo aumento da habilidade das proteínas de se concentrarem na interface ar-água.

A acetilação de um isolado protéico de girassol igualmente induziu o crescimento progressivo da expansão e da estabilidade de espuma, sendo que, no graus intermediário de modificação (53%) apresentou os melhores resultados com respeito ao comportamento destas propriedades (21). A acetilação também melhorou a capacidade de formar espumas da proteínas de aveia, mas diminuiu a sua estabilidade (27;20).

4 — CONCLUSÃO

O isolado protéico de sementes de algaroba, especialmente na forma modificada, apresentou potencial de utilização em alimentos elaborados, inclusive em produtos que exijam alta solubilidade dos ingredientes e em produtos com alta performance de emulsificação de óleo.

Pesquisas posteriores serão necessárias no sentido de relacionar a funcionalidade deste isolado com o desempenho em sistemas de alimentos específicos e de estudar o aspecto da viabilidade econômica da sua produção.

5 — REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

² Coordenadoria de Ciência e Tecnologia, Secretaria de Indústria, Com., Ciência e Tecnologia do Rio G. do Norte – Centro Administrativo. CEP 59059-900 Natal/RN, Fax [phone].

³ Depto. de Tecnologia Química e de Alimentos - UFPB Cidade Universitária – João Pessoa/PB.

⁴ Depto. de Medicina Veterinária – Campus Universitário, Patos/PB.

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Recebido para publicação em 03/01/97. Aceito para publicação em 04/12/97.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  14 Dez 2004
• Data do Fascículo
  Dez 1997

Histórico

• Recebido
  03 Jan 1997
• Aceito
  04 Dez 1997