Estrutura dos grânulos de amido de milho normal e ceroso

Study of the structure of the normal and waxy corn starch granules

ESTRUTURA DOS GRÂNULOS DE AMIDO DE MILHO NORMAL E CEROSO¹

FRANCO², Célia M. L. & CIACCO³, César F.

RESUMO

Visando obter informações a respeito da estrutura dos grânulos, amidos de milho normal e ceroso foram isolados e submetidos à ação da a-amilase e amiloglucosidase. Para elucidar a estrutura dos grânulos, os resíduos desta hidrólise foram submetidos à cromatografia de permeção em gel Sephadex G-50, diretamente e após sucessivas digestões enzimáticas com pululanase e b-amilase. Os resultados mostraram que existem diferenças nos resíduos dos amidos de milho ceroso e normal, tratados com a-amilase e amiloglucosidase. No resíduo do amido de milho ceroso, os perfis de eluição mostraram duas frações a 290 e 350 ml (picos I e II) respectivamente, que não eram suscetíveis ao ataque da a-amilase e amiloglucosidase, indicando que estas frações faziam parte das zonas cristalinas do amido. Estas frações também faziam parte das áreas cristalinas no amido normal. A presença do pico V à 390 ml na a-glucana do amido de milho normal sugeriu que além das duas frações não suscetíveis à hidrólise existia outra que também participava das zonas cristalinas deste amido como regiões não suscetíveis às enzimas formando, consequentemente, rede cristalina fortemente associada. A presença deste pico a 390 ml sugeriu arranjo cristalino distinto entre o amido de milho ceroso e o normal.

Palavras-chave: amido, estrutura, milho.

SUMMARY

STUDY OF THE STRUCTURE OF THE NORMAL AND WAXY CORN STARCH GRANULES. In order to obtain more information on the structure of corn starch granules, normal and waxy corn starches were both isolated and hydrolysed with a-amylase and amyloglucosidase. Sephadex G-50 gel-permeation chromatography of the a-glucan of normal and waxy corn starches was performed directly and after successive enzymatic digests with pullulanase and b-amylase. The results showed differences in the residues of the waxy and normal corn starches treated with a-amylase and amyloglucosidase. The elution patterns of the waxy corn starch residue showed two fractions at 290 and 350 ml (peak II and III) respectively, which were not susceptible to the a-amylase and amyloglucosidase attack indicating that these fractions took part in the waxy starch cristalline areas. These fractions also took part in normal starch cristalline areas. However, in addition to two chains not susceptible to hydrolysis, the presence of the peak V at 390 ml on the a-glucan of the normal corn starch suggested the existence of another fraction that also took part in normal corn starch cristalline areas forming tightly associated cristalline network. The presence of this peak at 390 ml suggested the distinct cristalline arrangement between the waxy and normal corn starches.

Key-words: starch, structure, corn.

1 — INTRODUÇÃO

Os estudos de estrutura dos grânulos de amido são de fundamental importância para o entendimento de suas propriedades funcionais.

A degradação enzimática dos grânulos de amido e o posterior estudo dos produtos formados e resíduos da hidrólise permitem obter informações a respeito da estrutura destes grânulos (3, 4, 5, 6, 7, 9).

A descoberta e utilização de enzimas desramificantes altamente purificadas que hidrolisam especificamente as ligações glicosídicas a(1-6), em combinação com métodos cromatográficos de separação dos produtos da digestão enzimática tem possibilitado o estudo mais detalhado da organização das cadeias de a -D-glucanas ramificadas e da amilopectina em particular (1, 12, 14, 15).

Diversos modelos de estrutura para a amilopectina foram postulados com relação ao modo como as cadeias estão arranjadas para formar uma estrutura altamente ramificada. O modelo "cluster" proposto por Robin et al. (14) e modificações dele (8, 11) tem sido considerado como a estrutura mais provável, apesar de ainda não estar esclarecido se se aplica a todas as amilopectinas, independente da fonte botânica (10).

Neste trabalho, a cromatografia de permeação em gel Sephadex G-50 foi usada como instrumento, objetivando estudar a estrutura fina dos amidos de milho normal e ceroso. Para isso, os resíduos da hidrólise enzimática destes amidos foram analisados diretamente e após sucessivas digestões enzimáticas com pululanase e b-amilase.

2 — MATERIAL E MÉTODOS

2.1 – Material

Amidos de milho normal e ceroso foram isolados em laboratório segundo o método de Watson (19). a-amilase de B. subtilis, amiloglucosidase de A. niger, b-amilase de batata doce e pululanase de E. aerogenes foram obtidas de SIGMA Chemicals Co. (USA). Sephadex G-50 foi obtido da PHARMACIA Fine Chemicals, (Sweden).

2.2 – Métodos

2.2.1 – Hidrólise enzimática dos amidos de milho normal e ceroso

A degradação enzimática dos amidos com a-amilase e amiloglucosidase foi realizada segundo Franco & Ciacco (3).

2.2.2 – Estrutura fina dos resíduos da hidrólise (a-glucanas dos amidos de milho normal e ceroso)

A estrutura fina das a-glucanas dos amidos de milho normal e ceroso foi estudada através de uma combinação da ação enzimática (pululanase e b-amilase) e cromatografia de permeação em gel Sephadex G-50, segundo metodologia descrita por Robin et al. (14), com modificações descritas no item 2.2.2.2.

Cada enzima utilizada (pululanase e b-amilase) foi diluída em tampão citrato-fosfato 0,05M, pH 5,2 e preparada de modo que cada ml da solução de enzima correspondesse a 1 unidade de pululanase e 110 unidades de b-amilase, respectivamente, considerando as unidades observadas nos rótulos das embalagens das mesmas.

Antes de qualquer ação enzimática com pululanase e/ou b-amilase, as a-glucanas dos amidos de millho normal e ceroso foram solubilizadas em água deionizada (0,25% p/v) a 100°C por 3 min. e submetidas à cromatografia como descrito em 2.2.2.2.

2.2.2.1. Hidrólise enzimática das a-glucanas dos amidos de milho normal e ceroso

Todas as digestões enzimáticas com pululanase e/ou b-amilase foram efetuadas utilizando-se as a-glucanas de amido de milho normal e ceroso, solubilizadas em tampão citrato-fosfato 0,05M a pH 5,2 a 100°C por 3 min. A mistura de reação foi incubada a 30°C por aproximadamente 24 h, quando o poder redutor, determinado segundo Somogy (18), tornou-se constante. A reação foi interrompida pelo aquecimento da mistura de reação a 100°C por 20 minutos.

2.2.2.1.1. Desramificação com pululanase (P₁)

A desramificação com pululanase (P₁) foi efetuada utilizando-se 16 ml de uma solução de a-glucana (1,25% p/v) em tampão citrato-fosfato 0,05M a pH 5,2 e 4 unidades de pululanase (4 ml da solução diluída de enzima).

2.2.2.1.2. Ação da b-amilase sobre as a-glucanas desramificadas (P_{1 b 1})

A ação da b-amilase sobre as a-glucanas desramificadas (P_1b1) foi efetuada pela adição de 110 unidades de b-amilase (1 ml de solução diluída de enzima) à 10 ml da solução de a-glucana desramificada (P₁).

2.2.2.1.3. Preparo das b-limite dextrinas (b₁)

A 36 ml de uma solução (1% p/v) de a-glucana em tampão citrato-fosfato foram adicionadas 440 unidades de b-amilase.

2.2.2.1.4. Desramificação das b-limite dextrinas com pululanase (b₁ P₁ )

A 20 ml da solução de b-limite dextrina (b₁), preparada como descrito em 2.2.2.1.3., foram adicionadas 4 unidades de pululanase.

2.2.2.1.5. Ação da b-amilase sobre as b-limite dextrinas desramificadas (b₁P_1b2)

A 10 ml da solução de b-limite dextrina desramificada, preparada como em 2.2.2.1.4., foram adicionadas 110 unidades de b-amilase.

2.2.2.2. Análises cromatográficas

As análises cromatográficas de permeação em gel foram realizadas segundo metodologia descrita por Robin et al. (14) com modificações.

Soluções das a-glucanas dos amidos de milho ceroso e normal antes e após ações enzimáticas com pululanase e/ou b-amilase foram submetidas a análises de cromatografia em coluna com Sephadex G-50 (2,5 X 100 cm) a 30°C. A eluição foi realizada em fluxo descendente usando tampão fosfato 10 mM, pH 7,0, contendo 0,02% de azida de sódio para evitar crescimento microbiano. A coluna foi calibrada com amilopectina de milho ceroso, purificada segundo metodologia descrita por Schoch (17) e desramificada com pululanase para obtenção do grau de polimerização (DP), que foi calculado como sendo a razão de carboidratos totais/ carboidratos redutores das frações em vários volumes de eluição. Antes de qualquer ação enzimática com pululanase e/ou b-amilase ser realizada, alíquotas de 4 ml de solução de a-glucanas (contendo cerca de 10 mg de polissacarídeo) foram introduzidas na parte superior da coluna e coletadas com auxílio de bomba peristáltica, o que permitiu um fluxo constante de 5 ml a cada 15 minutos. Para cromatografia das amostras submetidas a ação da pululanase e/ou b-amilase, alíquotas de 4 ml de solução de polissacarídeo (contendo cerca de 40 mg) foram introduzidas na coluna e as frações coletadas como descrito acima.

Nas frações coletadas, determinou-se o teor de açúcares totais através do método de fenol-sulfúrico de Dubois et al. (2) e os padrões de eluição obtidos representaram o peso de polissacarídeo recuperado em relação ao volume de eluição.

Para obtenção de medidas mais precisas do poder redutor nas cadeias mais longas da amilopectina desramificada, foi aplicada à coluna cromatográfica, 80 mg deste polissacarídeo.

3 — RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 – Hidrólise enzimática dos amidos de milho normal e ceroso

A suscetibilidade enzimática à ação da a-amilase e amiloglucosidase foi maior para o amido de milho ceroso como pode ser observado na Tabela 1. Sandsted, Kneen & Blish (16) observaram grandes variações na suscetibilidade ao ataque enzimático para amidos de milho de diversas fontes e perceberam que a digestibilidade não estava diretamente relacionada com o teor de amilose, mas eram decorrentes das diferentes estruturas dos grânulos de amido.

3.2 – Permeação em gel dos amidos de milho ceroso e normal submetidos a ação da a-amilase e amiloglucosidase (a-glucanas dos amidos).

O peso molecular máximo que permeia a partícula do gel Sephadex G-50 é de aproximadamente 10.000 (DP = 60), segundo catálogo da PHARMACIA (13). Assim, todo polissacarídeo com DP maior que 60 é excluído pela matrix do gel em um determinado v_o. As amostras de amidos de milho ceroso e normal foram excluídas pelo gel em v_o = 165 ml. A a-glucana do amido de milho ceroso apresentou dois pequenos picos a 290 e 350 ml, denominados pico II e III, respectivamente, além do pico I, a 165 ml, correspondente à população com DP > 60 (Figura 1a). Após calibração da coluna de Sephadex G-50 com amilopectina de milho ceroso purificada e desramificada com pululanase, observou-se que os picos II e III representavam duas distribuições de cadeias com DP de 25 e 11, respectivamente. Estas frações II e III seriam originárias da fração I e de suas frações associadas localizadas entre os picos I e II. O pequeno tamanho destes picos e a porcentagem de hidrólise verificada para este resíduo (56,28%) confirma a especificidade da hidrólise enzimática. A a-amilase rompendo as ligações a(1-4) ao acaso e produzindo substrato para que a amiloglucosidase atue a partir das extremidades das cadeias, forneceria, no final, um resíduo com um maior DP, representado pelo pico I e pequenas quantidades das frações II e III ao contrário do ácido que atuaria em todas as direções, inclusive nas zonas com alta densidade de ligações a(1-6), provocando a formação de maiores quantidades das frações II e III. Robin et al (14) encontraram um perfil semelhante para amido lintnerizado de batata. Para este amido, a partir de 2,6% de hidrólise, os picos II e III já eram perceptíveis.

Um padrão diferente daquele encontrado para a a-glucana do amido de milho ceroso foi encontrado para a a-glucana do amido de milho normal (Figura 1b) que mostrou um pico acentuado a 390 ml (pico V) com DP entre 7 e 8. O pico III observado no perfil da a-glucana do amido de milho ceroso também foi encontrado, porém muito levemente. O pico V seria também originário da população I e faria parte de uma fração mais resistente à hidrólise enzimática, como aconteceu com as frações II e III para o amido de milho ceroso.

Estes resultados sugerem uma diferença no modo de ataque das enzimas a-amilase e amiloglucosidase sobre os grânulos de amido de milho normal e ceroso. A presença dos picos I, III e V na a-glucana do amido de milho normal sugere que a hidrólise tenha ocorrido entre estas frações, em zonas mais suscetíveis ao ataque.

3.3 – Cromatografia em gel Sephadex das a-glucanas dos amidos de milho ceroso e normal após ação da pululanase e ação consecutiva da pululanase e b-amilase.

O padrão de eluição para a a-glucana do amido de milho ceroso após ação da pululanase (Figura 2a) mostra uma distribuição trimodal com frações nos picos A(DP = 11), B(DP = 45) e C(DP = 17). A pululanase hidrolisa as ligações a(1-6) não envolvidas na rede cristalina. Assim, estas três frações (A,B,C) representam cadeias de tamanhos diferentes envolvidas na rede cristalina. A ação consecutiva da pululanase e b-amilase (Figura 2b) transformou as cadeias das frações A, B e C em glicose, maltose e maltotriose (pico g). Estes resultados provam a linearidade de A, B e C, mas mostram que a pululanase não foi tão efetiva, já que uma pequena quantidade da fração I permaneceu após hidrólise da b-amilase, restando assim algumas b-limite dextrinas de alto peso molecular no pico D. A fração A que tem a mesma posição da fração III (350 ml) no amido de milho ceroso hidrolisado com a-amilase e amiloglucosidase, consiste de cadeias lineares de DP = 11 e as frações intermediárias B e C contém cadeias lineares de DP = 45 e 17 respectivamente. O pico D consiste de cadeias lineares e ramificadas de DP maior que 60 excluídas da matrix do gel. O aumento significativo do pico A, quando comparado ao pico III antes da desramificação, resulta da contribuição de cadeias lineares originárias da desramificação de algumas cadeias da fração I, fração associada entre I e II e fração II. Para a a-glucana do amido de milho normal a ação da pululanase mostrou também um perfil trimodal com as frações A, B e C (Figura 2c). O pico V apresentado antes da desramificação parece estar presente, apesar de não se apresentar como um pico bem definido. Estes resíduos são polímeros de cadeias retas como demonstra o padrão de eluição desta a-glucana após ação consecutiva da b-amilase (Figura 2d).

3.4 – Cromatografia em gel Sephadex das a-glucanas dos amidos de milho ceroso e normal após b-amilase, b-amilase e pululanase, e b-amilase, pululanase e b-amilase.

A ação da b-amilase sobre a a-glucana do amido de milho ceroso resultou na completa exclusão pelo gel da b-dextrina limite em v_o = 165 ml (Figura 3a, d, pico E) e o aparecimento dos produtos de reação em um pico bem definido a 425 ml (Fig. 3a, b, c, d, e, f, pico g). A ação consecutiva da pululanase sobre este resíduo mostrou o desaparecimento da b-limite dextrina indicando, que o encurtamento das cadeias da a-glucana do amido de milho ceroso com b-amilase propiciou a hidrólise total pela pululanase, resultando em um pico equivalente a maltose e maltotriose a 425 ml (pico g) e uma cauda entre 300 e 400 ml (Figura 3, b, e; cauda h). É possível que esses resíduos da cauda sejam provenientes de cadeias ramificadas do interior da molécula. A ação posterior da b-amilase transformou os resíduos da cauda nos produtos apresentados no pico g (Figura 3, c, f). Padrões cromatográficos análogos foram obtidos para a a-glucana do amido de milho normal.

4 — CONCLUSÃO

Foi possível concluir que existem diferenças nos resíduos dos amidos ceroso e normal tratados com a-amilase e amiloglucosidase. No resíduo do amido de milho ceroso apareceram duas frações a 290 e 350 ml (picos II e III; muito pequenos) que não são suscetíveis ao ataque da a-amilase e amiloglucosidase, indicando que estas frações fazem parte das zonas cristalinas do amido. Elas também fazem parte das áreas cristalinas do amido de milho normal. No entanto, a presença do pico V a 390 ml na a-glucana do amido de milho normal sugere que além das duas frações não suscetíveis à hidrólise, existiria outra que também participaria das zonas cristalinas do amido de milho normal. Não existem dados que nos permitam concluir se estas cadeias existiriam no grânulo, separadas das primeiras ou intercaladas por uma zona suscetível à hidrólise que, submetida à ação da a-amilase e amiloglucosidase, a separaria das demais. Independente desta observação, a presença do pico V a 390 ml sugere o arranjo cristalino distinto entre o amido ceroso e normal.

5 — REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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² Departamento de Engenharia e Tecnologia de Alimentos - IBILCE - UNESP - Caixa Postal 136 - CEP: 15054-000 - São José do Rio Preto, SP

³ Departamento de Tecnologia de Alimentos - Faculdade de Engenharia de Alimentos - UNICAMP - Caixa Postal 6121 - CEP: 13081-970 - Campinas, SP

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¹

Recebido para publicação em 23/05/97. Aceito para publicação em 04/12/97.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  14 Dez 2004
• Data do Fascículo
  Dez 1997

Histórico

• Recebido
  23 Maio 1997
• Aceito
  04 Dez 1997