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Modificações dos componentes de parede celular do melão tipo Galia durante a maturação

Cell wall components changes in 'Galia' melons during maturation

Resumos

O presente estudo caracterizou quantitativa e qualitativamente as mudanças nos componentes de parede celular do melão tipo Galia, híbrido Nun 1380, associadas ao processo de maturação. Os frutos foram avaliados em cinco estádios de maturação (I-V). O material de parede celular e suas frações foram determinados por gravimetria. Determinou-se o conteúdo de açúcares neutros na fração hemicelulósica e no resíduo celulósico, o teor de ácidos urônicos e o grau de esterificação na fração de substâncias pécticas, e o teor de cálcio total e ligado. A fração de substâncias pécticas foi submetida à cromatografia de filtração em gel e os açúcares neutros da fração hemicelulósica foram analisados por cromatografia a gás. O conteúdo do material de parede celular (MPC) mostrou pouca variação durante a maturação. O conteúdo de ácidos urônicos da fração péctica e o conteúdo de açúcares neutros na fração hemicelulósica (ramnose, arabinose e glicose) apresentaram tendência de redução com o avanço da maturação do fruto. Praticamente não houve variação para o grau de esterificação (% de esterificação) da fração de substâncias pécticas e para o teor de cálcio ligado. Houve redução no teor de celulose durante a maturação. A cromatografia em gel não revelou tendência de despolimerização das substâncias pécticas.

Cucumis melo; parede celular; substâncias pécticas; grau de esterificação


This research characterized changes in the cell wall components in ‘Galia’, hybrid Nun 1380 melons during maturation. Fruits were evaluated at five maturation stages (I-V). Cell wall material and their fractions were determined by gravimetry method. Neutral sugars in hemicellulosic fraction and cellulosic residue, uronics acids content in pectic fraction, degree of esterification, total calcium and bound calcium were analyzed. The pectic fraction was analyzed by gel chromatography and neutral-sugars in hemicellulosic fraction were analyzed by gas chromatography. Minimum variation during maturation was observed in the cell wall material. Neutral sugars (rhamnose, arabinose and glucose) and uronics acids contents decreased following maturation. No variation in the degree of esterification in pectic substances and bound calcium was observed. Gel chromatography did not reveal dispolymerization in pectic substances.

Cucumis melo; cell wall; pectic substances; degree esterification


MODIFICAÇÕES DOS COMPONENTES DE PAREDE CELULAR DO MELÃO TIPO GALIA DURANTE A MATURAÇÃO1 1 Recebido para publicação em 13/05/97; Aceito para publicação em 04/12/97.

MENEZES2 1 Recebido para publicação em 13/05/97; Aceito para publicação em 04/12/97. , Josivan B.; CHITARRA3 1 Recebido para publicação em 13/05/97; Aceito para publicação em 04/12/97. , Adimilson B.; CHITARRA3 1 Recebido para publicação em 13/05/97; Aceito para publicação em 04/12/97. , M. Isabel F. & BICALHO3 1 Recebido para publicação em 13/05/97; Aceito para publicação em 04/12/97. , Urquisa O.

RESUMO

O presente estudo caracterizou quantitativa e qualitativamente as mudanças nos componentes de parede celular do melão tipo Galia, híbrido Nun 1380, associadas ao processo de maturação. Os frutos foram avaliados em cinco estádios de maturação (I-V). O material de parede celular e suas frações foram determinados por gravimetria. Determinou-se o conteúdo de açúcares neutros na fração hemicelulósica e no resíduo celulósico, o teor de ácidos urônicos e o grau de esterificação na fração de substâncias pécticas, e o teor de cálcio total e ligado. A fração de substâncias pécticas foi submetida à cromatografia de filtração em gel e os açúcares neutros da fração hemicelulósica foram analisados por cromatografia a gás. O conteúdo do material de parede celular (MPC) mostrou pouca variação durante a maturação. O conteúdo de ácidos urônicos da fração péctica e o conteúdo de açúcares neutros na fração hemicelulósica (ramnose, arabinose e glicose) apresentaram tendência de redução com o avanço da maturação do fruto. Praticamente não houve variação para o grau de esterificação (% de esterificação) da fração de substâncias pécticas e para o teor de cálcio ligado. Houve redução no teor de celulose durante a maturação. A cromatografia em gel não revelou tendência de despolimerização das substâncias pécticas.

Palavras-chave:Cucumis melo, parede celular, substâncias pécticas, grau de esterificação.

SUMMARY

CELL WALL COMPONENTS CHANGES IN ‘GALIA’ MELONS DURING MATURATION. This research characterized changes in the cell wall components in ‘Galia’, hybrid Nun 1380 melons during maturation. Fruits were evaluated at five maturation stages (I-V). Cell wall material and their fractions were determined by gravimetry method. Neutral sugars in hemicellulosic fraction and cellulosic residue, uronics acids content in pectic fraction, degree of esterification, total calcium and bound calcium were analyzed. The pectic fraction was analyzed by gel chromatography and neutral-sugars in hemicellulosic fraction were analyzed by gas chromatography. Minimum variation during maturation was observed in the cell wall material. Neutral sugars (rhamnose, arabinose and glucose) and uronics acids contents decreased following maturation. No variation in the degree of esterification in pectic substances and bound calcium was observed. Gel chromatography did not reveal dispolymerization in pectic substances.

Key-words:Cucumis melo, cell wall, pectic substances, degree esterification.

1 — INTRODUÇÃO

O mecanismo que controla o amolecimento do melão não tem sido claramente definido. A maioria das pesquisas têm enfocado apenas o amadurecimento quando induzido pelo etileno (7, 41), sem detalhar o processo metabólico dos componentes estruturais da parede celular. A pectinametilesterase e a poligalacturonase, enzimas capazes de degradar as substâncias pécticas, encontradas na parede celular e na lamela média das células do parênquima de diversos frutos e hortaliças, não têm apresentado atividades substanciais durante o amadurecimento do melão.

Em melão reticulado ‘Perlita’, Lester e Dunlap (30) observaram que apenas a pectinameltilesterase e a celulase apresentaram atividade, sendo que a atividade de ambas permaneceu constante ou diminuiu durante o período de desenvolvimento e senescência, quando ocorreu redução significativa na firmeza do fruto.

As ligações cruzadas, envolvendo o cálcio com os polímeros da parede celular, têm sido citadas como o mecanismo que controla o amolecimento em tomate (40). Entretanto, em melão ‘Perlita’ os níveis de cálcio total e cálcio ligado permaneceram relativamente inalterados durante o período de 10-50 dias após a antese, indicando que a concentração deste elemento não esteve associada com o processo de amolecimento (30). A ausência de qualquer relação entre as principais enzimas de degradação da parede celular e o amadurecimento não exclui mudanças nos pesos moleculares dos polímeros de parede celular e re-arranjos estruturais como mecanismos que regulam o amolecimento do fruto.

Acredita-se que a solubilidade da pectina durante o amadurecimento do melão pode aumentar em função da clivagem de ligações entre pectinas e hemiceluloses (35). Além disso, Hinton e Pressey (23) e Ranwala, Suematsu e Masuda (43) relatam que b-galactosidases estão envolvidas na modificação dos componentes de parede celular durante o amadurecimento do melão.

As informações sobre os mecanismos que controlam o processo de amolecimento do melão ainda são limitadas e este conhecimento fornece base científica para os estudos de engenharia genética. Portanto, o presente estudo propõe-se caracterizar quantitativa e qualitativamente as mudanças nos polímeros de parede celular do melão tipo Galia, híbrido Nun 1380, associadas ao processo de maturação.

2 — MATERIAL E MÉTODOS

2.1 – Material

Utilizou-se o melão Galia, híbrido Nun 1380, obtido de plantio comercial instalado no Pólo Agrícola Mossoró-Assu-RN. Os tratamentos consistiram de cinco estádios de maturação em delineamento experimental inteiramente casualizado, com 8 repetições (1 fruto por parcela), totalizando 40 frutos no experimento.

2.2 – Extração do material de parede celular

A polpa do fruto na forma de cubos, correspondente aos estádios de maturação I-V (I- frutos verde-intenso com pedúnculo totalmente preso; II- frutos verde com início de descoloração e pedúnculo totalmente preso; III- fruto com pedúnculo em início de abscisão; IV- fruto com pedúnculo totalmente rachado, e V- fruto sem pedúnculo), foi congelada em nitrogênio líquido, embalada em sacos transparentes de polietileno de baixa densidade (27,0 cm X 31,0 cm) com fecho hermético e mantida a –18°C até ser submetida ao processo de extração.

A parede celular foi extraída do tecido do mesocarpo como descrito por Mitcham e McDonald (38), com poucas modificações. O mesocarpo (300 g) foi triturado em homogeneizador de tecidos (Polytron – Tekmar Company) com etanol 80% (300 mL). O resíduo foi lavado com tampão fosfato 50 mM, pH 6,8 (600 mL) e filtrado sob vácuo. Adicionou-se 200 mL de fenol:ácido acético:água (2:1:1) e manteve-se em repouso por 20 min. Lavou-se novamente o resíduo com tampão fosfato 50 mM, pH 6,8 (600 mL). A parede celular isolada foi submetida ao teste com KI/I2 para verificar a ausência de amido. Em seguida, foi sucessivamente lavada com clorofórmio:metanol -1:1 v/v – (200 mL) e acetona (3 porções de 200 mL), seguida de secagem sob vácuo a temperatura ambiente, constituindo-se o material de parede celular (MPC).

2.3 – Fracionamento da parede celular

O fracionamento da parede celular foi conduzido conforme metodologia adaptada de Ranwala, Suematsu e Masuda (43). O material de parede celular, resultante das 300 g de polpa utilizadas inicialmente, foi incubado com EDTA 0,5% em tampão fosfato 50 mM, pH 6,8 (200 mL) por 4 horas a 100°C, seguido de filtração. O extrato (designado fração solúvel em EDTA 0,5%) correspondeu as substâncias pécticas. O resíduo foi lavado extensivamente com água destilada (cerca de 2 litros) e incubado com KOH (24%) por 24 horas a 30°C, seguido de filtração. O extrato (designado fração solúvel em KOH) foi neutralizado com ácido acético glacial. Os polissacarídeos em cada fração (EDTA e KOH) foram precipitados com etanol 95% (200 mL) e os sistemas foram mantido sob repouso em geladeira por uma hora antes da filtração. Os filtrados foram submetidos à diálise com agitação ininterrupta por 72 h com 12 trocas de água destilada, seguido de liofilização por 72 h, obtendo-se assim as frações péctica e hemicelulósica. O resíduo resultante da incubação com KOH foi lavado com água destilada, aproximadamente 4 L e submetido à liofilização por 48 h, constituindo-se o resíduo final.

2.4 – Determinação de açúcares neutros na fração hemicelulósica

O conteúdo de açúcares neutros na fração hemicelulósica foi avaliado pelo método de antrona (50). Utilizou-se 2 mg da fração liofilizada a qual foi submetida à hidrólise por 1 h com ácido sulfúrico 72% (3 mL) em banho de gelo com agitação intermitente. Testes preliminares revelaram que não havia necessidade de tratar a amostra com ácido trifluoroacético (TFA) para solubilizar a hemicelulose e evitar a interferência da celulose. Tomou-se 0,5 mL do hidrolizado e diluiu-se para 2 mL com água destilada. Utilizou-se 0,1 mL para o doseamento através da curva padrão para o método de antrona.

2.5 Determinação de ácido urônico na fração péctica

O teor de ácidos urônicos na fração péctica foi monitorado pelo método do m-fenilfenol (m-hidroxibifenil) (8), partindo-se de 10 mg da fração liofilizada, a qual foi solubilizada em 50 mL de tampão acetato-EDTA – acetato de sódio trihidratado 50 mM, EDTA 20 mM, pH 6,0 contendo NaCl 10 mM. Tomou-se para o doseamento 0,3 mL do extrato.

2.6 – Determinação de celulose no resíduo final

Amostras (2 mg) do resíduo final, após liofilização, foram submetidas à hidrólise com ácido sulfúrico 72% (3 mL) em banho de gelo com agitação intermitente durante 1 h. Tomou-se 0,5 mL e diluiu-se para 2 mL com água destilada. O conteúdo de celulose das amostras foi determinado colorimetricamente pelo método de antrona, conforme Southgate (50), a partir de alíquotas de 0,1 mL, utilizando-se como padrão celulose microcristalina (Avicel – Merck). O padrão de celulose microcristalina foi preparado dissolvendo-se 10 mg em ácido sulfúrico 72% (3 mL), conforme esquema anterior e completando-se o volume para 100 mL com água destilada. As concentrações dos pontos da curva padrão foram similar aos utilizados para o método de antrona.

2.7 – Determinação do grau de esterificação – GE (%)

Foi determinado através da tomada (2 mg) de duas amostras da fração péctica. Uma das tomadas foi submetida à incubação por uma noite com 1 mL de NaBH4 (10 mg/mL em etanol 50%), seguida de neutralização com ácido acético glacial (até cessar a efervescência) e lavagens (3 vezes com 0,5 mL) com ácido acético-metanol (1:9) e depois com metanol. As duas amostras foram, então, dissolvidas em 3 mL de ácido sulfúrico (67%) gelado e analisadas para ácidos urônicos (31), partindo-se de 50 µL do extrato. A incubação com NaBH4 converte os resíduos galacturonosil esterificados à galactose e assim, a diferença no conteúdo de ácidos urônicos entre as amostras antes e depois da redução com NaBH4 representa a quantidade de ácido urônico que continha metil ésteres (26). O cálculo do grau de esterificação foi feito baseado na expressão adotada por Maness, Ryan e Mort (32):

GE (%) = [((ácido urônico total antes da redução) – (ácido urônico total após a redução))/(ácido urônico total antes da redução] x 100

2.8 – Determinação de Cálcio

O cálcio total e o cálcio ligado foram analisados usando-se 100 mg do mesocarpo liofilizado e 100 mg do material de parede celular, respectivamente, conforme Lester e Dunlap (30). A determinação foi feita pelo método de Jones e Isaac (25) a partir de 10 mL do extrato nitroperclórico + 10 mL de cloreto de estrôncio (SrCl2. 15000 ppm) com diluição para 100 mL usando-se água destilada.

2.9 – Cromatografia de filtração em gel e análise das frações pécticas da parede celular

A fração péctica (1,5 mg de ácido galacturônico) foi diluída em 3 mL de tampão acetato-EDTA (acetato de sódio trihidratado 50 mM, EDTA 20 mM) pH, 6,0 contendo NaCl 10 mM, seguido da aplicação. A filtração em gel dos poliuronídeos foi realizada em coluna (72 (1,8 cm) de Sephacryl S-200 (Pharmacia LKB), eluída com tampão acetato-EDTA (50 mM acetato de sódio trihidratado, EDTA 20 mM) pH, 6,0 contendo NaCl 10 mM. A calibração da coluna foi feita com ácido galacturônico (194 Da) e pectina cítrica. O volume vazio da coluna foi determinado com azul de dextran (2000 kDa). Os volumes de exclusão (V0) e total do sistema foram 118 mL e 290 mL, respectivamente. O fluxo do sistema foi ajustado para 0,3 mL por minuto. Após cada etapa de fracionamento fez-se a lavagem do sistema permitindo-se a passagem de 2 vezes o volume total. Frações de 3 mL foram coletadas e analisadas para ácidos urônicos (8) utilizando-se 0,5 mL do extrato eluído e diluindo-se para 1,0 mL com água destilada.

2.10 – Preparação da fração hemicelulósica para cromatografia gasosa

Esta preparação foi conduzida seguindo as recomendações de Albersheim et al. (3), conforme descrição a seguir:

2.10.1 – Hidrólise dos polissacarídeos

Colocou-se 5 mg da fração hemicelulósica em tubo de ensaio com tampa de rosca, adicionou-se 500 µL do ácido trifluoroacético 2 N, contendo 0,10 mg de inositol por mL. O tubo fechado foi aquecido por 1 h a 121°C. Esfriou-se e evaporou-se o TFA (Banho-maria 45°C em capela) e adicionou-se 0,5 mL de metanol. Evaporou-se o metanol por exaustão.

2.10.2 – Redução dos polissacarídeos

Adicionou-se 0,15 mL de hidróxido de amônia 1 N contendo aproximadamente 10 mg de borohidreto de sódio por mL. Misturou-se levemente e manteve-se à temperatura ambiente por uma hora. Adicionou-se algumas gotas de ácido acético p.a. até parar o barulho de efervescência e evaporou-se por exaustão. Acrescentou-se 0,5 mL de metanol : ácido acético (9:1). Secou-se e repetiu-se esta operação por 4 vezes. Adicionou-se 0,5 mL de metanol e Repetiu-se a operação por 5 vezes.

2.10.3 – Acetilação dos polissacarídeos

Adicionou-se 0,15 mL de anidrido acético p.a. e selou-se o tubo. Manteve-se a 121°C por 3 h. Após o retorno para a temperatura ambiente, secou-se por exaustão e adicionou-se 0,5 mL de metanol. Secou-se novamente por exaustão e repetiu-se por 2 vezes a última operação.

2.11 – Aplicação no cromatógrafo

Diluiu-se o resíduo final em 200 µL de acetona e injetou-se 2 µL, utilizando-se um cromatógrafo a gás equipado com coluna capilar OV-DB 225, medindo 0,25 mm de diâmetro interno e 25 m de comprimento. Usou-se nitrogênio e hidrogênio como gases de arraste. Adotou-se a sensibilidade 10-11 e atenuação 10-8 para a recepção dos impulsos elétricos do integrador Intralab 4290. As temperaturas da coluna, injetor e integrador foram, respectivamente, 210, 250 e 300°C. As condições de operação do sistema foram: Pressão da coluna, 21 psi; make up, 3,0 mL/minuto; Arraste, 30 mL/minuto; H2, 30 mL/minuto; Ar sintético, 300 mL/minuto. O Padrão foi composto de ramnose, fucose, arabinose, xilose, manose, galactose e glicose (Sigma Company), todos na mesma concentração (1 g/L). Usou-se como padrão interno o inositol. Os tempos de retenção (minutos) dos açúcares foram: Ramnose, 5,09; fucose, 5,35; arabinose, 6,53; xilose, 8,04; manose, 14,79; galactose, 16,14; glicose, 17,71 e inositol, 19,15.

3 — RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 – Avaliação quantitativa do material de parede celular

O conteúdo de material de parede celular (MPC) mostrou pouca variação (6,30 a 7,46 mg.g-1 de peso fresco) durante o amadurecimento (Tabela 1). Este comportamento reflete aquele reportado por Bianco e Pratt (7) durante o amadurecimento de melão cantaloupe ‘PMR 45’. O teor médio de material de parede celular de 6,96 mg.g-1 de peso fresco é similar ao reportado por Simandjuntak, Barrett e Wrolstad (48, 49) em melão ‘Honey Dew’ (cv. Volga) e em Cantaloupe (cv. Superstar) e é ligeiramente superior ao obtido por Rahman, Mosihuzzaman e Westerlund (42) para melão ‘Honey Dew’ (Bangi) cultivado em Bangladesh. A diferença poder ser atribuída, principalmente, à cultivar utilizada e às condições climáticas de cultivo. Naquele estudo os autores (42) expressaram o conteúdo de fibra da dieta na porção comestível como total de polissacarídeos não-amiláceos. Entretanto, como na polpa do melão o conteúdo de lignina encontrado foi muito baixo (0,01 %), procede a comparação feita acima.

O comportamento do material de parede celular durante a maturação de frutos é bastante diferente entre as espécies. Em manga, Mitcham e McDonald (38) verificaram redução de 21,5 mg.g-1 de peso fresco no estádio de maturação verde maturo para apenas 10,9 mg·g-1 no estádio supermaduro.

O teor médio da fração de substâncias pécticas solúvel em EDTA 0,5 % (FSP) foi da ordem de 158,9 mg.g-1 de material de parede celular. O estádio de maturação III apresentou o teor mais elevado enquanto que a solubilização mais baixa ocorreu nos dois últimos estádios de maturação. A variação de solubilidade da fração de substâncias pécticas observada, não é, obrigatoriamente, função de diferentes massas moleculares. Pode haver mudanças na estrutura da molécula durante a maturação ou rompimento de interações iônicas ou covalentes entre os polímeros da parede celular e, conseqüentemente, alterar a sua solubilização em EDTA 0,5%. Em relação ao resíduo celulósico, observou-se que os estádios de maturação I e III apresentaram os valores mais elevados, 321,8 e 286,8 mg·g-1 de MPC, respectivamente. O teor médio de resíduo celulósico foi de 278,4 mg.g-1 de tecido fresco (Tabela 1).

O resíduo celulósico representou a principal fração da parede celular, concordante com os resultados obtidos por Redgwell e Turner (44) no isolamento do material de parede celular do pericarpo de Solanum muricatum L. cv. El Camino.

Em se tratando do conteúdo da fração hemicelulósica no material de parede celular durante o amadurecimento, verificou-se tendência de redução até o estádio de maturação IV. O teor médio foi de 58,4 mg.g-1 de MPC. O estádio de maturação I apresentou o teor mais elevado (Tabela 1).

Houve diminuição no conteúdo de ácidos urônicos (µg·mg-1 de FSP) da parede celular com o avanço da maturação do fruto (Tabela 2).

Verificou-se reduções mais acentuadas entre os estádios de maturação III e IV (7,4 %) e IV e V (11,5 %). Estes resultados são semelhantes aqueles reportados por Simandjuntak, Barrett e Wrolstad (48) e indicam que a degradação de substâncias pécticas durante o amadurecimento do melão tipo Galia, híbrido Nun 1380, não é detectada pelo método de extração de McCready e McComb (36) como é comumente utilizado para outros frutos. Assim, a solubilização pode ser melhor discutida quando do fracionamento das substâncias pécticas.

Apesar do melão tipo Cantaloupe amolecer extensivamente durante o amadurecimento, relativamente, poucos trabalhos têm sido feitos para caracterizar as mudanças nos polímeros de parede celular durante este processo. As alterações nos componentes pécticos da parede celular observados neste estudo, podem explicar, em parte, a redução na firmeza da polpa.

Em alguns frutos, notadamente o morango (1) e o caqui (11) a solubilização de substâncias pécticas durante o amadurecimento não tem sido atribuída à atividade da poligalacturonase. Apesar do amolecimento, McCollum, Huber e Cantlife (35) também não detectaram atividade da poligalacturonase durante o amadurecimento de melão tipo Galia.

Outras hidrolases de parede celular têm sido reportadas como importantes no processo de amadurecimento dos frutos (20). A b-D-galactosidase é freqüentemente sugerida como envolvida no processo de amadurecimento de frutos, apesar de não estar claro que efeito os resíduos de galactose apresentam durante o amadurecimento (21). A habilidade da b-D-galactosidase para degradar e solubilizar pectinas pode explicar parcialmente como os frutos amolecem na ausência da poligalacturonase. Isto foi sugerido por Ranwala, Suematsu e Masuda (43) para melão, por Lan de Veau et al. (29) para abacate e por Ali, Armugan e Lazan (4) para manga. Outras alterações podem estar aliadas à despolimerização de pectina tais como: degradação das ligações estabilizadoras da estrutura da parede celular resultando em degradação dos polissacarídeos formadores. Além disso, McCollum, Huber e Cantlife (35) sugeriram que a solubilidade de pectina em melão pode estar também associada à clivagem de ligações entre pectinas e hemiceluloses.

Constatou-se tendência de redução nos açúcares neutros não celulósicos ligados à parede celular do fruto durante a maturação (Tabela 2) similar aos resultados encontrados por Simandjuntak, Barrett e Wrolstad (48). O estádio de maturação I apresentou 585,9 µg·mg-1 de fração hemicelulósica (FHEM), enquanto que o estádio de maturação V apresentou apenas 283,9 µg·mg-1 de fração hemicelulósica. Esta redução no teor de açúcares neutros não celulósicos durante a maturação do melão, juntamente com a redução de ácidos urônicos na fração péctica (já discutida) podem ser os principais fatores responsáveis pela desestruturação da parede celular. Isto pode, explicar, em parte, o amolecimento durante a maturação.

O teor de celulose da parede celular apresentou tendência de diminuição durante o amadurecimento (Tabela 2). Esta característica, juntamente com a redução nos teores de substâncias pécticas e hemiceluloses, possivelmente são as principais mudanças responsáveis pelo amolecimento do fruto durante a maturação. Recentemente, El-Zoghbi (16) verificou redução nos teores de celulose durante a maturação de manga var. zebda e var. Baladi, goiaba, tâmara e morango. A redução no teor de celulose foi acompanhada de aumento de atividade da celulase. Em melão, não existe informações acerca da investigação da atuação desta enzima durante o processo de amadurecimento.

3.2 – Cálcio e parede celular

Tradicionalmente, o cálcio tem sido analisado em tecidos de plantas por espectrofotometria de absorção atômica, após a transformação do tecido em cinzas e a dissolução ácida desta. Dado a carência de informações sobre a percentagem de cálcio no melão que está ligado à parede celular, neste trabalho, procurou-se avaliar o comportamento do cálcio.

Uma vez que o mesmo tem sido reconhecido como um importante fator no desencadear da maturação de frutos; assim, em frutos de tomateiro, o cálcio total do pericarpo mantêm-se constante ao longo do desenvolvimento, verificando-se no entanto, um decréscimo na razão cálcio ligado/cálcio livre à medida que o amadurecimento se aproxima. Frutos de mutantes de tomate, em que esta razão e o teor total de cálcio aumentam acentuadamente durante o desenvolvimento, nunca amadurecem (34, 37, 45).

A associação do cálcio com a parede celular de tecidos de plantas ocorre através dos efeitos de Donnan e das ligações iônicas entre os grupos carboxilas livres existentes nos polímeros de ácidos urônicos. Têm sido propostos vários modelos de ligação do íon à parede celular. Sentenac e Grignon (47) desenvolveram um modelo que requer o conhecimento dos parâmetros de Donnan e a constante de dissociação do carboxilato de cálcio. Bush e McColl (10) usaram um modelo de ação de massa mais simples que não requer estes parâmetros. Porém, ambos os modelos fazem referência a uma classe simples de sítios de ligações. Todavia, Baydoun e Brett (6) interpretaram análises curvilíneas Scatchard como evidências da alta e baixa afinidade dos sítios de ligação. Tu et al. (51) explicaram dados similares em termos de equilíbrio da ligação de cálcio à parede celular de batata. O modelo egg box da ligação do cálcio aos poligalacturonatos envolve equilíbrio positivo; todavia, o alto nível de esterificação de poliuronídeos em muitas paredes celulares pode ser responsável pela formação de extensivas zonas de ligação de egg box.

Em tecidos de planta o cálcio encontra-se normalmente na parede celular formando ligações entre resíduos de ácido galacturônico, o que é responsável pela união de cadeias pécticas adjacentes. O complexo cálcio-pectina atua como um cimento fornecendo firmeza ao tecido. A presença de cálcio em adição à insolubilidade do material péctico inibe a degradação dos tecidos pela poligalacturonase (9). Durante o processo normal de maturação dos frutos os cátions de cálcio são translocados para as zonas de crescimento da planta (Marschner 1978). Isto tem sido associado à solubilização de material péctico da lamela média, causando o amolecimento do fruto (17). Entretanto, neste experimento, verificou-se que o conteúdo de cálcio ligado a parede celular durante o amadurecimento permaneceu praticamente inalterado (Tabela 2). Isto pode explicar, em parte, a inatividade da poligalacturonase em melão. Por outro lado, percebeu-se uma redução bastante acentuada nos níveis de cálcio total durante a maturação do fruto (Tabela 2), notadamente entre os estádios de maturação I e II, onde a redução foi de 51,6%. O comportamento relativamente constante do teor de cálcio aderido à parede celular durante a maturação reflete aquele reportado por Lester e Dunlap (30) em estudo sobre as mudanças fisiológicas durante o desenvolvimento e amadurecimento de melão ‘Perlita’.

Os resultados não eliminam a hipótese de que a perda de firmeza do melão durante a maturação esteja diretamente associada com a concentração de cálcio ligado à parede celular. Durante o processo de homogeneização do tecido utilizado para o isolamento da parede celular há a possibilidade da complexação do cálcio por agentes quelantes tais como EDTA e, conseqüentemente, o teor de cálcio ligado na parede celular após o isolamento não refletir aquele do tecido original. Porém, a redução no teor de cálcio ligado durante a maturação já foi observada em tomate (46) por metodologia semelhante. Neste sentido, sugere-se que pesquisas futuras sejam desenvolvidas para as avaliações de cálcio solúvel e cálcio insolúvel, além de se investigar também as diferentes proporções de pectina de alta metoxilação, baixa metoxilação e protopectina.

3.3 – Esterificação das substâncias pécticas

O grau de esterificação [100 – AGNE (ácidos galacturônicos não esterificados)] ou o conteúdo de metil ésteres é importante parâmetro utilizado para a caracterização de pectinas.

Os resultados apresentados na Tabela 2 mostram pouca variação para o grau de esterificação (% de esterificação) da fração de substâncias pécticas durante o processo de maturação. Em geral, as substâncias pécticas apresentaram grau de esterificação em torno de 24% durante a maturação. Estes resultados sugerem que a atuação da pectinametilesterase durante o amadurecimento tem pouco significado para as mudanças que ocorrem na firmeza da polpa do fruto. A atividade da pectinametilesterase, que catalisa a desesterificação de poliuronídeos está presente durante o desenvolvimento e amolecimento de frutos e, freqüentemente, não mostra correlação com o processo de amolecimento (2). Os dados sugerem também que os grupos metil ésteres foram pouco afetados pela extração com EDTA 0,5%.

As propriedades de ligação de cátions às pectinas e aos seus fragmentos oligoméricos têm sido assunto de numerosas avaliações experimentais usando diferentes técnicas. Os resultados do comportamento do teor de cálcio ligado sugerem que existe uma ligeira associação com o grau de esterificação das substâncias pécticas. Apesar disso, outros fatores como, grau de densidade de cargas do polímero, grau de polimerização das cadeias pécticas (dp) precisam ser investigados para um melhor entendimento da ligação do cálcio à parede celular (22).

Tem sido sugerido que, pelo menos, dois grupos carboxilas livres adjacentes são necessários para ocorrer a ação da poligalacturonase. Esta característica para a desesterificação sugere que a hidrólise de pectina em tecidos de plantas pode ser controlada pela pectinametilesterase. Entretanto, não há evidências fortes de que a pectinametilesterase seja o fator controlador do amolecimento de frutos.

A pequena variação registrada no grau de esterificação é concordante com o comportamento do teor de cálcio ligado (Tabela 2) na parede celular da polpa do fruto. Em geral, poliuronídeos com elevado grau de esterificação podem formar apenas poucas ligações com cálcio e os complexos são móveis. Quando as moléculas são desesterificadas podem originar grupos carregados negativamente que se repelem entre si causando solubilização dos complexos. Poliuronídeos com baixo grau de esterificação formam elevado número de ligações com cálcio, dando origem a complexos estáveis, entretanto, quando desesterificados são fortemente afetados.

O mecanismo controlador da desesterificação de poliuronídeos durante o amadurecimento de frutos e hortaliças ainda não é claro e, especificamente, em melão, não existem informações na literatura acerca do seu estudo. De Vries et al. (13) sugeriram distribuição irregular dos grupos metoxil em poliuronídeos de maçã. Eles optaram por um modelo no qual as moléculas de ramnogalacturonanas eram formadas por homogalacturonanas e heterogalacturonanas (12, 15, 14). O grau de esterificação das regiões heterogalacturonanas foi quase 100 %, enquanto que as regiões homogalacturonanas (representando mais de 90 % dos resíduos galacturonatos) apresentavam esterificação de, aproximadamente, 70 %.

Nwanekezi, Alawuba e Mkpolulu (39) estudaram a caracterização de substâncias pécticas em diferentes frutos tropicais e chegaram a conclusão de que existia dois tipos de pectina – uma que apresentava grau de esterificação entre 60-75 % e outra entre 20-45 % de esterificação. Baseado nesta classificação, as substâncias pécticas do melão isoladas neste estudo podem ser classificadas como sendo de baixo grau de esterificação, a exemplo das pectinas de frutos tais como Clysophyllum aldidium, 8,68 %; caju (Anacardium occidentale L.), 25,93 %; laranja (Citrus sinensis), 36,37 %; goiaba (Psidium guajava), 40,26 %; banana (Musa sapientum), 46,68 % e abacate (Avocado avocado), 46,60%.

O comportamento relativamente constante do grau de esterificação das substâncias pécticas difere daquele reportado por El-Zoghbi (16) estudando as mudanças bioquímicas de alguns frutos tropicais durante o amadurecimento. Nesse trabalho, o amadurecimento de manga var. Zebda e var. Baladi, goiaba, tâmara e morango foi acompanhado de redução no grau de esterificação. Entretanto, no estudo conduzido por El-Zoghbi (16) e por outros autores (31, 5), o grau de esterificação foi determinado no material de parede celular (resíduo insolúvel em álcool). Neste trabalho utilizou-se a fração de substâncias pécticas (FSP, solúvel em EDTA 0,5%), o que parece mais indicado para a avaliação da esterificação. O grau de esterificação de substâncias pécticas de tomate solúveis em EDTA mostrou-se ligeiramente inferior aquele obtido a partir do resíduo insolúvel em álcool (18, 19). Estes autores também não verificaram mudanças significativas no grau de esterificação durante o desenvolvimento e amadurecimento.

O papel do grau de esterificação durante o amadurecimento de frutos e hortaliças tem sido freqüentemente questionado, pois ainda não está claro se o aumento ou diminuição pode explicar o amolecimento e a solubilização de pectinas. Alto nível de metil esterificação enfraquece as ligações iônicas dos polímeros pécticos com ligações de íons de cálcio divalente reduzindo a coesão das pectinas da lamela média. Knee et al. E Knee, Sargent e Osborne (27, 28) observaram aumento no grau de esterificação da pectina solúvel em água sem qualquer mudança na esterificação das substâncias pécticas da parede celular como um todo. Ele sugeriu que durante o amadurecimento uma nova pectina altamente esterificada é trocada pela pectina original da lamela média, que é degradada durante o processo.

Os valores do grau de esterificação encontrados neste trabalho são relativamente baixos. Isto pode, em parte, favorecer a ligação dos íons de cálcio divalente de acordo com o modelo egg box, e, conseqüentemente, a estrutura da parede celular torna-se mais estável durante o amadurecimento. Conforme Markovie e Kohn (33), nas substâncias pécticas com grau de esterificação superior a 40%, o cálcio intramolecular ligado eletrostaticamente, apresenta distribuição aleatória, enquanto que em substâncias pécticas com grau de esterificação inferior a 40%, a ligação eletrostática do cálcio muda para uma forma mais forte de ligação quelante. Estes autores tentam explicar a relação entre cálcio ligado e o grau de esterificação das pectinas, acrescentando que o coeficiente de atividade do cálcio é uma função complexa da densidade linear de cargas, isto é, da distância média entre dois grupos carboxílicos livres vizinhos.

3.4 – Distribuição da massa molecular dos poliuronídeos durante a maturação

A distribuição das massas moleculares dos poliuronídeos obtidos da fração de substâncias pécticas solúvel em EDTA 0,5 % (FSP) durante o amadurecimento do fruto praticamente não mostrou variação em função do estádio de maturação (dados não apresentados em função da constância no tamanho molecular do polímero). Os poliuronídeos foram eluídos próximo ao volume vazio (2000 kDa;) e apenas uma quantidade bastante reduzida foi eluída em frações posteriores. Apenas os estádios de maturação IV (fruto com pedúnculo totalmente rachado) e V (fruto sem pedúnculo) mostraram leve tendência de despolimerização dos poliuronídeos. Este comportamento assemelha-se aquele obtido por McCollum, Huber e Cantliffe (35) e suporta as evidências de que o processo de amolecimento do melão durante a maturação pode está relacionado com a clivagem de ligações entre hemiceluloses e pectina e não com a atividade da poligalacturonase e da pectinametilesterase como ocorre na maioria dos frutos.

O amolecimento durante a maturação pode também, em parte, ser atribuído à atividade de b-galactosidases como verificado por Ranwala, Suematsu e Masuda (43). Estes autores registraram redução no tamanho molecular dos polímeros pécticos durante o amadurecimento de melão ‘Prince’ após incubação da fração solúvel em EDTA, com b-galactosidases purificadas, por dois dias a 30°C. É importante salientar que a metodologia de extração dos polímeros pécticos adotada neste trabalho foi semelhante àquela utilizada por Ranwala, Suematsu e Masuda (43). É importante que pesquisas posteriores verifiquem o comportamento dos poliuronídeos através do fracionamento em outro tipo de coluna (por exemplo, S-300 ou S-400).

Estes resultados são concordantes com aqueles obtidos em morango por Huber (24) que verificou apenas ligeira degradação de substâncias pécticas durante o amadurecimento, sem, no entanto, detectar atividade de poligalacturonase.

3.5 – Composição em açúcares neutros da fração hemicelulósica

Os principais açúcares neutros encontrados na fração hemicelulósica solúvel em KOH 24% foram xilose, glicose e galactose, nesta ordem; a fucose representou o teor mais baixo (Tabela 3). Os níveis relativamente elevados de xilose, glicose e galactose na parede celular do melão tipo Gália, já haviam sido descobertos por McCollum, Huber e Cantliffe (35), entretanto, naquela pesquisa os autores encontraram valores inferiores, o que pode ser perfeitamente justificado pelo fato de que nesta pesquisa os valores são expressos em relação à fração hemicelulósica purificada. Além disso, utilizou-se material genético diferente. As principais alterações que podem auxiliar na interpretação do processo de amolecimento do fruto durante o armazenamento foram as reduções nos teores de ramnose, arabinose e glicose. Houve também redução nos teores de xilose e galactose, principalmente entre os estádios de maturação I – II e II – III, respectivamente. Houve também acúmulo de manose a partir do estádio III. Isto assemelha-se aos resultados publicados por Simandjuntak, Barrett e Wrolstad (49) os quais registraram redução nos teores de ramnose, arabinose, manose e galactose durante a maturação de melão ‘Honey Dew’ e cantaloupe.

O principal açúcar neutro presente na fração hemicelulósica foi a xilose. Isto assemelha-se aos resultados obtidos por Redgwell e Turner (44). Estes autores verificaram que a xilose é o componente predominante na fração hemicelulósica do pericarpo de Solanum muricatum L. cv. El Camino.

4 — CONCLUSÕES

As principais mudanças que explicam o processo de amolecimento do fruto foram: redução nos teores de ácido galacturônico e açúcares neutros (ramnose, arabinose e glicose) das frações de substâncias pécticas solúveis em EDTA 0,5% e hemicelulose solúvel em KOH 24%, respectivamente. Além dessas alterações, verificou-se também redução no teor de celulose.

5 — REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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2 Núcleo de Estudos em Pós-colheita – NEP – QTC – ESAM Mossoró-RN 59625-900 C.P. 137

3 DCA-UFLA Lavras – MG 37200-000 C.P.037

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    Recebido para publicação em 13/05/97; Aceito para publicação em 04/12/97.
  • Datas de Publicação

    • Publicação nesta coleção
      14 Dez 2004
    • Data do Fascículo
      Dez 1997

    Histórico

    • Aceito
      04 Dez 1997
    • Recebido
      13 Maio 1997
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