NOVAS APLICAÇÕES DE SISTEMAS SFE "HOME MADE".: I. PLANTAS MEDICINAIS BRASILEIRAS

NOVAS APLICAÇÕES DE SISTEMAS SFE" HOME MADE".

I. PLANTAS MEDICINAIS BRASILEIRAS¹

Fernando M. LANÇAS²,^*, Janete H.Y VILEGAS², Eliane C. VASCONCELOS², Renata M. S. CELEGHINI²

RESUMO

Neste trabalho, apresenta-se uma visão geral da evolução do uso da SFE (extração com fluido supercrítico) na análise de plantas medicinais brasileiras dentro das pesquisas desenvolvidas pelo Laboratório de Cromatografia do IQSC-USP. Utilizou-se como fluido extrator o CO₂, puro ou modificado com solventes de polaridade baixa a alta (pentano, solventes halogenados, álcoois, água), para a extração seletiva de princípios ativos de Maytenus aquifolium ("espinheira santa") e Mikania glomerata ("guaco"), respectivamente contendo triterpenos e cumarina. Os extratos obtidos por SFE foram analisados por CGAR (cromatografia gasosa de alta resolução), CLAE-DAD (cromatografia líquida de alta eficiência com detector "photodiodearray") ou CCD (cromatografia de camada delgada). A SFE forneceu resultados similares ou melhores do que os obtidos com métodos convencionais de extração (Soxhlet, maceração, etc), indicando o potencial uso da SFE para análise e/ou produção de preparações contendo estas plantas medicinais.

Palavras-chave: SFE (extração com fluido supercrítico), plantas medicinais, CGAR (cromatografia gasosa de alta resolução), CLAE-DAD (cromatografia líquida de alta eficiência com detector "photodiodearray", CCD (cromatografia de camada delgada)

SUMMARY

FURTHER APPLICATIONS OF "HOME MADE" SFE SYSTEMS. I. BRAZILIAN MEDICINAL PLANTS. In this paper, an overview on the evolution of the utilization of SFE for the analysis of Brazilian medicinal plants in the research developed by the Laboratório de Cromatografia, IQSC-USP, is presented. CO₂, pure or with modifiers from low to high polarity (pentane, halogenated solvents, alcohols, water) were used for the selective extraction of active compounds. Maytenus aquifolium (known popularly in Brazil as "espinheira santa"), and Mikania glomerata ("guaco"), containing respectively triterpenes and coumarin, were studied. The extracts obtained by SFE showed similar or better results than of those extracts obtained by conventional extraction methods (Soxhlet, maceration, etc.), which indicates the potential of SFE technique in the analysis and/or production of phytomedicines.

Keywords: SFE (supercritical fluid extraction); medicinal plants, HRGC (high resolution gas chromatography), HPLC-DAD (high performance liquid chromatography - photodiodearray detector, TLC (thin layer chromatography)

1 — INTRODUÇÃO

A SFE (extração com fluido supercrítico) ainda encontra como obstáculo à sua difusão, o custo relativamente alto da instrumentação envolvida. Em recente revisão, é apontado o fato de que muitos fornecedores de sistemas comerciais de SFE têm preferido aumentar o grau de sofisticação e automação e, consequentemente, os custos da técnica [1]. No entanto, os requisitos mínimos de um equipamento para SFE são relativamente simples e alcançáveis com recursos usuais, o que permite a construção de sistemas "caseiros" ("home made") a baixo custo, mas com a eficácia e reprodutibilidade necessárias para a obtenção de dados cientificamente confiáveis.

O Laboratório de Cromatografia do IQSC-USP foi pioneiro no Brasil na utilização da SFE como técnica analítica, a partir da construção de um sistema SFE" home made", nas próprias oficinas do IQSC-USP, destinado a extrações em escala analítica (na ordem de mg a g da amostra em estudo) [2]. Este equipamento apresenta como vantagens frente aos sistemas comerciais, o baixo custo e a flexibilidade de escolha do fluido extrator entre gases ou solventes líquidos à condições ambientes. Posteriormente, construiu-se um sistema destinado a extrações em escala semi-preparativa (ou seja, da ordem de alguns gramas da amostra), mas ainda mantendo a diretriz filosófica rumo a um custo baixo, mas aliado à simplicidade operacional e, principalmente, à confiabilidade dos dados obtidos [3]. Este segundo sistema foi concebido para o trabalho com produtos termolábeis, uma vez que a utilização de um banho de água para o aquecimento do fluido extrator acima da temperatura crítica limita a temperatura de trabalho à faixa abaixo de 100 ^oC. Uma melhoria introduzida é a possibilidade de extração nos modos estático, dinâmico e combinado (estático + dinâmico), graças à utilização de um sistema de válvulas que permite a operação deste equipamento em ambos os modos de extração, contrariamente à maioria dos equipamentos comerciais (limitados ao modo dinâmico).

No ESSPN’94 (I Encontro sobre Extração Supercrítica de Produtos Naturais) foram apresentadas algumas das aplicações destes dois sistemas de SFE no estudo de produtos naturais de origem vegetal [4, 5]. O presente trabalho faz uma revisão sobre os trabalhos do Laboratório de Cromatografia do IQSC-USP no estudo de produtos naturais, com ênfase para a análise de plantas medicinais brasileiras: "espinheira santa" (Maytenus aquifolium Martius, Celastraceae), e "guaco" (Mikania glomerata Spreng., Compositae). Estes trabalhos foram apresentados individualmente e de forma mais detalhada, nas referidas teses [6,7].

Maytenus aquifolium, assim como M. ilicifolia, têm comprovada ação farmacológica antiúlcera gástrica e contra gastrites, a qual está associada à presença de polifenóis e de triterpenos, sendo os principais a friedelina e o friedelan-3-ol (Figura 1) [8,9]. Já Mikania glomerata é usada como expectorante, devido à sua ação broncodilatadora, devida parcialmente à presença de cumarin [10].

R

1a H, b-OH friedelan-3-ol

1b = O friedelina

FIGURA 1. Triterpenos de Maytenus aquifolium

2 — MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 – Reagentes e solventes

Solventes grau p.a. (Merck): acetona, acetato de etila, ácido acético glacial, clorofórmio, diclorometano, hexano , metanol, pentano.

Solventes grau HPLC: acetonitrila (Merck ou Carlo Erba), água Milli-Q (Millipore)

Solventes grau técnico: etanol, tolueno, éter etílico.

Adsorventes: carvão ativo (Reagen, Rio de Janeiro), Florisil (Riedel - De Haën), silica gel (artigo 7734, para cromatografia em coluna e 60G, artigo 7731, para cromatografia em camada delgada, ambos Merck), Amberlite XAD-2 (Aldrich), Sep-Pak C-18 (Waters)

Gases: CO₂ liquefeito (Liquid Carbonic) nitrogênio (Aga ou White Martins),

Padrão: cumarina (Sigma)

2.2 – Mikania glomerata Spreng. ("guaco")

• Extração do material vegetal por SFE

Todo o material vegetal foi fornecido por Ana Maria Soares Pereira, da UNAERP (Ribeirão Preto, SP), tendo sido obtido por cultivo em Ribeirão Preto.

Um grama das folhas secas e moídas de guaco foi colocado na cela de extração (aço inox, 1 mm de espessura, 250 mm comprimento x 8 mm d.i.) do equipamento de SFE³. Foram utilizadas como misturas extratoras, CO₂ : etanol, em diferentes proporções (95:5; 90:10; 85:15) e CO₂ : etanol : H₂O (95:2,5:2,5). %). O volume total de fluido extrator utilizado foi de 500 mL. Utilizou-se CO₂ liquefeito nas extrações e nitrogênio para pressurização do sistema de extração. Trabalhou-se à temperatura de 60 ^oC (CO₂ : etanol 95:5 e 90:10) ou de 70 ^oC (CO₂ : etanol 85:15 e CO₂ : etanol : H₂O), pressão de 73 atm (exceto nas extrações com CO₂ : etanol : H₂O, realizadas à pressão de 84 atm) e tempo de extração de aproximadamente 20 min. O material foi coletado em um frasco vazio, imerso em banho de gelo. Os extratos brutos obtidos foram analisados por cromatografia em camada delgada (CCD). As extrações foram realizadas em triplicata.

• "Clean-up" dos extratos

Testou-se o uso de adsorventes convencionais (carvão ativo e Florisil) e de extração em fase sólida (C-18, XAD-2):

Carvão ativo: Uma pipeta do tipo Pasteur, com diâmetro interno de aproximadamente 1 cm, foi usada como coluna de vidro. Meio grama de carvão ativo foi colocado na coluna sobre 0,100g de sílica gel. Todo o material obtido por SFE foi diretamente introduzido no topo da coluna e os eluentes utilizados foram 10 mL de hexano, seguidos de 5 mL de clorofórmio. coletou-se uma única fração, a qual foi evaporada sob atmosfera de N₂. Para a análise cromatográfica, a amostra foi solubilizada em 5 mL de acetonitrila : água (40:60).

Florisil: Em uma pipeta do tipo Pasteur foi adicionado meio grama de Florisil previamente ativado a 140 ^oC por 12 horas. O extrato foi introduzida no topo da coluna e eluído com clorofórmio (1,5 mL) e, em seguida, com metanol (3,0 mL). Coletou-se uma única fração, a qual foi evaporada sob atmosfera de N₂. Para a análise cromatográfica, a amostra foi solubilizada em 5 mL de acetonitrila : água (40:60).

Extração em fase sólida (C-18): Adicionou-se 2 mL de água destilada ao extrato hidroalcoólico obtido por SFE; o extrato diluído foi percolado em cartucho Sep-Pak C-18 previamente condicionado, e eluido com os seguintes solventes : metanol (2,5 mL), acetona (1,0 mL), acetato de etila (1,0 mL) e clorofórmio (1,0 mL). Coletou-se uma única fração que foi evaporada sob atmosfera de nitrogênio. Para a análise cromatográfica, a amostra foi solubilizada em 5 mL de acetonitrila : H₂O (40:60).

Amberlite XAD-2: Adicionou-se 2 mL de água destilada ao extrato hidroalcoólico obtido por SFE; o extrato diluído foi percolado através de uma coluna do tipo Pasteur, contendo ca. 5 mL (correspondendo a 8 cm de altura) de resina Amberlite XAD-2 (previamente lavada exaustivamente com água destilada). A coluna foi lavada com 8 mL de água, para eliminação do material não retido, seguido de 5,0 mL de etanol para desorção da fração menos hidrofílica. A fração aquosa foi descartada e a fração etanólica foi coletada para posterior análise cromatográfica.

• Análise cromatográfica

CLAE (cromatografia líquida de alta eficiência): após a etapa de" clean-up", os extratos foram analisados em um cromatógrafo líquido LC-10 (Shimadzu) com detector U.V /Photodiodearray, a l = 274 nm, em coluna RP - 18 Supelco (250 mm x 4 mm d.i., partículas de 5 m m ), a 30 ° C, com fluxo de 1 mL/min e utilizando como fase móvel acetonitrila : água (40 : 60), no modo isocrático. o volume injetado de amostra foi de 20 mL.

CCD (cromatografia em camada delgada): Os extratos brutos obtidos foram analisados por CCD em sílica gel G (camadas de 0,25 mm de espessura), usando-se como eluente tolueno : éter etílico (1:1) saturado com ácido acético 10% e como revelador uma solução etanólica de KOH a 5% seguido de revelação (visualização da fluorescência) sob luz U.V. a 366 nm⁸. Utilizou-se cumarina como padrão.

2.3 – Maytenus aquifolium Martius ("espinheira santa")

• Extração do material vegetal por SFE

Todo o material vegetal foi fornecido por Ana Maria Soares Pereira, da UNAERP (Ribeirão Preto, SP), tendo sido obtido por cultivo em Ribeirão Preto.

As folhas secas e moídas de espinheira santa (2,5 g) foram extraídas no mesmo equipamento indicado no item 2.1. Utilizou-se CO₂ modificado com solventes orgânicos: etanol (10%, v/v), metanol (10%) ou pentano (10 ou 20%). O volume total de fluido extrator utilizado foi de 500 mL. Trabalhou-se à temperatura de 65 ^oC, pressão de 80 atm e tempo de extração de aproximadamente 15 min. Os extratos obtidos foram coletados em diclorometano grau analítico ou por resfriamento com gelo. As extrações foram realizadas entre 80 e 100 atm, entre 50 e 60° C.

• "Clean-up" dos extratos

Os extratos de espinheira santa necessitaram de "clean-up" antes da análise cromatográfica. Utilizou-se uma mini-coluna de Florisil (1,4 g, em pipeta tipo Pasteur) e clorofórmio (4 mL) como eluente, para 30 mg de extrato bruto. O solvente da fração coletada foi eliminado por evaporação, à temperatura ambiente, seguido de secagem sob vácuo e a temperatura ambiente até peso contante.

• Análise cromatográfica por CGAR (cromatografia gasosa de alta resolução)

As análises por CGAR foram realizadas no cromatografo a gás HP 5890 Série II, utilizando coluna LM-5 (5% fenil dimetil polisiloxano), 38m x 0,25mm d.i., espessura do filme de 0.35mm; injetor "split" (1:33), a 280° C; detector FID, a 320° C; programação de temperatura da coluna: 280^oC (22 min.), 280^oC - 300^oC (12^oC/min.), 300^oC (1 min.). Utilizou-se hidrogênio como gás de arraste, à velocidade linear média de 64 cm/s. Os dados foram obtidos em integrador HP 3396A. Os picos cromatográficos correspondentes à friedelina e ao friedelna-3-ol foram identificados por comparação com os tempos de retenção de amostras autênticas destes triterpenos.

3 — RESULTADOS E DISCUSSÃO

Há poucos relatos na literatura sobre a extração de várias classes de substâncias com polaridade de moderada a alta e de interesse farmacológico [1] . A baixa polaridade do CO₂ como fluido extrator é um fator limitante na extração de produtos naturais, mas que pode ser contornado pela utilização de solventes com diferentes polaridades, denominados co-solventes ou modificadores. No entanto, os sistemas para SFE comercialmente disponíveis apresentam limitações na utilização de modificadores: o procedimento mais usual é a mistura prévia do modificador no cilindro de CO₂. A grande desvantagem é a falta de flexibilidade operacional, pois seria necessário a troca de cilindro para se poder mudar o modificador utilizado; além disso, as opções comerciais de cilindros contendo CO₂ modificado ainda são restritas.

Os sistemas para SFE em escala analítica e semi-preparativa construídos no IQSC apresentam a grande vantagem da versatilidade no uso de diferentes modificadores. No estudo da "espinheira santa", optou-se por modificadores de polaridade baixa a intermediária, devido às características predominantemente de baixa polaridade tanto dos analitos de interesse como dos interferentes. Já no estudo do" guaco", os constituintes químicos menos polares já haviam sido eficientemente extraídos por SFE usando CO₂ ou hexano como fluidos extratores [9, 10] ; assim, os trabalhos aqui relatados com esta planta visavam prioritariamente as substâncias mais polares, com a conseqüente opção do uso de modificadores de alta polaridade (etanol, água).

3.1 –Extração de cumarina e constituintes polares do "guaco"

Todos os extratos brutos do "guaco" obtidos por SFE tiveram que ser analisados por CCD, devido à alta concentração de clorofila presente nestes extratos, o que inviabilizou a análise por CLAE. A realização de uma etapa de" clean-up" para eliminação de clorofila mostrou-se inviável: o" clean-up" com carvão ativo ou Florisil resultou em forte adsorção da cumarina; no uso de C-18, observou-se a perda da cumarina durante a etapa de concentração do eluato, devido à sua volatilidade. O "clean-up" utilizando XAD-2 não foi eficiente para eliminar a clorofila. Assim, os extratos obtidos foram analisados qualitativamente por CCD, pela qual constatou-se a presença de cumarina por comparação com um padrão.

A utilização de um modificador polar (etanol) não apresentou vantagens significativas em relação ao uso de CO₂ puro: neste último método verificou-se anteriormente a ausência de compostos de alto peso molecular (ex.: clorofila) através da análise por CGAR [9, 11], não requerendo uma etapa prévia de" clean-up".

3.2 – Extração de triterpenos da "espinheira santa"

As técnicas cromatográficas instrumentais podem ser de grande valia para o controle de qualidade de plantas medicinais e fitofármacos. Um exemplo é a identificação de amostras comerciais de plantas, para a qual são necessárias pequenas quantidades de material vegetal [10]. Visando o desenvolvimento de um método de controle de qualidade de espinheira santa, estudou-se vários fluidos extratores para a mesma.

A extração utilizando apenas CO₂ como fluido extrator não foi satisfatória, pois não extraiu as substâncias de interesse. Com o intuito de aumentar a polaridade e o poder de solvatação do CO₂, testou-se o uso dos modificadores. A modificação do poder de solvatação do CO₂ utilizando 10 e 20% de pentano não foi satisfatória para a extração dos triterpenos friedelan-3-ol e friedelina; já com o aumento da polaridade utilizando 10% de etanol ou metanol, os resultados obtidos foram satisfatórios. Os testes estatísticos (ANOVA, p = 0,05 e teste t de Student, p = 0,05) indicaram que o aumento da eficiência com a utilização de etanol foi significativo, sendo este o melhor modificador dentre os testados na extração da "espineira santa" (Tabela 1).

TABELA 1.
Concentração dos triterpenos nos extratos obtidos de folhas de Maytenus aquifolium por SFE, com o uso de diferentes fluidos extratores.

Fluido extrator	mg de triterpeno / g de pó da planta
	Friedelan-3-ol	Friedelina
CO2 - pentano 10%	9,80 ± 0,86	3,00 ± 0,90
CO2 - pentano 20%	11,00 ± 0,95	3,70 ± 0,98
CO2 - etanol 10%	15,20 ± 1,03	6,00 ± 0,97
CO2 - metanol 10%	12,00 ± 0,62	6,10 ± 0,75

(n > 3)

A Figura 2 apresenta os cromatogramas (CGAR-DIC) dos extratos obtidos por SFE a partir das folhas de Maytenus aquifolium. Observa-se que os perfis cromatográficos são semelhantes para os três modificadores utilizados, tendo sido constatadas apenas diferenças quantitativas (quantidade de triterpenos extraídos e de clorofila presente nos extratos).

FIGURA 2.
Perfis cromatográficos obtidos para os extratos

4 — CONCLUSÕES

Os resultados obtidos indicam que a SFE é uma técnica eficiente na extração de produtos naturais de polaridade baixa a moderada, como triterpenos e cumarinas. A utilização da SFE na obtenção de extratos polares tem como fatores limitantes as elevadas constantes críticas dos álcoois e da água e a baixa seletividade destes modificadores.

Considerando-se o tempo de análise e a possibilidade de automação, a SFE é uma alternativa aos métodos convencionais de extração para o preparo de amostras visando a análise cromatográfica da "espinheira santa" e do "guaco", especialmente para a análise de triterpenos tipo friedelano e de cumarina, respectivamente: os métodos convencionais (maceração, Soxhlet) requerem várias horas (até 24 h) de extração, enquanto que a SFE tipicamente situa-se na escala de minutos entre 20 a 40 minutos para uma extração exaustiva). No caso do guaco, contudo, a SFE parece ser limitada à análise quantitativa da cumarina nos extratos menos polares.

5 — REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] CHESTER, T.L. PINKSTON, J.D. RAYNIE, D.E. Supercritical Fluid Chromatography and Extraction. Anal. Chem 1996, 68, 487R - 514R.

[2] LANÇAS, F.M. DE MARTINIS, B.S. DA MATTA M.H.R., Supercritical fluid extraction (SFE) using an inexpensive "home made" system. J. High Resol. Chromatogr. 13, 838-839 (1990).

[3] SARGENTI, S.R. LANÇAS, F.M. Design and construction of a simple supercritical fluid extraction system with semi-preparative and preparative capabilities for application to natural products. J. Chromatogr. A 667, 213 - 218 (1994).

[4] LANÇAS, F.M. VILEGAS, J.H.Y. QUEIROZ, M.E.C. MARCHI E. de. Projeto, construção e aplicação de sistemas SFE "home made". I. Aplicações de um sistema analítico no estudo de produtos naturais de origem vegetal. Ciênc. Tecnol. Aliment. 14 (Supl.), 45 - 55 (1994).

[5] LANÇAS, F.M. VILEGAS, J.H.Y. SARGENTI, S.R. M. de MORAES, L. L de NOSSACK, A.C. Projeto, construção e aplicação de sistemas SFE "home made". II. Aplicações de um sistema semi-preparativo no estudo de produtos naturais de origem vegetal. Ciênc. Tecnol. Aliment. 14 (Supl.), 56 - 65 (1994).

[6] VASCONCELOS, E. C. Comparação entre métodos de extração," clean-up"e análise cromatográfica de friedelan-3-ol e friedelina em folhas de Maytenus aquifolium Martius [Celastraceae]. Dissertação de Mestrado, Universidade de São Paulo. São Carlos, 1996.

[7] CELEGHINI, R.M.S. Extração e análise cromatográfica (HPLC) de cumarinas em plantas medicinais brasileiras. Tese de Doutorado, Universidade de São Paulo. São Carlos, 1997.

[8] WAGNER, BLADT, H. S. ZGAINSKI, E. M. Plant drug analysis. Berlin, Springer, 1984. p.147-148.

[9] MARCHI, E. de Análise cromatográfica dos extratos hexânicos de Mikania glomerata Spreng. Dissertação de Mestrado, Universidade de São Paulo. São Carlos, 1994.

[10] VILEGAS, J.H.Y. MARCHI, E. de LANÇAS. F.M. Extraction of low-polarity compounds [with emphasis to coumarin and kaurenoic acid] from Mikania glomerata ("guaco") leaves. Phytochem. Anal., aceito (1997).

[11] VILEGAS, J.H.Y. MARCHI, E. de LANÇAS. F.M. Determination of coumarin and kaurenoic acid in Mikania glomerata ("guaco") leaves by capillary gas chromatography. Phytochem. Anal. 8, 74 - 77 (1997).

6 — AGRADECIMENTOS

Ao CNPq, CAPES e FAPESP, pelo financiamento e pelas bolsas de estudos concedidas. Aos funcionários da oficina mecânica do Instituto de Química de São Carlos, USP, pela construção e manutenção dos sistemas de SFE.

^*

A quem a correspondência deve ser endereçada.

¹

Recebido para publicação em 5/8/97. Aceito para publicação em 8/12/97

² Universidade de São Paulo, Instituto de Química de São Carlos, Caixa Postal 780, 13560-970, São Carlos, SP, Brasil.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  17 Dez 1998
• Data do Fascículo
  Dez 1997

Histórico

• Aceito
  08 Dez 1997
• Recebido
  05 Ago 1997