NOVAS APLICAÇÕES DE SISTEMAS SFE" HOME MADE".: II. PLANTAS DA AMÉRICA DO SUL

NOVAS APLICAÇÕES DE SISTEMAS SFE" HOME MADE".

II. PLANTAS DA AMÉRICA DO SUL¹

Fernando M. LANÇAS², ^*, Janete H.Y. VILEGAS², A.C. NOSSACK², Eliane C. VASCONCELOS², Renata M.S. CELEGHINI², E.A. CAPPELARO², D. von BAER³, A. ESCALONA⁴, M. HASEGAWA⁴

RESUMO

O Laboratório de Cromatografia do IQSC-USP tem desenvolvido pesquisas em conjunto com outros grupos de pesquisa do Brasil e da América Latina, visando a futura implantação da SFE (extração com fluido supercrítico) nestes laboratórios. No presente trabalho, apresenta-se alguns dos resultados obtidos na cooperação com pesquisadores do Chile e da Venezuela, direcionados para a SFE de substâncias de potencial interesse econômico, princípios ativos ou substâncias tóxicas: triglicerídeos, ácidos graxos, flavonóides, alcalóides, etc. Foram estudadas plantas nativas do Chile e da Venezuela, algumas delas nunca estudadas por métodos fitoquímicos convencionais e pertencentes a várias famílias vegetais: Leguminosae, Chrysobalanaceae, Annonnaceae, etc. O uso da SFE em conjunto com CGAR-EM (cromatografia gasosa de alta resolução - espectrometria de massas) ou CLAE-DAD (cromatografia líquida de alta eficiência com detector "photodiodearray") permitiu a identificação de algumas substâncias presentes em baixa concentração, a partir de pequenas quantidades de material vegetal; estes dados são de grande importância para a caracterização química das espécies estudadas.

Palavras-chave: SFE (extração com fluido supercrítico); produtos naturais; CGAR-EM (cromatografia gasosa de alta resolução — espectrometria de massas); CLAE-DAD (cromatografia líquida de alta eficiência — detector "photodiodearray".

SUMMARY

Further applications of "home made" SFE systems. II. South American plants. The Laboratório de Cromatografia, IQSC-USP, has been developing joint research projects with other research groups from Brazil and Latin America, aiming a future implementation of SFE (supercritical fluid extraction) in these laboratories. In the present work, some of the results obtained in the cooperation with researchers from Chile and Venezuela, focused to SFE of potential economical interest compounds, active compounds or toxic molecules, are presented: triglycerides, fatty acids, flavonoids, alkaloids, etc. Native plants from Chile and Venezuela, belonging to several families (Leguminosae, Chrysobalanaceae, Annonnaceae, etc.) were studied, some of them never studied by conventional phytochemical methods. The utilization of SFE along as HRGC-EM (high resolution gas chromatography - mass spectrometry) or HPLC-DAD (high performance liquid chromatography - diodearray detector) allowed the identification of some compounds, starting from small amounts of plant material; these data are of great significance to the chemical characterization of the studied species.

Keywords: SFE (supercritical fluid extraction); natural products; HRGC - MS (high resolution gas chromatography - mass spectrometry); HPLC-DAD (high performance liquid chromatography - photodiodearray detector

1 - INTRODUÇÃO

A SFE (extração com fluido supercrítico), apesar de seu grande potencial como técnica analítica¹, ainda é sub-explorada na América Latina. Um dos principais obstáculos à difusão desta técnica é o custo relativamente alto dos equipamentos comerciais para SFE. Como alternativa, o Laboratório de Cromatografia do IQSC-USP desenvolveu sistemas de baixo custo, fácil operação e adequados ao trabalho em escala analítica e semi-preparativa [2,3], os quais têm servido de modelo para a implementação de sistemas similares em vários laboratórios do Brasil e da América Latina. Neste último caso, o Laboratório de Cromatografia vem desenvolvendo pesquisas conjuntas em várias áreas, mas com ênfase ao estudo de produtos naturais de plantas com interesse alimentício, econômico ou medicinal.

As técnicas fitoquímicas convencionais de extração e purificação exigem o uso de quantidades relativamente altas de material vegetal (vários gramas ou mesmo quilos), para o estabelecimento da composição química de uma espécie, usualmente sem informações quantitativas sobre o teor de cada um dos constituintes químicos [4]. Além do gasto de tempo e material, estes procedimentos frequentemente mostram-se infrutíferos, ao levarem ao isolamento de substâncias já conhecidas e sem utilidade prática. Deve-se também lembrar que o estudo químico de qualquer espécie vegetal implica na coleta das partes de interesse, com redução por vezes nociva à sobrevivência do "indivíduo" (espécimen) da sua quantidade total de folhas, frutos, etc. ou mesmo na sua destruição. Outro fato é a redução progressiva de várias espécies, inclusive com risco de extinção, a qual impossibilita em alguns casos a coleta de material vegetal em quantidade suficiente para um estudo convencional.

Frente a este quadro, o uso de técnicas analíticas para o estudo de quantidades reduzidas (poucas gramas) de material vegetal é um caminho a ser explorado. A SFE pode contribuir como método de preparo de amostra eficiente e adequado tanto ao trabalho em pequena escala, como à obtenção de material a ser analisado em etapas posteriores por técnicas tais como a GC-EM (cromatografia gasosa - espectrometria de massas) ou a CLAE-DAD (cromatografia líquida de alta eficiência - detector" photodiodearray"), as quais podem fornecer informações estruturais mais detalhadas do que os detectores cromatográficos mais frequentemente utilizados e de menor custo (DIC, DEC, UV-Vis, etc) [5].

No presente trabalho, é apresentado um resumo dos resultados obtidos no estudo de plantas nativas do Chile e da Venezuela: Plinia pinnata (Myrtaceae), Lupinus spp. (Leguminosae-Papilonaceae), Caraipa spp. (Guttiferae), Hirtella spp. (Chrysobalanaceae) e Guatteria spp. (Annonnaceae) utilizando SFE em conjunto com CGAR-EM (cromatografia gasosa de alta resolução - espectrometria de massas) ou CLAE-DAD (cromatografia líquida de alta eficiência com detector "photodiodearray"). Parte dos resultados descritos no presente trabalho foram apresentados individualmente e de forma mais detalhada, em outras publicações ou reuniões científicas [6-8].

O gênero Lupinus inclui algumas espécies comestíveis, conhecidas no Brasil como "tremoço". O teor de proteínas em sementes de Lupinus é comparável ou superior ao de outras espécies da família Leguminosae, como por exemplo a soja; porém, a presença de alcalóides, alguns deles tóxicos, é um fator limitante ao uso do lupino [9, 10]. Em nosso Laboratório, a SFE foi estudada como método de remoção dos alcalóides, usando CO₂ puro ou modificado com solventes polares (álcoois, água). Os extratos obtidos foram caracterizados por CGAR-EM (cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas) e quantificados por CGAR-DIC (cromatografia gasosa - detector de ionização de chama), tendo-se comparado os extratos obtidos por SFE e por extrações convencionais (maceração - sonicação).

O interesse em Plinia pinnata deve-se a ensaios farmacológicos preliminares que indicaram atividade hipotensora do extrato metanólico das folhas. Um estudo químico preliminar indicou a presença de terpenos, taninos e flavonóides, tendo sido determinada a estrutura de alguns flavonóides [11]. Finalmente, amostras de espécies dos gêneros Annonnaceae, Chrysobalanaceae e Guttiferae, coletadas na Amazônia venezuelana como parte de um trabalho de levantamento sistemático da flora da Venezuela, foram também analisadas por SFE-GC-EM ou SFE-CLAE-DAD "off line", pois algumas destas espécies nunca foram estudadas anteriormente por métodos fitoquímicos convencionais.

2 — MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 – Reagentes e solventes

Solventes e reagentes grau p.a. (Merck ou Reagen): ácido clorídrico, ácido fosfórico, acetona, clorofórmio, diclorometano, hidróxido de sódio, isopropanol, metanol, pentano, sulfato de sódio anidro.

Solventes grau HPLC: metanol (Merck ou Carlo Erba), água Milli-Q (Millipore).

Solventes grau técnico: etanol.

Adsorventes: Extrelut 20 (Merck), silica gel (artigo 7734, para cromatografia em coluna, Merck).

Gases: CO₂ liquefeito (Liquid Carbonic) nitrogênio (Aga ou White Martins),

2.2 – Equipamento - SFE

Em todas as extrações do tipo SFE, utilizou-se um equipamento construido na oficina mecânica do IQSC-USP e préviamente descrito na literatura [3]. O fluido extrator foi pressurizado com nitrogênio e utilizou-se como fluido extrator CO₂ liquefeito, puro ou modificado.

2.3 – Extração por SFE dos alcalóides de Lupinus spp.

Trabalhou-se com sementes descascadas, secas em estufa a 40^oC, moídas e tamizadas; utilizou-se o material entre 70 - 100 mesh. Foram estudadas amostras chilenas (Lupinus albus, L. mutabilis e L. sp.) e também uma amostra de Lupinus sp., adquirida no comércio em São Paulo.

O material vegetal (0,5 g) foi colocado na cela de extração (aço inox, 1 mm de espessura, 250 mm comprimento x 8 mm d.i.) do equipamento de SFE³. Utilizou-se como fluidos extratores as seguintes misturas: CO₂ : etanol, CO₂ : metanol e CO₂ : isopropanol, em diferentes proporções (95:5; 90:10; e 85:15), ou CO₂ modificado com 5% H₂O, no modo dinâmico (20 minutos de extração cada); CO₂ modificado com 10% etanol, no modo sequencial (15 minutos no modo estático seguido de 15 minutos no modo dinâmico). O volume total de cada mistura extratora foi de 500 mL. As extrações foram realizadas a 75 ^oC, exceto para a extração CO₂ - 5% H₂O, realizada à temperatura de 90^oC. Os extratos foram coletados em um frasco vazio, imerso em banho de gelo. O solvente foi evaporado em rotaevaporador, e o material foi submetido a" clean-up" visando posterior análise cromatográfica. Todas as extrações foram feitas em triplicata, quando havia material disponível.

2.4 – Extração por métodos convencionais dos alcalóides de Lupinus spp.

• Método 1: Ultra-som e extração líquido-líquido

O material vegetal (1,0 g) foi sonicado (1,0 min.) em presença de 8,0 mL de HCl 0,1 N. O material foi centrifugado (3500 rpm, 15 min.) e o sobrenadante foi transferido quantitativamente para um balão volumétrico, adicionando-se NaOH 3 N até pH maior que 10. Completou-se o volume a 25,0 mL com água destilada. Uma alíquota (20,0 mL) foi submetida a extração líquido-líquido com diclorometano (10,0 mL, três vezes). As frações orgânicas foram reunidas, secas com Na₂SO₄ anidro e filtradas, eliminando-se o solvente em rotaevaporador à pressão reduzida. O material obtido foi diretamente analisado por CGAR-DIC ou CGAR-EM.

• Método 2: Ultra-som e extração em fase sólida

O material foi extraído sob sonicação e alcalinizado conforme descrito no Método 1. Para a etapa de concentração dos alcalóides, seguiu-se o procedimento descrito na literatura para a extração em Extrelut 20 [9]. O material obtido foi analisado por CGAR-DIC e CGAR-EM.

2.5 – Extração por SFE de Plinia pinnata

Trabalhou-se com folhas secas de Plinia pinnata (Myrtaceae), coletadas na região amazônica venezuelana, pelo Prof. Anibal Castillo (Universidade Central de Venezuela). O material vegetal foi submetido a SFE sequencial, no modo dinâmico, com CO₂ e CO₂ modificado, utilizando-se sucessivamente os seguintes modificadores: 5% pentano; 5 % CHCl₃; 5% acetona; 5 e 10% metanol. Os extratos vegetais foram coletados em CHCl₃, à temperatura ambiente. Após secagem, os extratos foram submetidos a análise cromatográfica por CLAE

2.6 – "Screening" por SFE de plantas venezuelanas

Amostras de folhas de Caraipa spp (Guttiferae), Hirtella spp. (Chrysobalanaceae) e Guatteria spp. (Annonnaceae) foram submetidas a SFE seqüencial, no modo dinâmico, seguindo o mesmo procedimento descrito para Plinia pinnata. Os extratos vegetais foram coletados em CHCl₃, à temperatura ambiente. Após secagem, os extratos foram submetidos a análise cromatográfica preliminar por CCD e/ou CLAE

2.7 – "Clean-up" dos extratos

• Plinia pinnata

Após eliminação do solvente utilizado para SFE, os extratos foram dissolvidos em 5,0 mL de metanol e percolados através de uma coluna de vidro contendo na base 0,5 g de silica gel 60 (Merck, 70 - 230 mesh) e 0,5 g de carvão ativo no topo. O eluato foi coletado e o solvente evaporado ao ar livre. As frações coletadas foram analisadas separadamente por CLAE.

• Plinia pinnata (Método 2) e Lupinus spp.

Os extratos foram submetidos a extração em fase sólida, utilizando cartucho tipo C-18 (Sep-Pak, Waters), eluindo-se sucessivamente com metanol, acetona e clorofórmio (8,0 mL cada). As frações coletadas foram analisadas separadamente por CGAR-DIC ou CGAR-EM (Lupinus spp.) ou CLAE (Plinia pinnata).

2.8 – Análises cromatográficas (CGAR-EM)

Os extratos obtidos por SFE de Lupinus spp. foram analisados por CGAR-EM em cromatógrafo a gás HP 5890 Série II acoplado a detector seletivo de massas HP 5970, utilizando coluna LM-5 (5% fenil dimetil polisiloxano, 50 m x 0,25 mm d.i. x 0,65 mm; fornecida por L & M, São Carlos, SP); injetor" split" (1:30), a 300° C; temperatura da interface, 300° C; programação de temperatura da coluna: 170^oC - 300^oC (6^oC/min.), 300^oC (5 min.); hélio como gás de arraste (velocidade linear média = 45 cm/seg.) Os dados foram processados em CPU HP7946/HP 9000-300. A identificação das substâncias foi feita por comparação com dados da literatura¹⁰ .

2.9 – Análises cromatográficas (CLAE-DAD)

Os extratos de Plinia pinnata foram analisados em um cromatógrafo líquido LC-10 (Shimadzu) com detector U.V /Photodiodearray, a l = 230 e 254 nm, em coluna RP - 18 Supelco (250 mm x 4 mm x 5 mm ), a 30 ° C, com fluxo de 0,9 mL/min e utilizando como fase móvel metanol - H₃PO₄ 5% 65:35 (v/v), modo isocrático. o volume injetado de amostra foi de 20 mL, "loop" (Rheodyne). Os espectros UV foram comparados com o de amostras autênticas de substâncias isoladas de P. pinnata ¹¹.

3 — RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1– Extração dos alcalóides de Lupinus spp [6,7].

Na maioria absoluta dos procedimentos ensaiados, a SFE apresentou maior rendimento do que os métodos convencionais de extração de alcalóides. A exceção foi o uso de CO₂ modificado com H₂O: o rendimento final dos extratos foi afetado pela necessidade de uma etapa adicional para eliminação da água (por extração em fase sólida). Além disso, o extrato SFE CO₂-H₂O continha substâncias que acarretaram a produção de espuma (possivelmente saponinas), com consequentes problemas de entupimentos nas extrações no modo dinâmico; este inconveniente pôde ser sanado pela adoção do modo combinado (SFE dinâmico, seguido do modo estático) para as extrações utilizando H₂O como modificador.

O maior número de alcalóides foi obtido por SFE utilizando CO₂ - etanol 10% (Figura 1 e Tabela 1). Alguns dos alcalóides de Lupinus são apresentados na Figura 2. As análises quantitativas (CGAR-DIC), referentes ao teor de lupanina, multiflorina e de um derivado da esparteína, indicaram variações individuais na concentração destes alcalóides, com o uso de diferentes fluidos extratores: o maior teor de lupanina foi encontrado no extrato obtido com CO₂ modificado com 5% de água; no caso da multiflorina, os rendimentos foram similares com CO₂ modificado com 5% H₂O e etanol 10%; finalmente, nem todos os métodos utilizados possibilitaram a extração do derivado da esparteína, tendo sido verificado o melhor rendimento no uso de CO₂ modificado com 10% metanol.

FIGURA 1.
Cromatograma (TIC/CGAR-EM) da fração de alcalóides obtida por SFE CO₂ - etanol 10% (amostra comercial de Lupinus). Para identificação dos picos, ver Tabela 1.

Os dados quantitativos do estudo de Lupinus spp. são apresentados na íntegra em trabalhos anteriores [6,7].

TABELA 1.
Identificação dos picos do cromatograma (TIC/CGAR-EM) da fração de alcalóides obtida por SFE CO2 - etanol 10% (amostra comercial de Lupinus), apresentado na Figura 1

Pico	tr (min)	Identificação tentativa	principais fragmentos(m/z; abundância relativa)
1	4,077	Hidrocarboneto	55(100)-56(100)-57(79)-60(67)-58(58)-69(42)
2	4,582	Ácido carboxílico	60(100)-55(60)-73(56)-57(34)-56(31)-61(31)
3	5,485	Ácido carboxílico	60(100)-57(66)-73(64)-55(51)-69(26)-61(25)
4	7,976	Ácido carboxílico	57(100)-73(31)-58(22)-69(19)-55(19)-60(17)
5	11,018	não identificado	73(100)-87(53)-57(52)-69(31)-55(30)-74(27)
6	11,645	Ácido carboxílico	60(100)-73(74)-57(51)-47(31)-71(26)-55(25)
7	16,044	Ftalato	149(100)-57(61)-69(40)-55(31)-77(18)-131(14)
8	16,912	Éster	74(100)-87(56)-55(43)-69(41)-75(29)-57(28)
9	17,458	Ácido Carboxílico	60(100)-73(89)-55(79)-69(68)-57(63)- 71(39)
10	20,002	Hidrocarboneto	55(100)-69(74)-74(53)-84(36)-57(31)-96(31)
11	20,598	Hidrocarboneto	55(100)-69(69)-57(44)-83(39)-73(34)-67(31)
12	22,905	Alcalóide	58(100)-72(24)-55(22)-69(22)-71(22)-57(19)
13	23,075	Lupanina	136(100)-55(66)-149(46)-98(35)-150(33)-97(28)
14	23,536	Derivado da esparteína	98(100)-55(82)-69(68)-73(51)-57(38)-67(30)
15	23,628	Hidrocarboneto	55(100)-69(73)-57(41)-67(37)-83(35)-73(31)
16	24,622	Ácido hexanodióico, dioctil éster (contaminante)	129(100)-57(88)-55(68)-70(52)-71(49)-83(32)
17	25,571	Alcalóide	58(100)-71(24)-72(10)-55(9)-69(6)-73(5)
18	25,819	Hidrocarboneto	55(100)-69(78)-73(76)-57(65)-96(45)-81(36)
19	26,294	Alcalóide	55(100)-57(88)-69(75)-98(70)-74(60)-84(57)
20	26,954	Ftalato	149(100)-57(55)-71(32)-55(29)-70(28)-167(27)
21	28,660	Ácido carboxílico	73(100)-55(72)-69(66)-96(56)-131(52)-57(40)
22	29,350	Hidrocarboneto	55(100)-69(60)-57(48)-67(40)-81(40)-98(36)

FIGURA 2.
Estrutura de alguns dos alcalóides de Lupinus.

3.2 – Estudo de Plinia pinnata⁸

Neste trabalho, procedeu-se à extração SFE-CO₂ e CO₂ modificado com metanol, em diferentes porcentagens: este modificador apresentou os melhores resultados para a extração de flavonóides, dentre os testados (pentano, clorofórmio, acetona e metanol). Os extratos obtidos com o uso de CO₂ modificado tiveram que ser submetidos a "clean up" para remoção de clorofilas. Testou-se o uso de carvão ativo e de uma fase C-18 (cartuchos tipo "Sep-Pak"), tendo estes últimos apresentado melhores resultados: o carvão ativo reteve de forma irreversível parte dos analitos de interesse, especialmente flavonóides.

Através dos espectros DAD-UV e por comparação com padrões, constatou-se no material obtido por "clean-up" em fase C-18 (Figuras 3 e 4) a presença dos flavonóides miricetina-3-rhamnosídeo (1a, Figura 5) e miricetina (1b, espectro UV na Figura 4) nos extratos obtidos com CO₂ modificado com 5 e 10% de metanol, além de um diidroflavonol. Estas substâncias foram anteriormente encontradas em Plinia pinnata [11], através de técnicas fitoquímicas usuais.

FIGURA 3.
Cromatograma (CLAE/DAD-UV) de um extrato de Plinia pinnata, obtido por SFE CO₂ - metanol 5% e submetido a "clean-up" em fase C-18 (Sep-Pak), em diferentes comprimentos de onda. Condições cromatográficas e identificação dos picos: vide texto.

FIGURA 4.
Espectro UV-DAD correspondente ao pico em t_R = 3,85 min (substância 1b, ver também Figura 4) do cromatograma apresentado na Figura 2.

FIGURA 5.
Estrutura dos flavonóides de Plinia pinnata lupaninamultiflorina

3.3 -– "Screening" por SFE de plantas venezuelanas

No estudo químico de plantas desconhecidas, uma abordagem usual é a extração dos constituintes químicos através do uso de solventes, em uma sequência de polaridade crescente, o que permite a caracterização de grandes grupos (quanto à polaridade) de constituintes químicos. A SFE sequencial (extrações sucessivas de uma amostra com CO₂ e CO₂ modificado com solventes orgânicos, em uma sequência de polaridade crescente) também segue esta filosofia, com a vantagem de poder ser utilizada para a extração de uma quantidade reduzida de amostra (neste caso, cerca de 1 g de material vegetal seco). Outras vantagens da SFE como método de extração para o "screening" químico de plantas são: a maior rapidez, em comparação com uma sequência de extrações sucessivas convencionais por maceração e/ou Soxhlet; a obtenção de extratos que podem ser analisados por CGAR-EM ou CLAE-DAD, após uma etapa de "clean-up" no caso de extratos contendo clorofilas.

4 — CONCLUSÕES

A SFE mostrou-se adequada ao estudo químico rápido de pequenas quantidades de material vegetal; a economia de material vegetal e de tempo é de grande importância nos estudos preliminares realizados com espécies cuja composição química ainda não é estabelecida, como foi o caso de várias das amostras da Amazônia Venezuelana, estudadas neste trabalho.

No caso específico do estudo de Lupinus spp., o uso de diferentes modificadores possibilitou a extração dos responsáveis pelo amargor característico das sementes, o que indica o potencial uso da SFE no aproveitamento econômico do lupino.

Os resultados obtidos nestes trabalhos conjuntos do Laboratório de Cromatografia do IQSC-USP com Universidades do Chile e da Venezuela estão embasando a implantação de sistemas "home made" nestas Universidades fora do Brasil, visando a futura continuidade do uso da SFE.

5 — REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] CHESTER, T.L. PINKSTON, J.D. RAYNIE, D.E. Supercritical Fluid Chromatography and Extraction. Anal. Chem 1996, 68, 487R - 514R.

[2] LANÇAS, F.M. DE MARTINIS B.S., MATTA, M.H.R. da Supercritical fluid extraction (SFE) using an inexpensive "home made" system. J. High Resol. Chromatogr. 13, 838 - 839 (1990).

[3] S.R. Sargenti, F.M. Lanças, Design and construction of a simple supercritical fluid extraction system with semi-preparative and preparative capabilities for application to natural products. J. Chromatogr. A 667, 213 - 218 (1994).

[4] J.B. Harborne, Phytochemical Methods. 2nd. Ed. Chapmand and Hall, London (1984).

[5] W.K. Modey, D.A. Mulholland, M.W. Raynor, Analytical supercritical fluid extraction of natural products. Phytochem. Anal. 7, 1 - 15 (1996).

[6] A.C. Nossack, Extração com fluido supercrítico e análise cromatográfica (HRGC-FID e HRGC-MS dos alcalóides de Lupinus spp. Dissertação de Mestrado, Universidade de São Paulo. São Carlos, 1996.

[7] J.H.Y. Vilegas, A.C. Nossack, D. von Baer. F.M. Lanças. SFE and chromatographic analysis (HRGC-FID and HRGC-MS) of alkaloids from Lupinus spp. In.: P. Sandra, G. Devos (Eds.), Proceedings of the 18th International Symposium on Capillary Chromatography. Hüthigh-IOMPS, Kortrijk (1996), p.1830 - 1841.

[8] F.M. Lanças, J.H.Y. Vilegas, M.S. Galhiane, R.M. dos Santos, A. Escalona, J. Mendez. Extracción de la fracción de flavonoides de Plinia pinnata, haciendo uso de fluidos supercriticos. Anais do VI Congresso Latinoamericano de Cromatografia, Caracas, Venezuela (1996), 25-D10.

[9] M.M. Carasco, Alcalóides y compuestos fluorescentes en semilla de lupino. Tese de Doutorado, Universidade de Concepción. Concepción, 1993.

[10] C. Meissner, M. Wink. GC-MS analyse von alkaloiden nordamerikanisher lupinen. In: M. Wink (Ed.), Lupinen 1991 - Forschung, Anbau und Verwertung. Universität Heidelberg (1991), p.91 - 129.

[11] J. Méndez, M. Hasegawa, A.R. Bilia, I. Morelli, 5, 7, 2’, 5’- tetrahydroxydihydroflavonol - 3 - rhamnoside from Plinia pinnata. Phytochemistry 36, 1087 - 1088 (1994).

6 — AGRADECIMENTOS

Ao CNPq, CAPES e FAPESP, pelo financiamento e pelas bolsas de estudos concedidas. Aos funcionários da oficina mecânica do Instituto de Química de São Carlos, USP, pela construção e manutenção dos sistemas de SFE.

³

Universidade de Concepción, Facultad de Farmácia, Concepción, Chile.

⁴

Universidade Central de Venezuela, Facultad de Ciências, Caracas, Venezuela.

^* A quem a correspondência deve ser endereçada.

¹ Recebido para publicação em 5/8/97. Aceito para publicação em 8/12/97

²

Universidade de São Paulo, Instituto de Química de São Carlos, Caixa Postal 780, 13560-970, São Carlos, SP, Brasil.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  17 Dez 1998
• Data do Fascículo
  Dez 1997

Histórico

• Aceito
  08 Dez 1997
• Recebido
  05 Ago 1997