Atividade antioxidante do beta-caroteno e da vitamina A. Estudo comparativo com antioxidante sintético

beta-carotene and vitamin A antioxidant activity. Comparative study with synthetic antioxidant

Resumos

Foi avaliada a atividade antioxidante da vitamina A na forma de acetato de retinol e de seu principal precursor, o beta-caroteno, adicionados a um sistema de óleo de soja previamente sensibilizado à oxidação. Os parâmetros utilizados como grau de atividade oxidativa foram: índice de peróxidos, teores de malonaldeído durante os intervalos de 24 a 72 horas, e perfil dos ácidos linoléico e linolênico após 144 horas de oxidação. Pelos resultados pode-se verificar que o retinol apresentou atividade antioxidante superior ao beta-caroteno. As determinações das atividades antioxidantes foram comparadas à do butilhidroxitolueno (BHT). A eficiência antioxidante da vitamina A e do beta-caroteno foram proporcionais às suas resistências à decomposição no sistema oxidativo. O acetato de retinol, a exemplo do BHT, mostrou uma rápida interação com os radicais ativos, pois já no início de sua adição ao óleo de soja, reduziu o nível da oxidação em relação ao respectivo controle.

beta-caroteno; vitamina A; acetato de retinol; atividade antioxidante

In soybean oil suceptible to oxidation the authors studied the antioxidant activity of the vitamin A as retinol acetate and the beta-carotene was studied. The oxidation index of the system was determined by peroxide and malonaldehyde values during the intervals from 24 to 72 hours and profile of the linoleic and linolenic acids after 144 hours of oxidation. It was observed that the retinol acetate had an antioxidant activity greater than beta-carotene. The antioxidant activity of retinol acetate and beta-carotene were compared to the butyl hidroxi toluene (BHT) and was observed that the antioxidant efficiency was directly proportional to degradation resistance of them in the oxidative system. The retinol acetate, as such BHT, showed a fast interaction with actives radicals, in the beginning of the addition to the soybean oil, reducing the oxidation level when compared to the control.

beta-carotene; vitamin A; retinol acetate; antioxidant activity

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DO b-CAROTENO E DA VITAMINA A. ESTUDO COMPARATIVO COM ANTIOXIDANTE SINTÉTICO¹

José Afonso PASSOTTO², Marilene De Vuono Camargo PENTEADO², Jorge MANCINI-FILHO²

RESUMO

Foi avaliada a atividade antioxidante da vitamina A na forma de acetato de retinol e de seu principal precursor, o b-caroteno, adicionados a um sistema de óleo de soja previamente sensibilizado à oxidação. Os parâmetros utilizados como grau de atividade oxidativa foram: índice de peróxidos, teores de malonaldeído durante os intervalos de 24 a 72 horas, e perfil dos ácidos linoléico e linolênico após 144 horas de oxidação. Pelos resultados pode-se verificar que o retinol apresentou atividade antioxidante superior ao b-caroteno. As determinações das atividades antioxidantes foram comparadas à do butilhidroxitolueno (BHT). A eficiência antioxidante da vitamina A e do b-caroteno foram proporcionais às suas resistências à decomposição no sistema oxidativo. O acetato de retinol, a exemplo do BHT, mostrou uma rápida interação com os radicais ativos, pois já no início de sua adição ao óleo de soja, reduziu o nível da oxidação em relação ao respectivo controle.

Palavras-chave: b-caroteno; vitamina A, acetato de retinol; atividade antioxidante.

SUMMARY

b-CAROTENE AND VITAMIN A ANTIOXIDANT ACTIVITY. COMPARATIVE STUDY WITH SYNTHETIC ANTIOXIDANT. In soybean oil suceptible to oxidation the authors studied the antioxidant activity of the vitamin A as retinol acetate and the b-carotene was studied. The oxidation index of the system was determined by peroxide and malonaldehyde values during the intervals from 24 to 72 hours and profile of the linoleic and linolenic acids after 144 hours of oxidation. It was observed that the retinol acetate had an antioxidant activity greater than b-carotene. The antioxidant activity of retinol acetate and b-carotene were compared to the butyl hidroxi toluene (BHT) and was observed that the antioxidant efficiency was directly proportional to degradation resistance of them in the oxidative system. The retinol acetate, as such BHT, showed a fast interaction with actives radicals, in the beginning of the addition to the soybean oil, reducing the oxidation level when compared to the control.

Key-words: b-carotene, vitamin A, retinol acetate, antioxidant activity.

1 - INTRODUÇÃO

Um dos principais problemas na conservação dos alimentos lipídicos é o desencadeamento do processo oxidativo, que resulta na produção de odores e sabores desagradáveis, tornando os alimentos inadequados para o consumo. Como resultado da reação entre o oxigênio e os ácidos graxos insaturados ocorre a formação de compostos de baixo peso molecular, os quais são os principais responsáveis pelo desenvolvimento de odores indesejáveis. Como exemplo, o hexanal, produto da oxidação do ácido linoléico é um composto que está relacionado ao sabor de ranço dos alimentos; a quantidade de 2x10-⁶% desta substância já é suficiente para que ocorra a presença de odores característicos da rancidez (12).

Os ácidos graxos, insaturados particularmente o oléico, o linoléico e o linolênico, são os que se destacam da fração lipídica, por serem facilmente oxidados (21) sendo o número de insaturações nas moléculas correspondentes, um fator decisivo para a velocidade da reação (7). Os óleos comestíveis por conterem uma grande porcentagem dos ácidos oléico, linoléico e linolênico são os mais susceptíveis aos processos oxidativos.

A reações oxidativas levam à diminuição do valor nutricional pois os ácidos graxos essenciais (linoléico e linolênico) são os primeiros a serem oxidados, produzindo diversos compostos como aldeídos, cetonas, álcoois e hidrocarbonetos que são potencialmente tóxicos (18).

Antioxidantes sintéticos como o butilhidroxianisol (BHA) e o butilhidroxitolueno (BHT) são normalmente utilizados nas indústria de óleos e de derivados lipídicos. Entretanto, estes compostos podem apresentar alguns inconvenientes; estudos têm demonstrado que essas substâncias podem causar efeitos adversos em animais, como por exemplo hemorragia massiva nas cavidades pleurais e peritoneais (19) ou extensa proliferação de células no pulmão, com mudanças bioquímicas, atuando como agente promotor no desenvolvimento de adenoma (23). Devido a estes inconvenientes, nos últimos anos tem havido a preocupação de se obter substâncias naturais que tenham a mesma função e eficiência dos antioxidantes sintéticos.

Os ácidos graxos insaturados também podem ser oxidados por ação direta do oxigênio singlet, formando peróxidos e hidroperóxidos (10).

FOOTE & DENNY (5), atribuíram ao b-caroteno a capacidade de reprimir a formação de oxigênio singlet. O b-caroteno mostrou ação supressora dos radicais ativos pelo bloqueio do oxigênio singlet, quando adicionado em sistema contendo óleo de soja, reduzindo o nível da oxidação (14, 20). DAS & PEREIRA em 1990 (3) estudando o uso de antioxidantes naturais em óleos comestíveis, observaram que a vitamina A e seus análogos, retinal, ácido retinóico, acetato e palmitato de retinol, mostraram efeitos antioxidantes expressivos, podendo ser usados como uma alternativa na inibição da peroxidação lipídica.

PASSOTO et al 1995 (15), em trabalho anterior, verificaram a resistência de diversos carotenóides obtidos a partir de tomates, abóbora e batata doce. Neste estudo foram observadas diferenças significativas dos carotenóides frente a oxidação.

O presente trabalho teve como objetivo verificar a atividade antioxidante do b-caroteno e da vitamina A quando adicionados ao óleo de soja, comparando a eficiência de suas atividades antioxidantes a um antioxidante sintético, o butilhidroxitolueno (BHT).

2 - MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 - Materiais

O _-caroteno e o butilhidroxitolueno (BHT) foram adquiridos da Sigma, enquanto que a vitamina A, na forma de acetato de retinol, foi adquirida da Merck. O óleo de soja sem antioxidantes sintéticos foi fornecido pela SANBRA (Sociedade Algodoeira do Nordeste Brasileiro). O peróxido de térciobutila, o tetraetoxipropano e os padrões de ácidos graxos foram adquiridos da Sigma e o ácido tiobarbitúrico foi obtido da Aldrich Chemical Company, Inc.

2.2 - Métodos

2.2.1 - Ativação do óleo de soja

O óleo de soja foi ativado com peróxido de térciobutila (0,4%) e 3% de uma solução de cloreto férrico 100 mM, ficando sob agitação durante 1 hora. Após este período, este óleo foi submetido ao aquecimento à 65°C em banho-maria por 24 horas (17). O intervalo de 0 a 24 horas, foi necessário para a ativação do óleo de soja, permitindo com isso diminuir o período de indução do processo oxidativo.

2.2.2 - Ensaio com o óleo de soja ativado

A oxidação do óleo de soja foi monitorada pela determinação do índice de peróxido, na qual se utilizou 1g de amostra diluída em clorofórmio ,adicionada de ácido acético e iodeto de potássio. O iodo liberado foi titulado com uma solução de tiossulfato de sódio e os resultados expressos com µg de oxigênio em 1g de óleo como descrito pela American Oil Chemistry Society 1980 (1). A determinação do malonaldeido também foi utilizada na avaliação da oxidação, tomando-se 1g do óleo de soja e associando-a ao ácido tiobarbitúrico após a conveniente extração. A cor rósea-avermelhada foi medida em espectrofotometro marca Spectronic, mod 20D em 530 nm e os resultados foram comparados com uma solução padrão de tetraetoxipropano (22).

Na determinação da composição dos ácidos graxos, amostras de 50mg do óleo de soja foram metiladas segundo HARTMAN & LAGO, 1973 (8) e 2 a 3µl foram injetados em cromatógrafo a gás, modelo CG 500 com detector de ionização de chama, dotado de coluna capilar medindo 12 metros de comprimento e 0,25mm de diâmetro interno, contendo como fase estacionária polietileno glicol (Carbowax 20m). As condições operacionais foram temperatura inicial 130°C durante 5 minutos com programação de acréscimo de 3°C/min. até 210°C. O gás de arraste empregado foi hidrogênio com fluxo de 1mL/min. Utilizou-se como padrão interno o ácido heptanóico e os tempos de retenção de cada pico, foram comparados com os picos do cromatograma de padrões de ésteres metílicos de ácidos graxos, realizado nas mesmas condições descritas anteriormente. O cálculo das áreas foi feito por um integrador CG-300.

2.2.3 - Quantificação dos antioxidantes no óleo de soja

A quantificação da vitamina A e seu principal precursor foi efetuada a partir das absorbâncias máximas de cada componente, obtidas no espectro de absorção visível e UV, utilizando a seguinte fórmula:

Os valores dos coeficientes de extinção (E^1%_1cm) utilizados no cálculo, foram os citados por DAVIES (4).

2.2.4 - Solubilização do b-caroteno e da vitamina A no óleo de soja

Estabelecida a concentração do b-caroteno e da vitamina A através da quantificação, evaporou-se os solventes (éter de petróleo ou o hexano), em rotaevaporador. O óleo de soja sem antioxidantes, ativado por 24 horas quando adicionado, tornava-se miscível com o b-caroteno e com o acetato de retinol que possuem características hidrofóbicas. O BHT, que é obtido em forma cristalina foi pesado e adicionado diretamente ao óleo de soja.

2.2.5 - Degradação do b-caroteno e da vitamina A durante a oxidação

Alíquotas de 0,5 ml do óleo de soja ativado nos intervalos de 24, 48 e 72 horas foram transferidas para balões volumétricos de 100, 50 e 25ml, cujos volumes foram completados com éter de petróleo ou hexano. A quantificação do acetato de retinol e do b-caroteno foi realizada conforme descrito anteriormente.

2.2.6 - Análise estatística

Na avaliação estatística dos resultados foi empregado o teste de Tukey-Kramer, nos resultados obtidos em cinco experimentos.

3 - RESULTADOS E DISCUSSO

O óleo de soja possui uma grande quantidade de tocoferóis totais, os quais apresentam-se como antioxidantes naturais, tornando desta forma interferentes neste estudo. Com o objetivo de inativar os tocoferóis, o óleo de soja foi submetido a tratamento térmico, sendo a inativação dos tocoferóis evidenciada através de análise colorimétrica (24).

Na Tabela 1 pode-se verificar que não houve alteração percentual dos ácidos graxos do óleo de soja tratado e não tratado termicamente, já que as diferenças foram inexpressivas.

Pelos resultados da Tabela 2, verificou-se que o óleo de soja adicionado de b-caroteno apresentou os índices de peróxidos reduzidos em relação ao respectivo controle, considerando as medidas de 72 horas. Quanto aos teores de malonaldeído, não houve diferenças significativas entre as soluções adicionadas de b-caroteno com as soluções controle. Estes resultados sugerem que a eficiência do b-caroteno neste sistema não foi muito expressiva, embora apresentasse atividade antioxidante no intervalo de 48 horas. O acetato de retinol reduziu de forma acentuada o nível da oxidação nos dois experimentos, conforme mostra a Tabela 3. O BHT na concentração de 100 ppm reprimiu de forma mais eficiente a formação de peróxidos e de malonaldeído (Tabela 4).

Na Figura 1 pode-se verificar que o b-caroteno se degradou numa velocidade superior ao acetato de retinol durante o estímulo oxidativo do óleo de soja. Em estudos anteriores com outros carotenóides foi possível caracterizar interação dos carotenóides com os radicais ativos formados, e quanto menor o nível de degradação, maior a capacidade de interação (15).

A estabilidade dos carotenóides também foi estudada por KOPAS-LANE & WARTHENSEN em 1995 (11), que analisaram a foto sensibilidade dos carotenóides durante o armazenamento à baixas temperaturas.

Os resultados apresentados na Tabela 3 demonstram que o acetato de retinol reduziu a formação de peróxidos e malonaldeído já no início da adição no óleo de soja, havendo portanto, uma rápida interação com os radicais ativos. BURTON, 1989 (2) relata que quando uma molécula de b-caroteno torna-se instável e reativa, esta forma reage mais rapidamente com um radical peroxila (ROO^_) do que dois radicais peroxila entre si, terminando desta forma a reação.

O número de ligações insaturadas na molécula parece não ter tido alguma influência favorável à eficiência antioxidante, já que o b-caroteno possui 11 duplas ligações e o acetato de retinol possui apenas 5 ligações insaturadas (Figura 2). Esta observação contraria as afirmações de outros autores, que apresentam o número de duplas ligações relacionado com a capacidade antioxidante (6, 9).

Com relação a oxidação dos ácidos graxos do óleo de soja, foram analisados apenas os ácidos linoléico e linolênico, por serem os mais susceptíveis à oxidação (13).

A Figura 3 apresenta o perfil dos ácidos graxos do óleo de soja ativado com peróxido de térciobutila e solução de cloreto férrico. Pode-se observar, que os ácidos graxos linoléico e linolênico, como o esperado pelo grau de insaturação, apresentam maior sensibilidade ao processo oxidativo.

Em função dos resultados apresentados na Figura 3, selecionamos os ácidos graxos linoléico e linolênico e o tempo de 144 horas para avaliar o grau de eficiência do b-caroteno, do retinol e do BHT na prevenção da oxidação.

Na Figura 4 estão os resultados da prevenção da oxidação dos ácidos graxos linoléico e linolênico na presença do b-caroteno e do retinol. Em comparação com o BHT observa-se que o retinol apresenta atividade antioxidante superior ao b-caroteno possivelmente pela maior sensibilidade deste carotenóide frente ao aquecimento.

O acetato de retinol retardou a degradação dos ácidos graxos, pois as composições dos ácidos linoléico e linolênico são diferenciadas em relação aos respectivos controles. O BHT, a exemplo das análises de peróxidos e malonaldeído, mostrou-se com a melhor eficiência antioxidante.

Embora a vitamina A não tenha a mesma eficiência dos antioxidantes sintéticos, pode ser uma alternativa na inibição da peroxidação lipídica, assim como outros componentes de origem natural já estudados.

O b-caroteno não apresentou ação antioxidante marcante, degradando-se facilmente neste sistema. Alguns autores relatam que este composto possui características supressoras de radicais ativos, com relação a atividade biológica, relacionando-o a uma classe desconhecida de antioxidantes biológicos (2, 12, 16). Sendo o principal precursor da vitamina A , o b-caroteno pode desta maneira, converter-se numa substância com maior capacidade antioxidante; além do que, em pressões parciais de oxigênio menores que 150 torr, condições fisiológicas encontradas na maior parte dos tecidos, apresenta comportamentos supressores de radicais.

4 - CONCLUSÕES

Dentre as substâncias estudadas, o BHT em concentração de 100ppm apresentou os melhores resultados de atividade antioxidante. O acetato de retinol também apresentou expressiva eficiência antioxidante em relação ao b-caroteno, sendo a atividade antioxidante destes compostos proporcionais à resistência de degradação no sistema contendo óleo de soja ativado. O acetato de retinol interagiu rapidamente com os radicais ativos, a exemplo do BHT, no início de sua adição no sistema.

5 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRFICAS

² Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental - Faculdade de Ciências Farmacêuticas - USP. Caixa Postal 66083. CEP 05389-970 - São Paulo SP - Brasil

• (1) AMERICAN CHEMISTS SOCIETY. Official and tentative methods, Champaign, 1980.
• (2) BURTON, G.W. Antioxidant action of carotenoids. J. Nutr., Philadelphia, 119:109-11, 1989.
• (3) DAS, N.P. & PEREIRA, T.A . Effects of flavonoids on thermal autooxidation of palm oil: structure-activity relationships. J. Am. Oil Chem. Soc, Champaing, 67(4):255-8, 1990.
• (4) DAVIES, B.A . Carotenoids. In: GOODWIN, T.W., ed. Chemistry and biochemistry of plant pigments New York, Academic Press, 1976. V.2, p.38-165.
• (5) FOOTE, C.S. & DENNY, R.W. Chemistry of singlet oxygen quenching by _-carotene . J. Am. Chem. Soc, Washington, 90:6233-5, 1968.
• (6) FOOTE, C.S.; CHANG, Y.C.; DENNY, R.W. Carotenoid quenching parallels biological protection. J. Am. Oil Chem. Soc, Washington, 92:5216-8, 1970.
• (7) GRAY, J.I. Measurement of lipid oxidation: A review. J. Am. Oil Chem. Soc, Champaing, 55:539-46, 1978.
• (8) HARTMAN, L. & LAGO, R.C.A . Rapid preparation of fatty acid methyl esters from lipids. Lab. Pract, London, 22:475-7, 494, 1973.
• (9) JUNG, M.Y. & MIN, D.B. Effects of quenching mechanisms of carotenoids on the photosensitized oxidation of soybean oil. J. Am. Oil Chem. Soc, Champaing, 68(9):653-7, 1991.
• (10) KAREL, M. Kinetics of lipid oxidation in Physical Chemistry of Foods. Schwartzberg & Hartel, Eds., IFT. Basic Symposium Ser., Marcel Decker, 1992, 651p.
• (11) KOPAS-LANE, L.M. & WARTHENSEN, J.J. - Carotenoid photostability in raw spinach and carrots during cold storage. J. Food Sci, Chicago, 60(4):773-76, 1995.
• (12) KRINSKY, N.I. Antioxidant functions of carotenoids - A Review. Free Rad. Biol. & Med, New York, 7:617-35, 1989.
• (13) LABUZA, T.P. Kinetics of lipid oxidation in foods. CRC Crit Rev. Food Technol, Cleveland, 2(3):355-405, 1971.
• (14) LEE, E.C. & MIN, D.B. Quenching mechanism of _-carotene on the chlorophyll sensitized photooxidation of soybean oil. J. Food Sci, Chicago, 53(6):1894-5, 1988.
• (15) PASSOTTO, J.A .; PENTEADO, M.D.V.C.; MANCINI-FILHO, J. Oxidative resistance and antioxidative activity of some carotenoids in food. Bolletino Chimico Farmaceutico, Milano, 134:306-311, 1995.
• (16) PUNG, A .; RUNDHAUG, J.E.; YOSHIZAWA, C.N.; BERTRAM, J.S. _-carotene and  canthaxanthin inhibit chemically and physically induced neoplastic transformation in 10T1/2 cells. Carcinogenesis, London, 9(9):1533-9, 1988.
• (17) SOARES, S.E.; MANCINI-FILHO, J.; TURATTI, J.M.; TANGO, J.S. Caracterização física, química e avaliação da estabilidade do óleo de abacate (Persea americana, Mill.) nas diferentes etapas do processo de refinação. Rev. Farm. Bioquim. Univ. S. Paulo, 27(1):70-82, 1991.
• (18) SPATZ, L. In: Natural antioxidants in human health and disease. Frei, B. ed. Academic Press, 1994, p.3-22.
• (19) TAKAHASHI, O . & HIRAGA, K. Dose-response study of hemorrhagic death by dietary butylated hydroxy toluene (BHT) in male rats. Toxicol. Appl. Pharmacol, New York, 43:399-406, 1978.
• (20) WARNER, K. & FRANKEL, E.N. Effects of _-carotene on light stability of soybean oil. J. Am. Oil Chem. Soc, Champaing, 64:213-8, 1987.
• (21) WHANG, K. & PENG, I. Photosensitized lipid peroxidation in ground pork and turkey. J. Food Sci, Chicago, 53:1596-614, 1988.
• (22) WINTERBOURN, C.C., GUTTERIDGE, J.M., HALLIWELL, B. Doxorubicin-dependent lipid peroxidation at low partial pressures of O₂ J. Free Rad. Biol. Med, New York, 1(1):43-9, 1985.
• (23) WITSCHI, H. & LOCK, S. Toxicity of butylated hydroxy toluene in mouse following oral administration. Toxicology, Shannon, 9:137-46, 1978.
• (24) WONG, M.L., TIMMS, R.E., GOH, E.M. Colorimetric determination of total /tocopherols in palm oil, olein and stearin. J. Am. Oil Chem. Soc, Champaing, 65(2):258-61, 1988.

1

Recebido para publicação em 24/04/97. Aceito para publicação em 04/03/98.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  28 Set 2001
• Data do Fascículo
  Abr 1998

Histórico

• Aceito
  04 Mar 1998
• Recebido
  24 Abr 1997