Estudo dos parâmetros da ultrafiltração de permeado de soro de queijo fermentado por Lactococcus lactis subsp. lactis

Ultrafiltration conditions of whey permeate fermented by Lactococcus lactis subsp. lactis

Resumos

Permeado de soro doce, suplementado com extrato de levedura e peptona, foi utilizado como meio de crescimento para Lactococcus lactis subsp. lactis. No final da fase exponencial de crescimento, o meio de cultura fermentado foi submetido a uma ultrafiltração com o objetivo de concentrar o microrganismo. Foram realizados 6 processamentos diferentes, nos quais variou-se as condições iniciais da ultrafiltração, tendo sido avaliados os seguintes parâmetros: porosidade da membrana, pH e número de células viáveis no permeado e no retentado, a fim de ser estudado a influência de cada parâmetro na taxa de permeação da ultrafiltração. As membranas utilizadas foram eficazes como meio de barragem para o microrganismo Lactococcus lactis subsp. lactis, ficando o retentado com uma média celular de 10(8) ufc/ml e o permeado com uma média celular de 10² ufc/ml. Membranas de diferentes porosidades tiveram taxas de fluxo semelhantes. O aumento da concentração celular provocou a diminuição do fluxo. O pH também influenciou a taxa de permeação, havendo um aumento do fluxo quando foi utilizado um pH inicial mais alto.

ultrafiltração; fermento; Lactococcus lactis subsp. lactis

Cheese whey permeate supplemented with yeast extract and peptone was used as a growth medium for the bacteria Lactococcus lactis subsp. lactis. At the end of the exponential growth phase, the fermented growth medium was ultrafiltered to concentrate the microorganism and to evaluate the effect of the membrane porosity, inicial UF pH and cellular concentration in permeation rate during the ultrafiltration process. The membranes used were efficient as a mean of a barrage for the Lactococcus lactis subsp. lactis. On average, the cellular concentrations were 10(8) CFU/mL and 10² CFU/mL for retentate and permeate, respectively. Membranes of different porosities had very similar flux rates. Better flow rates were obtained with inicial UF pH 6,5 and with the minors micrrorganism concentration.

ultrafiltration; starter; Lactococcus lactis subsp. lactis

ESTUDO DOS PARÂMETROS DA ULTRAFILTRAÇÃO DE PERMEADO DE SORO DE QUEIJO FERMENTADO POR Lactococcus lactis subsp. lactis¹

Viviane BRONSTEIN², Ranulfo MONTE ALEGRE²

RESUMO

Permeado de soro doce, suplementado com extrato de levedura e peptona, foi utilizado como meio de crescimento para Lactococcus lactis subsp. lactis. No final da fase exponencial de crescimento, o meio de cultura fermentado foi submetido a uma ultrafiltração com o objetivo de concentrar o microrganismo. Foram realizados 6 processamentos diferentes, nos quais variou-se as condições iniciais da ultrafiltração, tendo sido avaliados os seguintes parâmetros: porosidade da membrana, pH e número de células viáveis no permeado e no retentado, a fim de ser estudado a influência de cada parâmetro na taxa de permeação da ultrafiltração. As membranas utilizadas foram eficazes como meio de barragem para o microrganismo Lactococcus lactis subsp. lactis, ficando o retentado com uma média celular de 10⁸ ufc/ml e o permeado com uma média celular de 10² ufc/ml. Membranas de diferentes porosidades tiveram taxas de fluxo semelhantes. O aumento da concentração celular provocou a diminuição do fluxo. O pH também influenciou a taxa de permeação, havendo um aumento do fluxo quando foi utilizado um pH inicial mais alto.

Palavras-chave: ultrafiltração; fermento; Lactococcus lactis subsp. lactis

SUMMARY

ULTRAFILTRATION CONDITIONS OF WHEY PERMEATE FERMENTED BY Lactococcus lactis subsp. lactis. Cheese whey permeate supplemented with yeast extract and peptone was used as a growth medium for the bacteria Lactococcus lactis subsp. lactis. At the end of the exponential growth phase, the fermented growth medium was ultrafiltered to concentrate the microorganism and to evaluate the effect of the membrane porosity, inicial UF pH and cellular concentration in permeation rate during the ultrafiltration process. The membranes used were efficient as a mean of a barrage for the Lactococcus lactis subsp. lactis. On average, the cellular concentrations were 10⁸ CFU/mL and 10² CFU/mL for retentate and permeate, respectively. Membranes of different porosities had very similar flux rates. Better flow rates were obtained with inicial UF pH 6,5 and with the minors micrrorganism concentration.

Key words: ultrafiltration; starter; Lactococcuslactis subsp. lactis

1 - INTRODUÇÃO

O soro é um subproduto da indústria queijeira, sendo um dos resíduos mais poluentes da indústria alimentícia. Por ser um meio rico em proteínas e lactose, algumas alternativas têm sido utilizadas pela indústria láctea para o seu reaproveitamento, entre elas o uso da ultrafiltração. A ultrafiltração (UF) do soro separa as proteínas, que ficam retidas no concentrado, da lactose e sais, que formam o permeado, o qual pode ser utilizado como meio de fermentação, pois, além de ter um grande teor de lactose, contém minerais e vitaminas (11). Várias pesquisas têm sido realizadas a fim de verificar o uso do soro e do permeado de soro como substrato para o crescimento de fermento (3,4).

A produção e utilização de culturas láticas concentradas vêm sendo desenvolvidas nos últimos 30 anos. Culturas concentradas são usadas para a inoculação no tanque de fermentação ou diretamente no tanque de coagulação (18), eliminando as diversas fases intermediárias de subcultura das bactérias e diminuindo os riscos de contaminação. Este fermento concentrado pode ser comercializado tanto na forma congelada como na forma liofilizada. A concentração do fermento pode ser feita por centrifugação, difusão ou ultrafiltração, tendo-se como meta a obtenção da maior taxa de sobrevivência possível junto com a manutenção de uma alta atividade da cultura. A taxa de sobrevivência da cultura depende das condições de processamento (meio de crescimento, presença de compostos criogênicos e liofilização) e do método de concentração celular. Na concentração de células por centrifugação, a formação de lactato pode ser inibitória e a ação mecânica pode causar algum dano físico às células. Pelas técnicas de difusão de cultura e ultrafiltração pode-se atingir 10¹¹ ufc ml^-1, removendo-se o lactato do meio de crescimento e concentrando a biomassa (14). Segundo PRINGENT et alli (12), o processo de difusão apresenta restrições impostas pelo tamanho da unidade de difusão, sendo o processo de ultrafiltração mais adequado para este fim.

A eficiência do processo de ultrafiltração (UF) e microfiltração (MF) é afetada pelo "fouling" da membrana e pela interação das diversas variáveis do processo (9). Fatores como velocidade tangencial, pressão, temperatura, turbulência, tamanho das partículas, condições do meio e características da membrana afetam o desempenho da UF e MF durante a concentração de células (8).

Vários trabalhos referem-se a ultrafiltração e microfiltração como método de concentração de células (5, 13; 15, 9), mas poucos deles tratam especificamente da produção de fermento concentrado (12, 16), sendo necessário mais estudos sobre o assunto. Embora essas técnicas já estejam sendo utilizadas para este fim, detalhes da produção não são publicados e muitos estudos ainda são necessários para estimar os parâmetros críticos na produção de fermento concentrado por UF ou MF, como tipo de bomba, pressão transmembrana, porosidade da membrana, influência da morfologia da bactéria no "fouling" e no perfil de permeação (12).

Este trabalho teve como objetivo estudar a influência do pH, concentração celular e porosidade da membrana na taxa de permeação durante a ultrafiltração de Lactococcus lactis subsp. lactis cultivado em permeado de soro, verificando o efeito de cada parâmetro no fluxo de permeação; visando o aproveitamento do permeado de queijo como meio de fermentação para a obtenção de fermento concentrado.

2 - MATERIAL E MÉTODOS

2.1 - Microrganismo

O microrganismo Lactococcus lactis subsp. lactis NCDO 1996 foi obtido no laboratório de Microbiologia do Departamento de Tecnologia - Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas. A cultura foi mantida por repicagens semanais em leite desnatado em pó (Molico, Nestlé) reconstituído a 11% de sólidos.

2.2 - Meio de crescimento

Como meio de crescimento utilizou-se permeado de de soro de queijo parmesão, obtido por ultrafiltração de soro em membrana de polissulfona H15-43-PM50 Romicon, o qual foi conservado congelado. Após o descongelamento, cada lote de permeado foi suplementado com 0,5% de extrato de levedura (Difco) e 0,5% de peptona (Difco) e desproteinado por aquecimento com acidificação (pH 5,1, 90°C, 30 minutos). As proteínas coaguladas foram separadas por filtração, sendo o pH do filtrado ajustado para 6,5 com solução de NaOH e pasteurizado (63°C, 30 minutos), obtendo-se um meio com a seguinte composição: 0,18% de nitrogênio-não-proteico; 0,23% de nitrogênio total; 5,00% de sólidos totais; 0,46% de cinzas e 4,31% de açúcares redutores totais.

2.3 - Procedimento Experimental

As fermentações foram conduzidas inoculando-se 1 litro de meio de crescimento com 10² UFC/ml de L. lactis subsp. lactis, sem agitação a 30°C por 9 ou 12 horas de fermentação. Após este tempo, os meios foram concentrados por UF em membranas tubulares marca Carbosep com 75 cm² de área compostas de um suporte poroso de carbono revestido internamente com uma película de óxido de zirconila, modelos M6, M9 e M8 (de pesos nominais moleculares de corte de 0,08 µm, 300.000 Daltons e 50.000 Daltons, respectivamente). Cada ultrafiltração foi realizada durante 5 horas, à temperatura ambiente e pressão de 2 bars. Em alguns processamentos, o meio foi acidificado (com ácido clorídrico 1N) para atingir pH 5,7 ou neutralizado (com NaOH 1N) para atingir pH 6,5 antes da ultrafiltração. Para restabelecer o fluxo original, a membrana foi lavada com hidróxido de sódio e ácido nítrico.

2.4 - Processamentos realizados

O meio de crescimento foi ultrafiltrado sem fermentar. Este processamento foi realizado com a membrana de 300.000 daltons, à pressão de 2 bars e temperatura ambiente, com pH inicial da UF 6,5.

Para a avaliação da influência de alguns parâmetros (porosidade da membrana, pH e concentração inicial de células) na taxa de permeação, foram realizados 6 processamentos diferentes, os quais variam em três pontos: membrana utilizada (0,08 µm, 300.000 daltons ou 50.000 daltons), pH inicial da ultrafiltração (5,7 ou 6,5) e número de horas de fermentação ( 9 ou 12 horas).

2.5 - Análises

A ultrafiltração foi monitorada através das medidas de volume de permeado obtido, pH e número de células viáveis no retentado e no permeado. O fluxo de permeação (J_p) foi calculado dividindo-se a vazão (l/ h) pela área da membrana (m²) e o fator de concentração (Fcv) calculado através da divisão do volume inicial total pelo volume do concentrado (calculado pelo volume total - peso do permeado extraído, considerando-se 1ml = 1g) (7). O número de células viáveis foi determinado através do método de plaqueamento em profundidade em meio ágar MRS (Oxoid), usando-se diluições seriadas com água peptonada 0,1% e incubação a 30°C (17), sendo as contagens realizadas após 48 e 72 horas. As análises microscópicas das bactérias foram realizadas através da observação de lâminas coradas por coloração de gram (17). A curva de crescimento foi realizada inoculando-se 10² ufc/ml em 1 litro de meio de crescimento a 30°C, retirando-se amostras a cada hora. A composição do meio de crescimento foi determinada por meio das seguintes análises, realizadas em triplicata: açúcares redutores totais (6); proteína total e nitrogênio-não-proteico: método Kjeldahl (1), cinzas e sólidos totais (2).

3 - RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 - Crescimento de Lactococcus lactis subsp. lactis no meio de crescimento

A Figura 1 mostra que o microrganismo em estudo alcançou o final da fase logarítmica em torno de 12 horas, com uma concentração máxima de células de 2,9.10⁸ ufc/ml. O pH começa a declinar a partir da 11^a hora de fermentação, atingindo o valor de 4,3 ao final de 16 horas de fermentação.

3.2 - Taxa de permeação do meio de crescimento

O meio de crescimento foi ultrafiltrado em uma membrana de 300.000 daltons sem ser fermentado, para averiguar a taxa de permeação deste meio. A queda de fluxo durante a UF foi bastante lenta, tendo o fluxo (l/h/m²) variado de 46,4(inicial) até 34,4.(final). O fluxo da água neste equipamento com a membrana utilizada é de, aproximadamente, 200 l/h/m². Apesar de o fluxo do meio ser baixo quando comparado ao fluxo de água pura, ele é alto quando comparado ao fluxo obtido com o permeado fermentado, nos quais o fluxo final chega a, aproximadamente, 6,4 l/h/m².

3.3 - Variação do fluxo

Foram realizados 6 experimentos, nos quais foram utilizados 3 membranas de porosidade diferentes (0,08 µm, 300.000 daltons e 50.000 daltons), 2 pHs iniciais da UF diferentes (5,7 e 6,5) e 2 concentrações celulares iniciais da UF diferentes (10⁶ ufc/ml e 10⁸ uf/ml), como mostra a Tabela 1.

3.3.1 - Influência da porosidade da membrana no fluxo

Os pares de processamentos 1/2 e 3/4 foram realizados com todas as condições iniciais iguais, diferindo somente na membrana utilizada (Tabela 2). Analisando o perfil de permeação dos processamentos 1 e 2 (Figura 2), vemos que o fluxo variou um pouco entre os processamentos nos primeiros trinta minutos de UF, comportando-se de maneira bastante similar no restante do tempo, indicando que nos primeiros 30 minutos foi formada a camada secundária, a qual passou a ser o fator preponderante na taxa de permeação durante a UF.

Pela Figura 3, a qual mostra os dados dos processamentos 3 e 4, vemos que estes processamentos também tiveram um perfil de permeação semelhante, mais uma vez indicando-nos que neste caso a porosidade da membrana não é um fator determinante na taxa de permeação.

3.3.2 - Influência do pH no fluxo

Para a avaliação da influência do pH na taxa de permeação, foram comparados os pares de processamentos 1/3 e 2/4, que têm todas as condições iniciais iguais, diferindo somente no pH inicial da UF (Tabela 1). Observa-se que nos processamentos onde o pH inicial da UF era maior, obteve-se uma maior quantidade de permeado.

Acompanhando a variação de pH ao longo da UF, percebemos que, nos processamentos onde ocorreu um declínio mais lento do pH, o fluxo também demora mais a declinar, como mostram as Figuras 4 a 7.

3.3.3 - Influência do número de células iniciais no fluxo

Os processamentos 5 e 6 foram realizados a fim de avaliar a influência da concentração de células inicial na UF, tendo todas as condições iniciais iguais, diferindo somente na cocentração inicial de bactérias, variando, para tal, o número de horas de fermentação antes da UF. No processamento 5, realizado após 12 horas de fermentação, a concentração de células no início da UF era de 3,1 · 10⁸ UFC/ml e o processamento 6, realizado após 9 horas de fermentação, a concentração de células no início da UF era de 3,0 · 10⁶ UFC/ml

Pela Tabela 1 percebemos que no processamento 5, no qual a concentração celular inicial da UF é menor, o total de permeado retirado foi maior se comparado ao processamento 6, onde a concentração celular é maior. TANNY et al (15) chegaram à mesma conclusão ao estudar a concentração de bactérias patogênicas por microfiltração. Ao testar duas concentrações iniciais diferentes de Escherichia coli: 10⁸ cel/ml e 10⁹ cel/ml, eles observaram que uma maior concentração celular levou à diminuição do fluxo. Le & atkINson (9) também observaram uma diminuição do fluxo com o aumento da concentração celular.

Analisando o perfil das curvas de permeação dos processamentos 5 e 6 (Figura 8), vemos que com 9 horas de fermentação, o fluxo caiu mais devagar, mantendo-se estável por mais tempo, e com 12 horas de fermentação, o fluxo caiu mais rápido. Observando a variação do pH (Figura 9), vemos que o pH cai mais devagar no processamento com 9 horas de fermentação. Essa queda mais lenta do pH foi devida ao menor número de células; conseqüentemente, menos ácido foi produzido durante a UF. Assim, com a queda mais lenta do pH, o fluxo também demora mais a declinar, como já discutido anteriormente.

Ao comparar o processamento com 9 horas com o processamento com 12 horas de fermentação, concluímos que, tanto o menor número de células circulando, como o declínio mais lento do pH, devem ter contribuido para o aumento da taxa de permeação no processamento com 9 horas de fermentação.

3.4 - Variação da concentração celular ao longo dos processamentos

As membranas utilizadas foram eficazes como barreira para a passagem de células, embora tenha ocorrido a presença de células no permeado mesmo com a membrana de menor porosidade. A concentração celular média no retentado ficou em torno de 10⁸ UFC/ml. Quando foram utilizadas a membrana de 0,08 µm e a de 300.000 daltons, a concentração celular no permeado variou desde 10¹ UFC/ml até 10³ UFC/ml, ficando a média em torno de 10² UFC/ml. Quando foi utilizada a membrana de 50.000 daltons (processamentos 2 e 4), a concentração celular no permeado foi menor que com as outras membranas, não ultrapassando 71 UFC/ml. MERIN et al (10), ao estudar a concentração de bactérias láticas em soro de queijo por microfiltração utilizando um inóculo de concentração 10⁴ UFC/ml, também observaram uma diferença na concentração de células no permeado de acordo com a porosidade da membrana utilizada., obtendo 10³ UFC/ml no permeado com a membrana de 1,2 µm, 10² UFC/ml no permeado com a membrana de 0,8 µm e 80 UFC/ml no permeado com a membrana de 0,45 µm.

As células do concentrado, quando observadas diretamente sob o microscópio ótico, apresentaram-se normais, sem nenhum dano aparente.

Nos processamentos realizados não foi possível chegar a uma alta concentração celular, ficando o número de células variando em torno de uma média, 4.10⁸ UFC/ml ao longo de 5 horas de UF, como mostra a Tabela 2. Nesta tabela vemos que em alguns processamentos chegou-se a alcançar uma concentração celular de 10⁹ ufc/ml, sendo que esse patamar não foi mantido ao longo das horas, mostrando-nos que ocorreu morte celular durante a UF.

4 - CONCLUSÕES

O permeado de soro suplementado com extrato de levedura e peptona mostrou-se um meio adequado para o crescimento de Lactococcus lactis subsp. lactis. As membranas de UF utilizadas foram eficazes como barreira para a passagem das células, ficando o retentado com uma média de células de 10⁸ ufc/ml e o permeado com uma média de células de 10² ufc/ml. Membranas de diferentes porosidades levaram à mesma taxa de permeação. O aumento da concentração celular provocou diminuição na taxa de permeação. O pH também influenciou a taxa de permeação, havendo um aumentou do fluxo com o aumento do pH da ultrafiltração.

5 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

² UNICAMP - Depto. de Engenharia de Alimentos. Caixa Postal 6121 , CEP 13081-970, Campinas, São Paulo.

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Recebido para publicação em 17/03/97. Aceito para publicação em 04/03/98.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  28 Set 2001
• Data do Fascículo
  Abr 1998

Histórico

• Aceito
  04 Mar 1998
• Recebido
  17 Mar 1997