ESTUDO DA PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS DE PRÓPOLIS E SUAS APLICAÇÕES

ESTUDY OF THE PREPARATION OF THE PROPOLIS EXTRACTS AND YOURS APLICATIONS

ESTUDO DA PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS DE PRÓPOLIS E SUAS APLICAÇÕES¹

Yong Kun PARK²,^*, Masaharu IKEGAKI², José A. da Silva ABREU³, Nívia M. Freire ALCICI³

RESUMO

A obtenção dos extratos etanólicos de própolis foi feita utilizando água e diferentes concentrações de etanol como solventes. Esses extratos foram analisados quanto ao seu espectro de absorção por espectrofotometria na região ultravioleta ("U.V. scanning"), por cromatografia em camada delgada de alta performance e por cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE). O pico de absorção máxima de todos os extratos foi a 290 nm sendo o extrato etanólico a 80% o que apresentou maior absorção. A maioria dos flavonóides foram extraídos nas concentrações alcóolica entre 60 a 80%. Foram testados ainda o efeito anrirnicrobiano, antioxidante e anflinflamatório desses extratos. Verificou-se que os extratos etanólicos de própolis entre 60 a 80% inibiu satisfatoriamente o crescimento microbiano e os extratos etanólicos a 70 e 80% apresentaram grande atividade antioxidante, e ainda, o extrato etanólico a 80% foi a que melhor resultado apresentou sobre a inibição da atividade da enzima hialuronidase.

Palavras chaves: Própolis, flavonóides, Apis mellifera, extrato etanólico.

SUMMARY

ESTUDY OF THE PREPARATION OF THE PROPOLIS EXTRACTS AND YOURS APLICATIONS Ethanolic extracts from propolis were performed by using lhe water and vaflous coneentrations of etanol as solvent. The extracts were investigated by measurement of absorption spectruin with Uv-spectrophotometer ("UV-scanning"), reversed phase-high performance thin-layer chromatography, Reversed phase-HPLC. Maximum absorption of ali extracts was 290 nm, resembling flavonoid compounds and 80% ethanolic extract showed highest absorption at 290 nm. The most isosakuranetin, quercefin, and kaempferol were extracted from mixtures of propolis and 60% etanol, whereas 70% etanol extracted te most pinocembrin and sakuranetin, but 80% etanol extracted more kaempferide, acacetin, and isorhamnetin from propolis. The 60 to 80% ethanolic extracts ofpropolis inhibited highly to microbial growth and 70 and 80% ethanolic extracts showed lhe greatest antioxidant activity and 80% ethanolic extract inhibited highly to hyaluronidase activity.

Keywords: Propolis, flavonoids, Apis mellftra, etanolic extract.

1- INTRODUÇÃO

A própolis é uma resina de coloração e consistência variada coletada por abelhas da espécie Apis mellifera de diversas partes das plantas como brotos, botões florais e exsudatos resinosos. Durante a coleta da própolis, as abelhas misturam a cera e a própolis coletada juntamente com a enzima 13-glicosidase presente na sua saliva, acarretando a hidrólise dos flavonóides glicosilados em flavonóides agliconas. A própolis é utilizado pelas abelhas para selar eventuais aberturas na colméia e para eliminar possíveis invasores [7,9].

Dentre os produtos apícolas tais como mel, geléia real, pólen, entre outros, a própolis vem se destacando tanto pelas suas propriedades terapêuticas, como atividade antimicrobiana, antinflamatória, cicatrizante, anestésica [4,8] e anticariogênica [18], quanto pela possibilidade de aplicação na indústria de farmacêuticas e alimentícias, na forma de alimentos funcionais. Atualmente existem diversos produtos contendo própolis comercializados em todo mundo, principalmente no Japão, tais como balas, chocolates, doces, xampus, cremes para pele, soluções anti-sépticas, pastas de dente, etc. [1].

Os efeitos terapêuticos têm sido atribuídos aos diversos compostos fenólicos que compõe a própolis. Destes, os flavonóides podem ser considerados os principais compostos, encontrando-se ainda, alguns ácidos fenólicos e seus ésteres, aldeídos fenólicos, álcoois e cetonas [3,5]. Fatores como a ecologia vegetal da região onde a própolis foi coletada [16,17] e até mesmo a variabilidade genética das rainhas [12], também influenciam na composição química da própolis.

O objetivo deste trabalho foi verificar a concentração de flavonóides agliconas nos extratos etanólicos de própolis em relação a concentração do etanol utilizado como solvente extrator, bem como a sua comparação com o extrato aquoso de própolis. E, finalmente, os extratos etanólicos e aquoso foram analisados quanto a sua atividade antimicrobiana, antioxidante e antiinflamatória.

2 — MATERIAL E MÉTODOS

2.1 – Própolis

Aproximadamente 100 gramas de própolis, coletadas por abelhas da espécie Apis mellifera, foram obtidos no estado de Minas Gerais, Brasil.

A própolis foi então acondicionada em dessecador com sílica, à temperatura ambiente, sendo posteriormente, triturada e homogeneizada para realização da extração.

2.2 – Preparo dos extratos etanólicos e aquoso de própolis

Amostras de 2 gramas da própolis triturada e homogeneizada foram transferidas para tubos de ensaio (25x180mm). Em seguida, foram adicionado 25 ml de etanol a 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 e 95%, respectivamente, e feita a extração a 70^oC em banho de água termostatizada por 30 minutos, sob agitação constante. Após a extração, as amostras foram centrifugadas a 8.800 x g por 10 minutos a 20^oC. Os sobrenadantes obtidos foram armazenados em tubos de ensaio (15x160mm) com tampa de rosca, em refrigerador. Por outro lado, o extrato aquoso de própolis foi preparado como descrito por MATSUSHIGE et al.[14] Em 2 gramas da própolis triturada e homogeneizada, foram adicionados 25 ml de água deionizada, sendo a mistura incubada por 2 horas a 95^oC. Após a extração, a mistura foi centrifugada e armazenada nas mesmas condições descritas anteriormente.

2.3 – Determinação do espectro de absorção dos extratos etanólicos e aquoso de própolis

Para a determinação do espectro de absorção dos extratos etanólicos e aquoso de própolis, alíquotas de 25 ml de cada extrato, obtido de acordo com o item 2.2, foram diluídas em 30 ml de etanol 95% e o espectro de absorção na região U.V. das amostras foi determinado na faixa de comprimento de onda entre 200 a 500 nm ("U.V. scanning") utilizando espectrofotômetro Beckman DU-70.

2.4 – Determinação da formação do complexo metal (alumínio)-flavonóides nos extratos etanólicos e aquoso de própolis

O princípio desta reação baseia-se na formação de quelatos entre o metal (alumínio) e os flavonóides, principalmente os flavonols (3-hidroxiflavonas) como a quercetina, em soluções alcóolicas, levando a um efeito batacrômico do espectro de absorção dos flavonóides, com alteração da coloração. A mistura de reação consistiu de 0,5 ml dos respectivos extratos, diluídos 1:10, 4,3 ml de etanol 80%, 0,1 ml de nitrato de alumínio 10% e 0,1 ml de acetato de potássio 1 M. Após 40 minuto de reação o espectro de absorção na região U.V. das amostras foi determinado na faixa de comprimento de onda entre 200 a 600 nm ("U.V. scanning") utilizando espectrofotômetro Beckman DU-70.

2.5 – Cromatografia em camada delgada de alta performance em fase reversa dos extratos etanólicos e aquoso de própolis

Para realização da cromatografia em camada delgada de alta performance, alíquotas de 5 ~l dos respectivos extratos foram aplicados em cromatoplacas (10 x 10 em) RP-1 8 F₂₅₄-S (Merck Co.). O tempo de desenvolvimento do cromatograma foi de 100 minutos aproximadamente, utilizando como sistema de solvente etanol 95%:água destilada (55:45, v/v). As placas desenvolvidas foram observadas sob luz ultravioleta nos comprimentos de onda de 366 nm, utilizando iluminador U.V. Cole Parmer, modelo UVP-UVGL-58.

2.6 – Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa dos extratos etanólicos e aquoso de própolis

A análise quantitativa dos flavonóides foi realizada utilizando cromatógrafo líquido Shimadzu modelo LC-10 equipado com coluna de fase reversa YMC PACK ODS-A. A fase móvel utilizada foi metanol: água deionizada: ácido acético (75:60:5, v/v), com fluxo de 1 mi/minuto e detetor de fotodiodo. A concentração dos flavonóides nos extratos foi calculado utilizando padrões autênticos fornecido pela Extrasynthese A.A. Co., França.

2.3 – Teste de atividade antimicrobiana dos extratos etanólicos e aquoso de própolis em bactérias patogênicas

2.7.1 - Preparo dos discos com extratos de própolis

Os discos de papel de filtro Whatman n^o 3 (5 x 1mm de diâmetro) foram submersos nos respectivos extratos de própolis durante 15 minutos e então colocados em dessecador com sílica à temperatura ambiente por 24 horas. Posteriormente, foram mantidos na estufa a 60^oC por 4 horas para eliminação de qualquer resíduo etanólico.

2.7.2 - Análise da atividade antimicrobiana dos extratos de própolis

A análise da atividade antimicrobiana dos extratos de própolis na bactéria Gram positiva Staphylococcus aureus coagulase positiva foi realizada de acordo com o método descrito por BLAIR et al. [6]. Culturas ativas de S. aureus foram inoculadas por espalhamento com "swabs" estéreis em placas de Petri contendo ágar nutriente. Os discos com os extratos foram colocados sobre as placas inoculadas e incubadas a 37^oC por 24 horas. A atividade antimicrobiana foi determinada pela formação de halo inibitório ao redor dos discos.

2.8 – Determinação da atividade antioxidante dos extratos etanólicos e aquoso de própolis

A atividade antioxidante foi determinada pela oxidação acoplada do b-caroteno e do ácido linoléico [10,20, 21]. Em um balão de fundo redondo, foram adicionados 60 mg de ácido linoléico, 200 mg de Tween 40 e 5 mg de b-caroteno foram dissolvidos em 5 ml de clorofórmio que, posteriormente, foi retirado utilizando rota-evaporador a 50^oC. Após a remoção do clorofórmio, o resíduo foi dissolvido com a adição de 50 ml de água deionizada e oxigenada sob vigorosa agitação. Alíquotas de 5 ml desta emulsão foram transferidas para tubos de ensaio contendo 0,5 ml dos respectivos extratos de própolis e a absorbância foi medida imediatamente em espectrofotômetro a 470 nm. Os tubos foram incubados a 40^oC para a reação de oxidação e a leitura da absorbância foi medida em intervalos de 60 minutos.

2.9 – Determinação da inibição da atividade da hialuronidase pelos extratos etanólicos e aquoso de própolis

A inibição da atividade de hialuronidase foi determinada conforme descrito nas referências [2] e [22]. A mistura de reação consistindo de 50 ml dos respectivos extratos de própolis, 0,5 ml do sal de potássio do ácido hialurônico em tampão acetato 0,1M, pH 3,6 contendo 0,15 M de NaCl e 50 ml (350 unidades) da enzima hialuronidase (Tipo IV-S: obtido de testículo bovino, Sigma Co.), dissolvida no mesmo tampão, foi incubada a 37^oC por 40 minutos. Após a incubação, 0,1 ml tetraborato de potássio 0,8 M foi adicionado na mistura de reação e novamente incubada em banho de ebulição por 3 minutos. Em seguida, adicionou-se 3 ml de r -dimetilaminobenzaldeido e a mistura foi incubada a 37^oC por 20 minutos. Finalmente, a absorbância da mistura foi medida em espectrofotômetro a 585 nm usando água como controle.

3 — RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 – Extratos etanólicos e aquoso de própolis

Os extratos de própolis foram preparados conforme descrito no item 2.2. Observando os extratos de própolis obtidos, verificamos que o extrato aquoso e os extratos etanólicos de 10 a 50% apresentaram uma coloração amarela, enquanto que o extrato etanólico a 60% aparentava uma coloração amarela-esverdeada. A medida que a porcentagem de etanol foi aumentando, a coloração esverdeada foi se tomando cada vez mais intensa.

3.2 – Espectro de absorção dos extratos de própolis

Os espectros de absorção dos extratos etanólicos e aquoso de própolis estão apresentados na Figura 1. Todas as amostras exibiram um perfil similar, com máxima absorção a 290 nm. Entretanto, o grau de absorção a 290 nm foi variável, dependendo da concentração de etanol utilizado para extração. O extrato aquoso de própolis apresentou a menor absorção e essa absorção foi aumentando a medida a concentração de etanol foi elevada até 80%. Os extratos com 90 e 95% de etanol apresentaram diminuição na absorção a 290 nm. Anteriormente, foi relatado que o perfil de absorção entre os comprimentos de onda de 270 - 330 um eram atribuídos aos flavonóides e fenóis [11]. Entretanto, os resultados da Figura 1 indicam que altas concentrações de flavonóides foram liberados pela própolis quando utilizou uma solução 80% de etanol como solvente extrator. Por outro lado, a mistura dos extratos etanólicos de própolis com nitrato de alumínio e acetato de potássio, muda completamente o espectro de absorção, com o deslocamento do pico com absorção máxima a 310 um, como apresentado na Figura 2. A mudança na absorção máxima ocorreu devido a formação de um complexo entre o metal (alumínio) e os flavonóides [19]. A maioria dos flavonóides que ocorrem naturalmente, são compostos fenólicos que contem um ou mais grupos o-dihidroxil e ceto-hidroxi que estão envolvidos na formação do complexo com os metais. A formação do complexo metal-flavonóide induz um deslocamento do pico de absorção máxima do espectro [13]. A Tabela 1 expressa os valores de absorbância obtidos a partir dos extratos aquoso e etanólicos de própolis a 290 um e os mesmos extratos na presença de nitrato de alumínio e acetato de potássio a 310 nm. Podemos observar que o extrato etanólico obtido a partir de etanol 80% apresentou maior absorbância tanto a 290 quanto a 310 nm. Com isso, concluímos que o extrato etanólico a 80% apresenta maior quantidade de flavonóides.

FIGURA 1.
Espectro de absorção dos extratos etanólicos e aquoso de própolis na faixa entre 200-500 nm. A mistura de reação consistiu de 25m l dos respectivos extratos, diluídos em 30 ml de etanol 95%.

_______ espectro de absorção do extrato etanólico de própolis a 80%

- - - - - - - espectro de absorção da mistura do extrato etanólico de própolis a 80% e AINO₃

FIGURA 2. Espectro de absorção do extrato etanólico de própolis.

TABELA 1.
A absorbância dos extratos etanólicos e aquoso de própolis a 290 e 310 nm.

Extrato de Própolis	Absobância do extrato de própolis a 290 nm	Absobância do extrato de própolis a 310 nm
Exrato aquoso	0.4434	0.4341
10% etanol	0.5115	0.4782
20% etanol	0.5965	0.5471
30% etanol	0.7401	0.7002
40% etanol	1.0575	0.9290
50% etanol	1.7802	1.5637
60% etanol	2.4668	2.1455
70% etanol	2.6931	2.2860
80% etanol	2.9844	2.7154
90% etanol	2.6334	2.2692
95% etanol	2.5298	2.1980

Extrato de Própolis Zona de inibição do crescimento microbiano (mm) Exrato aquoso 0 10% etanol 0 20% etanol 0 30% etanol 0.5 40% etanol 1.0 50% etanol 1.0 60% etanol 1.5 70% etanol 1.5 80% etanol 1.5 90% etanol 1.0 95% etanol 1.0

Extrato de Própolis	Zona de inibição do crescimento microbiano (mm)
Exrato aquoso	0
10% etanol	0
20% etanol	0
30% etanol	0.5
40% etanol	1.0
50% etanol	1.0
60% etanol	1.5
70% etanol	1.5
80% etanol	1.5
90% etanol	1.0
95% etanol	1.0

TABELA 2. Atividade antimicrobiana dos extratos e etanólicos e aquoso de própolis sobre Staphylococcus aureus.

3.3 – Cromatografia em camada delgada de alta performance em fase reversa

O cromatograma das amostras está apresentado na Figura 3. No extrato aquoso, não foi detectado nenhuma fração quando a cromatoplaca foi irradiada com luz ultravioleta a 254 um. No entanto, o numero de frações aumentou a medida que a concentração de etanol foi aumentada até 50%, mantendo-se constante mesmo com o aumento na concentração de etanol.

FIGURA 3.
Cromatografia em camada delgada de alta performance em fase reversa dos extratos etanólicos e auosos de própolis irradiao com luzultra-violeta a 366 nm.

3.4- – Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em fase reversa

As análises em CLAE dos extratos etanólicos e aquoso fora realizadas de acordo como método descrito no item 2.6, e os resultados estão apresentados na Figura 4. De acordo com o resultado, observamos que no extrato aquoso não foi detectado picos de flavonóides, exceto em quantidades traços de quercetina e pinocembrina. Mas com o aumento da concentração do solvente extrator, houve um aumento da quantidade de picos formados. A Figura 5 ilustra a relação entre a concentração dos flavonóides no extrato de própolis e a porcentagem etanólica dos extratos. Verificamos que a maioria dos flavonóides identificados foram extraídos nas porcentagens etanólicas entre 60 a 80%.

FIGURA 4
. Cromatografia líquada de alta eficiência em fase reversa dos extratos etanólicos e auosos de própolis.

FIGURA 5.
Relação entre a contração de flavonóides nos extratos etanólicos de própolis e a porcentagem de etanol utilizado para extração.

3.5 – Determinação da atividade antimicrobiana

Os resultados da atividade antimicrobiana dos extratos etanólicos e aquoso demonstraram que o extrato aquoso e os extratos etanólicos de própolis a 10 e 20% não apresentaram atividade antimicrobiana. Porém, os extratos etanólicos de própolis de 30 a 50% apresentaram uma ligeira atividade (zona de inibição de 0,5 mm). Quando utilizados extratos etanólicos de própolis de 60 a 80%, a inibição do crescimento microbiano aumentou consideravelmente (zona de inibição de 1,5 mm), seguido de um decréscimo na atividade antimicrobiana nas porcentagens mais altas de etanol.

3.6 – Determinação da atividade antioxidante

A determinação da atividade antioxidante dos extratos de própolis foi realizada conforme descrito no item 2.4 e os resultados estão apresentados na Figura 2. Observamos que todos os extratos apresentaram atividade antioxidante, no entanto, os extratos de própolis a 70 e 80% de etanol apresentaram a maior atividade antioxidante, seguido pelos extratos etanólicos nas concentrações de 90, 60, 50 e 40%, respectivamente. Os extratos que apresentaram menor atividade antioxidante foram o extrato etanólico a 20% e o extrato aquoso. De acordo com a literatura, a atividade antioxidante dos extratos etanólicos e aquoso de própolis é conferida aos flavonóides [10, 20, 21].

3.4 – Inibição da atividade de hialuronidase

O efeito dos extratos etanólicos e aquoso de própolis sobre a inibição da atividade enzimática e hialuronidase foi verificado e os resultados estão apresentados na Figura 7. Foi constatado que o extrato etanólico de própolis a 80% apresentou maior inibição da atividade enzimática quando comparado com os demais extratos. Essa inibição na atividade foi decrescendo a medida que a concentração etanólica do solvente extrator foi diminuindo. No extrato etanólico de própolis a 10% e no extrato aquoso não foi observado inibição da hialuronidase. Alguns autores descreveram que a atividade da hialuronidase está relacionada com o processo inflamatório nos tecidos animais [15]. Dessa forma, a inibição dessa enzima caracteriza uma atividade antiinflamatória dos extratos de própolis.

FIGURA 6. Atividade antioxidante dos extratos etanólicos e aquoso de própolis. A mistura de reação contém 50 m l dos respectivos extratos de própolis, exceto no controle e água e etanol nas diferentes concentrações foi utilizado controle.

FIGURA 7.
Inibição da atividade de hialuronidase pelos extratos etanólicos e aquoso de própolis.

4 — CONCLUSÃO

Verificamos através dos resultados obtidos que existe grande variação na concentração de flavonóides entre extratos dependendo da concentração etanólica utilizada para extração e esse fato, está intimamente relacionado com a sua atividade biológica. Observamos que o extrato etanólico a 80% foi a que apresentou os melhores resultados em todos os testes realizados o que nos leva a concluir que é a melhor concentração para a preparação dos extratos.

5 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

² Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos (UNICAMP), 13081-970, Caixa Postal 6177, Campinas, SP.

³ CONAP, Cooperativa Nacional de Apicultura, Belo Horizonte, MG.

^* A quem a correspondência deve ser endereçada.

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Recebido para publicação em 26/02/98. Aceito para publicação em 04/09/98.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  20 Maio 1999
• Data do Fascículo
  Ago 1998

Histórico

• Recebido
  26 Fev 1998
• Aceito
  04 Set 1998